Download CONSTRUCCION DE UN VECTOR PARA LA EXPRESION

CONSTRUCCIÓN DE UN VECTOR PARA LA EXPRESIÓN DE UN TRANSCRITO
HÍBRIDO GUS-AGP18 EN Arabidopsis thaliana
Vargas-Hernández M(1).; Demesa-Arévalo(2) E.; Dr. Vielle-Calzada J.-P(3).
(1)
Facultad Química, Universidad Autónoma de Querétaro
(2) (3)
Depto. Genética, Laboratorio de Desarrollo Reproductivo y Apomixis
Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN
RESUMEN
El gametofito femenino es una estructura interna del óvulo de las plantas importante para
la reproducción, un gen que esta involucrado para su desarrollo normal es el que codifica para
AGP18. Estudios preliminares de la localización del mRNA de este gen indican que podría
transportarse célula-célula vía simplástica, para corroborar esta hipótesis se diseñó una
construcción que produzca un transcrito el gen de AGP18 fusionado al del gen reportero uidA
(GUS).
INTRODUCCIÓN
El gametofito femenino es una estructura necesaria para la reproducción sexual de la
planta, este se desarrolla dentro del óvulo y al fecundarse por el grano de polen da lugar a la
formación de la semilla (Skinner et al., 2004).
El desarrollo del gametofito femenino comprende dos fases:
MEGASPOROGENESIS (diploide): Se inicia con la diferenciación de una célula que da lugar a
la madre de las megásporas (CMM), la cual se divide por meiosis formando una tétrada de
megásporas haploides y una sobrevive convirtiéndose en la megáspora funcional.
MEGAGAMETOGENESIS(haploide): En la gametogénesis tipo Polygonum la megáspora
funcional se agranda y su núcleo se divide tres veces sin citocinesis resultando un gametofito
octanucleado; la celularización produce tres antípodas en el polo proximal, una ovocélula y dos
sinérgidas en el polo distal y una célula central binucleada (Yadegari and Drews, 2004).
AGP18 es un proteoglicano de superficie y altamente glicosilada, se expresa en las células
que espacial y temporalmente definen la transición esporofítica-gametofítica en etapas tempranas
del desarrollo del óvulo y durante el desarrollo temprano de la semilla. Un análisis citológico de
las lineas defectivas AGP18-RNAi mostró que la megáspora funcional se detiene y no
experimenta divisiones mitóticas ni elongación celular indicando que AGP18 es escencial para el
inicio de la gametogenesis femenina en Arabidopsis thaliana Fig.I A) Y B)(Acosta-Garcia and
Vielle-Calzada, 2004).
Se cree que AGP18 pude transcribirse y translocarse de una célula a otra célula adyacente y
este movimiento intercelular puede ser llevado acabo via simplástica, a través de los
plasmodesmos (PD), un mecanismo de comunicación descrito para algunas proteínas y mRNAs
(Kim, 2005; Kim et al., 2005).
Un análisis de la hibridación in situ del mensajero, que nos indican en donde se localiza,
muestran que el mRNA de AGP18 esta asociado al desarrollo del gametofito femenino, mientras
que el análisis de actividad del promotor, donde se transcribe, parece indicar que su expresión es
activa en células nucelares aledañas, no gametofíticas Fig I C) Y D) (Acosta-Garcia and VielleCalzada, 2004).
1
A
Sy
F
CH
CC
Ca
B
F
MD
MFD
C
D
CH
CC
F
FIGURA I. A) Óvulo de Arabidopsis thaliana wild-type se muestran todas las estructuras del gametofito, F,
Funículo; CA, Células antípodas; Sy, sinérgidas; CH, Célula huevo; CC, Célula central. B) Mutante de AGP-18 se
muestra que el gametofito esta en una fase arrestada, por lo tanto solo se observa una célula. MD, Megasporas
degeneradas; MFD, Megaspora Funcional Detenida. C) Localización del mRNA-AGP18 en las sinérgidas. D)
Localización de la actividad de expresión del promotor de AGP18 unido al gen reportero GUS.
