Download Protocolo utilizado para la digestión de proteínas en gel

Digestión en gel
Primer dia:
Material a utilizar:
HCO3NH4 50mM* (200 mg / 50ml)
HCO3NH4 25mM , ACN 50%.
H2O (miliQ) - ACN calidad HPLC.
DTT 10mM (stock 1M) en HCO3NH4 50mM
Iodoacetamida (IAA) 55mM en HCO3NH4 50mM* (10 mg / ml)
Tripsina (Promega Sequencing Grade Modified Trypsin)10X (100ng/µl en
ácido acético 50mM), descongelar en el momento.
*preparar en el momento a partir de polvo.
Destinción de muestras con plata: (solo bandas Ag)
Mezclar 1:1, 30mM Ferricianuro de Potasio ( K3Fe(CN)6 ) : 100mM
Tiosulfato de Sodio (Na2S2O3)
1) Lavar con 100 µl de H2O MQ.
2) Lavar con 100 µl de solución ferrocianuro: tiosulfato. Dejar bandas
en solución (5-10 min) hasta que las bandas se destiñen.
3) Remover sobrenadante.
A- Lavado de las bandas:(todo tipo de teñido)
1) Lavar con H20 miliQ
2) Lavar con HCO3NH4 50mM
3) Lavar con HCO3NH4 25mM , ACN 50%.
4) Repetir paso 3 hasta que desaparezca el color azul
5) Agregar ACN 100%, descartar y dejar secar en la mesada 5
minutos
B- Reducción y alquilación:
1) Adicionar 50µl de DTT 10 mM en HCO3NH4 50 mM. Incubar 30
min a 56-60ºC. descartar (spin para sacar el condensado).
2) 35 µl de Iodoacetamida 55 mM en HCO3NH4 50 mM. Incubar 30
min en oscuridad a T amb y descartar.
3) Lavar con 100µl HCO3NH4 50mM.
4) Lavar con HCO3NH4 25mM , ACN 50%.
5) 100 µl de acetonitrilo descartar y dejar secar al aire.
C- Digestión tríptica en GEL:
1) Tomar 3 eppendorf de tripsina 10X (100ng/µl diluida en ácido
acético 10mM) del freezer de -80ºC. Pretratar 15 min a 30ºC y
luego diluir 1:10 con HCO3NH4 50mM
2) Adicionar aproximadamente 12 µl de tripsina 1X a cada taquito,
según su tamaño (que queden cubiertos los pedazos de gel) y
dejar hidratando 10 min, 4°C (en hielo).
3) Continuar agregando alícuotas de 2-5 µl, en caso de ser
necesario, si no se hidrataron todos los pedazos de gel
4) Agregar 10µl de bicarbonato de amonio 25mM
5) Dejar incubando ON a 37ºC
Segundo día:
Material a utilizar:
ACN 50% / TFA 0.5%.
D- Extracción de péptidos:
1) Sonicar 5 min
2) Extraer el exceso de liquido del digesto de la noche anterior;
spin y depositarlo en un tubo limpio que contiene 5 ul de ACN
50%/TFA 0.5% (extracto a).
3) 10-15µl de ACN 50%/TFA 0,5%.
4) Mezclar, vortexear 10min
5) Sonicar 5 min
6) Spin, extraer el exceso (extracto b) y depositar sobre el
extracto a.
7) Repetir 3-5
8) Extraer el exceso (extracto c) y depositar sobre el extracto
a+b.
9) Concentrar a seco 20-30 min en speed vac.
10) Resuspender en 5µl ACN 50% / TFA 0.5%.
11) Mezclar 1:1 (2 µl + 2 µl ) con matriz 3 mg/ml HCCA (Acido
Hidroxicinnamico) en ACN 50% / TFA 0.5% en la tapita del
tubo o en parafilm
12) Sembrar en placa MTP Anchor Chip para el equipo Ultraflex II
Bruker Daltonics (0.5µl por spot, en 2 spots).
Referencias
1. Shevchenko A, Tomas H, Vorm O, Havlis J, Olsen JV, Mann M, In-gel digestion for mass
spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat. Protoc. 2006, 1, 2856-2860.