Download fragmentos de adn genomico de la secuencia

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
11 Número de publicación: 2 238 677
51 Int. Cl. : C12N 15/12, A01K 67/027
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C12Q 1/68, C12N 15/62
C12Q 1/66, C12N 15/63
C07K 14/705
ESPAÑA
12
TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA
T3
86 Número de solicitud europea: 95402822 .1
86 Fecha de presentación: 14.12.1995
87 Número de publicación de la solicitud: 0717105
87 Fecha de publicación de la solicitud: 19.06.1996
54 Título: Fragmentos de ADN genómico de la secuencia reguladora de la subunidad β2 del receptor nicotínico
neuronal de la acetilcolina; animales transgénicos que lo contienen.
30 Prioridad: 14.12.1994 US 358627
73 Titular/es: INSTITUT PASTEUR
25-28, rue du Docteur Roux
75724 Paris Cédex 15, FR
45 Fecha de publicación de la mención BOPI:
01.09.2005
72 Inventor/es: Changeux, Jean-Pierre;
Picciotto, Marina y
Bessis, Alain
45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:
74 Agente: Ruo, Alessandro
ES 2 238 677 T3
01.09.2005
Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de
la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea
de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se
considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del
Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
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DESCRIPCIÓN
Fragmentos de ADN genómico de la secuencia reguladora de la subunidad β2 del receptor nicotínico neuronal de
la acetilcolina; animales transgénicos que lo contienen.
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Antecedentes de la invención
Campo de la invención
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Esta invención trata de fragmentos de ADN genómico que contienen secuencias reguladoras para la subunidad β2
del RnAC neuronal y de animales transgénicos creados usando estos fragmentos o fragmentos mutados. Las secuencias flanqueantes 5’ contienen un promotor, que confiere una expresión específica neuronal. Los clones genómicos
muestran la importancia del gen de la subunidad β2 en el sistema nicotínico y en la respuesta farmacológica a la
nicotina. La invención también trata de vectores que contienen las secuencias de ADN, de células transformadas con
los vectores, de animales transgénicos portadores de las secuencias y de líneas celulares derivadas de estos animales
transgénicos. Además, la invención describe los usos de todo lo anterior.
Las referencias mencionadas en esta memoria descriptiva aparecen al final ordenadas por autor y año de publicación o por número de cita.
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Expresión específica neuronal. Muchos procedimientos basados en ADN recombinante requieren una expresión
específica tisular. Los efectos secundarios no deseados o potencialmente dañinos de las terapias y procedimientos
de transferencia de genes pueden reducirse mediante una correcta expresión específica tisular. Adicionalmente, la
capacidad de dirigir la expresión de ciertas proteínas a un tipo celular individual fomenta la capacidad de los científicos
de cartografiar, identificar o purificar estas células para importantes fines terapéuticos o analíticos. Cuando las células
de interés son neuronas o un subconjunto particular de neuronas, existe una necesidad de secuencias de ADN que
confieran una expresión específica neuronal o específica del subconjunto.
Las proteínas expresadas por todo un organismo son a menudo utilizadas con fines específicos por las neuronas.
Mediante la expresión de una subunidad o componente particular de estas proteínas únicamente en el tejido neuronal,
la neurona confecciona la actividad proteica para sus fines. Averiguar qué subunidades o componentes específicos
neuronales en particular y desentrañar por qué se producen únicamente en tejido neuronal es la clave de los elementos
del ADN que confieren la expresión específica neuronal.
El conocimiento de los inventores de la biología de los receptores de la acetilcolina proporcionó una base importante para esta invención (véase Changeux, The New Biologist, vol. 3, nº 5, págs. 413-429). En diferentes tejidos se
encuentran diferentes tipos de receptores de la acetilcolina, y responden ante agonistas diferentes. Un tipo, el receptor
nicotínico de la acetilcolina (RnAC), responde a la nicotina. Un subgrupo de este tipo se encuentra únicamente en
neuronas, y se denomina RnAC neuronal.
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Generalmente, el complejo del receptor de la acetilcolina está formado por cinco subunidades. El tipo de subunidades del receptor determina la especificidad ante los agonistas. Es el patrón de expresión de estas subunidades
quien controla la localización de los tipos de receptor, en particular de acetilcolina, en ciertos grupos celulares. Los
mecanismos genéticos implicados en la adquisición de estos patrones específicos de expresión podrían dar lugar a una
capacidad para controlar la especificidad tisular, o incluso a una expresión celular específica de grupo más definida.