MATERIALES Y MÉTODOS
I. Clonación del cDNA de AGP18
Para esto se realizó la extracción del RNA, los inflorescencias de A. thaliana se
homogenizaron en Nitrógeno liquido, se adicionó 1ml del reactivo Trizol® (Invitrogen Cat no.
15596-018) seguido de una extracción con 200µl de cloroformo y precipitación con 500µl de
isopropanol absoluto, se lavó la pastilla con 700µl etanol al 75%; posteriormente se midió la
concentración de ácidos nucleicos utilizando un espectrofotómetro Nanodrop® y se obtuvo M1=
(536 ng/ µL), M2= (563 ng/ µL), y para verificar la calidad del RNA se corrió una electroforesis
en gel de agarosa al 1% y teñidos con bromuro de etidio. Posteriormente se amplificó el gen de
AGP18 por medio de un RT-PCR en dos pasos: 1) Para la síntesis de la primer cadena de cDNA
se emplean 5µg de RNA. Se utilizaron 9µl de RNA Muestra 1 o 2, 1.5µl de Buffer10x, 2.5µl de
DNAsa (1U/µl) y H2O tratada con DEPC hasta un volumen de 15µl, incubado 1h a 37ºC en un
Termociclador MJ Research PTC 200, después se adicionó 1.5 µl de EDTA 25mM y se inactivó
la reacción en Termociclador a 65ºC por 10 min; posteriormente se agregaron 2µl de dNTPs
10µM; 2µl de Oligo dT 70µM; se incuba en termociclador 10min a 65ºC y se adicionaron los
siguientes reactivos 6µl de Buffer 5x, 1µl DTT 0.1M, 1µl RNaseOUT 40U/µl, 1µl Transcriptasa
Reversa (TR) 200U/µl, H2O DEPC 0.5 µl la síntesis del cDNA fue en el Termociclador a 42ºC
por 2h. 2) Por PCR se amplificó el cDNA de AGP18, empleando la siguiente reacción, 2µl
cDNA, 1.5µl de Buffer 10x, 1.5µl dNTPs 10µM, Primer AGP18 sentido: 5’GATCCAAATTTTAACAAAATT-3’ y antisentido: 5’-gagctcCATCACTGACAGATATGAATT-3’, 0.15µl de Taq
pol. 5U/µl , 0.6µl de MgCl2 50mM y H2O DEPC hasta un volumen final de 15µl, como control
positivo se utilizaron los primers de alfa−actina primer sentido: 5’-TCCCTCAGCACATTCCAGCAG-3’ y
antisentido: 5’-AACGATTCCTGGACCTGCCTC-3’ y DNA genómico. Se analizó el fragmento por medio
de electroforesis en agarosa al 1%. En cDNA amplificado (819 pb) se purificó por columnas
“QiAquick® Gel Extraction Kit” (QUIAGEN). Se hizo otra electroforesis en gel de agarosa al
1%, para analizar si realmente se purifico la banda correctamente.
II. Clonación del gen uidA de pBI101
El fragmento de gen uidA (GUS) se amplificó a partir del vector pBI101 en un PCR las
concentraciones se ajustaron para 15 µl, el templado fue el Vector PBI101, y los oligos utilizados
fueron: sentido de el gen GUS: 5’-CCCGGGTGGTCAGTCCCTTATGTTA-3’ y el antisentido 5’GCGATCCATAATTTTGTTAAAATTTGGATCtctagaTCATTGTTTGCCTCCCTGCTG-3’. Para analizar la muestra
se realiza una electroforesis en gel de agarosa al 1%, se purifico el fragmento de 1808pb por
medio del método antes mencionado y se analizo en otra electroforesis el producto purificado.