El trabajo de los inventores indica que los elementos definidos en la secuencia promotora confieren una expresión
específica neuronal para la subunidad β2.
Efectos farmacológicos de la nicotina. Como se mencionó anteriormente, el RnAC responde al agonista nicotina.
La nicotina se ha implicado en muchos aspectos del comportamiento, incluyendo el aprendizaje y la memoria (1,2).
Los efectos farmacológicos y conductistas de la nicotina implican a los RnAC neuronales. Los estudios que usan bajas
dosis de nicotina (23) o agonistas nicotínicos (16) sugieren que los RnAC de alta afinidad del cerebro median en los
efectos de la nicotina sobre el comportamiento de evitación pasivo. Los sistemas modelo en los que el RnAC neuronal
había sido alterado pueden por tanto proporcionar una información útil sobre los efectos farmacológicos de la nicotina,
el papel del RnAC neuronal en los procesos cognitivos, la adicción a la nicotina y las demencias que implican carencias
en el sistema nicotínico.
Los RnAC neuronales funcionales son complejos proteicos pentaméricos que contienen al menos un tipo de subunidad α y un tipo de subunidad β (3-5) (aunque la subunidad α7 puede formar homooligómeros funcionales in vitro6,7 ).
La subunidad β2 se eligió para este estudio de entre las 7 subunidades α conocidas y las 3 subunidades β conocidas (3)
debido a su amplia expresión en el cerebro (8-10), y a la ausencia de expresión de otras subunidades β en la mayoría
de las regiones cerebrales (10). La mutación de esta subunidad debería por tanto dar como resultado una carencia
significativa en el sistema nicotínico del SNC. Los inventores han examinado la implicación de la subunidad β2 en
la farmacología y el comportamiento. Se usó la asignación de genes objetivo para mutar la subunidad β2 en ratones
transgénicos.
Los inventores averiguaron que los sitios de unión de alta afinidad para la nicotina están ausentes en el cerebro
de ratones homocigóticos para la mutación de la subunidad β2, β2-/-. Además, los registros electrofisiológicos de
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secciones cerebrales revelan que las neuronas talámicas de estos ratones no responden a la aplicación de nicotina.
Finalmente, las pruebas de comportamiento muestran que la nicotina ya no aumenta el rendimiento de los ratones
β2-/- en las pruebas de evitación pasiva, una medida del aprendizaje asociativo. Paradójicamente, los ratones mutantes
son capaces de rendir mejor que sus hermanos no mutantes en esta tarea.
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Breve resumen de la invención y su utilidad
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En un aspecto de esta invención, describimos un fragmento de ADN de 15 kb portador de regiones reguladoras
y codificantes para la subunidad β2 del RnAC neuronal. Caracterizamos el promotor del gen de la subunidad β2 in
vitro y en ratones transgénicos. Describimos numerosos elementos del ADN, incluyendo una caja E y otras secuencias
consenso de unión a proteínas implicadas en la regulación positiva de este gen. Además, demostramos que la transcripción específica celular del promotor de la subunidad β2 implica, al menos, dos elementos reguladores negativos,
incluyendo uno localizado en la secuencia transcrita.
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Las formas de realización preferibles de estos aspectos tratan de secuencias promotoras específicas y de su uso para
dirigir la expresión específica neuronal en diversas células y organismos. Una secuencia de 1163 pb y una secuencia de
862 pb confieren, ambas, una expresión específica neuronal. Otras formas de realización incluyen la secuencia -245 a
-95 de la Figura 1, que contiene un elemento activador esencial, y la secuencia -245 a -824 de la Figura 1, que contiene
un represor. En la región transcrita también hay presente un elemento represor formado por la secuencia NRSE/RE1.
Asimismo se describen ciertos plásmidos que comprenden estas secuencias genómicas.
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La secuencias promotoras son importantes por su capacidad para dirigir la expresión de la proteína, el polipéptido
o el péptido en ciertas células definidas. Por ejemplo, en los ratones transgénicos, según se muestra a continuación,
las proteínas que codifican toxinas o similares pueden ser dirigidas a neuronas para imitar la degradación de aquellas
células en estados patológicos. Otras serán evidentes a partir de los datos descritos a continuación.