2
III. Single-Joining para construir el transcrito hibrido.
Para unir los fragmentos de los genes de AGP18 y GUS se hizo un PCR (Yu et al., 2004)
adaptado a las siguientes concentraciones: 2µl de cDNA de AGP18, 4µl de DNA de GUS, 2µl
de Buffer 10x, 2µl de dNTPs 10µM, 0.2µl de Taq pol. 5U/µl, 0.8µl de MgCl2 50mM y agua
para llevar a un volumen de 20µl: después se amplificaron los fragmentos híbridos por medio de
un PCR utilizando como templado el producto del PCR anterior y ajustado a 30µl se utilizo el
primer sentido del gen GUS y antisentido del gen AGP18, para verificar que realmente se
unieron los fragmentos se lleva a cabo otra electroforesis y se purifica la banda de 2,627pb y la
purificaron se analizo por una electroforesis.
IV. Clonación en TOPO 2.1
Para la clonación del transcrito fusionado GUS-AGP18 en el vector pCR 2.1-TOPO
(Invitrogen), se adicionaron 6µl del producto de PCR de la fusión GUS-AGP18, y 1µl de el
vector topo 2.1 y se puso a incubar 30min a temperatura ambiente; después los 6µl del plásmido
se mezclaron con 25µl de E. coli TOP10 electrocompetentes en una celda de electroporación (E.
coli pulser BIO-RAD Cat. no 165-2086) dando un pulso (2000V, 25 µF y 200 Ω en celdas de 2
mm) en un Xcell Gene Pulser, después agregamos 250µl de medio SOC (Invitrogen Cat. No
15544-034) se trasfirió a un tubo con 694µl de medio LB dejamos incubar a 37ºC por 1h y se
siembran 100µl de la muestra en una placa Petri con LB-agar con Kanamicina (50 µg/ml) y XGal (40 mg/ml, 40 µl por placa) el resto del medio LB se centrifuga, se descartan 800µl del
sobrenadante y el resto se sembró en otra placa, las dos cajas se llevaron a la incubadora Lab-line
toda la noche a 37ºC. Una vez que han crecido las colonias se examinan y se escogen las blancas
para sembrar en otra caja además se hace un PCR de colonias que se ajusta a 10 µl y se utilizaron
los primers usados en el single-joining del transcrito hibrido, así como los empleados para el
cDNA de AGP18 en las condiciones anteriormente descritas.
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
El aislamiento de RNA fue tubo una concentración de M1= (536 ng/ µL), M2= (563 ng/
µL), lo que nos permitió realizar el RT-PCR del gen AGP18, después cuando se analizó el
producto del RT-PCR y se muestra una banda de 819pb (Figura IIA). Para la amplificación del
gen GUS, después del PCR, el análisis en el gel de electroforesis muestra una banda de 1808pb
que es la banda que corresponde al gen, y cuando se purificó muestra buena eficiencia ( figura
II.b)
Ya tenidas las bandas se fusionaron y el análisis mostró una banda de 2 627pb (Figura IIc)
La hibridación y PCR para fusionar los transcritos, requieren que los amplicones de los
genes GUS y AGP18 tengan secuencias complementarias que les permitan servir como
“iniciadores” de replicación para la polimerasa, estas construcciones son una forma innovadora y
eficaz que ahorra los pasos de unión a un vector, replicación y purificación. Sin embargo es
indispensable estandarizar los PCRs para favorecer la especificidad en la amplificación del
transcrito final deseado, en este caso las temperaturas a las que se llevo acabo la reacción fueron
60, 61, 64C y la que mostró menor numero de bandas inespecíficas fue la de 60C. Después de
haber clonado el vector en E. coli se analizaron las colonias transformadas por PCR, algunas
podrían contener el inserto: e, f, g, h, j y 9. Una vez confirmada alguna colonia se clonará a otro
vector con un promotor adecuado y transformará Agrobacterium tumefaciens.
3
100b 1
DL
2
GUS
5090
1Kb
DL
AGP18-GUS
100b
AGP18 DL
1Kb
DL
AGP18
-GUS
1Kb
DL
a
b
c
d
e
f
g
h
i
j
9
C-
C+
100b
DL
3054
2036
1636
800
600
1018
400
200
100
517
396
344
296
2000
3054
1500
2036
1636
900
800
600
400
300
517
396
296
200
100
517
396
100
B
900
1018
600
500
400
300
200
A
2000
1500
3054
2036
1636
1018
C
D
E
FIGURA II. De la A-D se muestran las electroforesis al 1% de agarosa. A) Se muestra el mRNA que se extrajo de
las inflorescencias para amplificar AGP18. B) Se observan purificados el gen de GUS (1808pb) y AGP18 (819pb).
C) Se puede observar la banda de la hibridación de los genes GUS y AGP18 (2627pb). D) Muestra el fragmento
hibrido GUS-AGP18 purificado. E) El gel muestra colonias que dieron positivo a la inserción de la construcción del
fragmento GUS-AGP18, usando los primers para amplificar el gen AGP18 (819pb), las bandas se indican con una
flecha.
CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
El transporte del mRNA de AGP18 entre las células es un mecanismo que aun no se
conoce, se ha visto que la actividad del promotor esta en la calaza, además también la
localización por técnicas de hibridación in situ muestran que el transcrito esta presente en las
sinérgidas, lo que nos hace pensar que pueden existir mecanismos complejos por los cuales se
puede trasportar y traducir el mRNA. Los patrones que se esperaría observaren el ovulo son:
Primero que tanto la transcripción y el mRNA de AGP18 tengan la misma localización
por lo tanto se concluiría que el transcrito no se mueve o necesita de otro elemento necesario para
el transporte.
Por otro lado se puede observar un patrón de difusión, es decir que se encuentre el mRNA
tanto en el lugar donde se transcribe y el lugar a donde se dirige.
Otro comportamiento podría ser que el mRNA solo se encuentre en el lugar de destino en
cuyo caso se concluiría que hay un elemento que determina la traducción, este podría ser un
factor de reconocimiento o alguna proteína, como sucede en otros casos en los que la proteína
esta implicada en el movimiento de su mRNA (Kim et al., 2005).
Además se sabe que es un mecanismo que permite el silenciamiento de algunos genes
como los ssRNA, por ello la importancia del estudio de el movimiento tanto de proteínas como
de los mRNAs. Una perspectiva que quedan por cumplir es encontrar un promotor adecuado para
el hibrido GUS-AGP18 que permita el análisis.
REFERENCIAS
Acosta-Garcia, G., and Vielle-Calzada, J.P. (2004). A classical arabinogalactan protein is essential for the
initiation of female gametogenesis in Arabidopsis. Plant Cell 16, 2614-2628.
Kim, J.Y. (2005). Regulation of short-distance transport of RNA and protein. Curr Opin Plant Biol 8, 45-52.
Kim, J.Y., Rim, Y., Wang, J., and Jackson, D. (2005). A novel cell-to-cell trafficking assay indicates that the
KNOX homeodomain is necessary and sufficient for intercellular protein and mRNA trafficking. Genes
Dev 19, 788-793.
Skinner, D.J., Hill, T.A., and Gasser, C.S. (2004). Regulation of ovule development. Plant Cell 16 Suppl, S32-45.
Yadegari, R., and Drews, G.N. (2004). Female gametophyte development. Plant Cell 16 Suppl, S133-141.
Yu, J.H., Hamari, Z., Han, K.H., Seo, J.A., Reyes-Dominguez, Y., and Scazzocchio, C. (2004). Double-joint
PCR: a PCR-based molecular tool for gene manipulations in filamentous fungi. Fungal Genet Biol 41, 973981.
A
C
4
5