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Alternativamente, los promotores pueden dirigir factores de crecimiento codificados o proteínas oncogénicas, carcinogénicas o inmortalizantes a ciertas neuronas para imitar la carcinogenia. Estas células pueden entonces aislarse y
cultivarse en un cultivo. En otro uso, las secuencias promotoras pueden unirse operativamente a secuencias indicadoras
con objeto de identificar neuronas específicas in situ o aislar neuronas mediante técnicas de clasificación celular. Las
neuronas aisladas y purificadas pueden usarse entonces para análisis bioquímicos o genéticos in vitro. La secuencias
indicadoras, tales como LacZ y Luciferasa, se describen a continuación.
Los inventores proporcionan los clones genómicos de la subunidad β2 del RnAC neuronal de ratón. Estos clones
son útiles en el análisis del sistema nicotínico de los mamíferos y de la farmacología de la nicotina. Los inventores
describen ensayos que usan ratones transgénicos en los que se han usado los clones genómicos de la subunidad β2
para anular la unión de alta afinidad de la nicotina.
Además de los mutantes por deleción descritos, las mutaciones incorporadas en los exones o en las secuencias
reguladoras de la subunidad β2 darán como resultado animales transgénicos mutantes útiles. Estas mutaciones pueden
ser mutaciones puntuales, deleciones o inserciones, que darán como resultado una actividad no eficaz del RnAC o
incluso un receptor no activo. Con dichos animales mutantes, los procedimientos para determinar la capacidad de un
compuesto de restaurar o modular la actividad o función del RnAC son posibles y pueden ser diseñados. La modulación de la función puede proporcionarse mediante el número o la actividad de receptores de regulación por incremento
o regulación por disminución, u otros mecanismos compensatorios. También pueden diseñarse con los mutantes animales procedimientos para determinar la capacidad de un compuesto de restaurar o modular el comportamiento natural
en los ensayos de comportamiento descritos o conocidos (véase 17, 22, 18, 2, 19, 21, 23, 24). Los ensayos de comportamiento comprenden, pero no se limitan a, pruebas de memoria, aprendizaje, ansiedad, actividad locomotora y
atención, en comparación con el animal o paciente no tratado. Los ensayos farmacológicos (véase 12, 13, 14, 15, 20)
para seleccionar compuestos que restauran o modulan la actividad o el comportamiento relacionados con el RnAC
pueden ejecutarse por tanto con los animales mutantes proporcionados por esta invención. La dosis y la cantidad de
los posibles agentes terapéuticos se determinarán mediante técnicas establecidas. (Véase, por ejemplo, la referencia
16).
Los presentes sistemas modelo, que comprenden animales transgénicos o células derivadas de estos animales,
pueden usarse para analizar el papel de la nicotina sobre el aprendizaje y el comportamiento, la farmacología de la nicotina, la adicción a la nicotina y estados patológicos que implican carencias en el sistema nicotinico. Además, pueden
probarse terapias potenciales para la adicción a nicotina o carencias en el sistema nicotinico con los animales transgénicos o las células y las líneas celulares derivadas de ellos, o cualquier línea celular transfectada con un fragmento
de ADN o del ADN completo del fago β2 (número de acceso CNCM I-1503). Estas líneas celulares incluirían todas
aquellas obtenidas directamente de animales transgénicos homocigóticos o heterocigóticos que portan o tienen mutadas las secuencias de la subunidad β2. Además, esto incluiría líneas celulares creadas en un cultivo usando secuencias
de la subunidad β2 natural o secuencias de la subunidad β2 mutada. Las técnicas usadas podrían ser, por ejemplo,
aquellas mencionadas en el documento PCT WO 90/11354.
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Las demencias, tales como la enfermedad de Alzheimer, en las que los sitios de unión de alta afinidad de la
nicotina están disminuidos, sugieren que el presente modelo puede usarse para identificar fármacos para compensar
esta carencia. Consecuentemente, pueden diseñarse procedimientos para identificar compuestos con capacidad de
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restaurar o efectuar de forma detectable una actividad sobre el receptor nicotinico neuronal de la acetilcolina que
comprenden la adición del compuesto a una línea celular apropiada o la introducción del compuesto en un animal
transgénico. En estos procedimientos pueden usarse los animales transgénicos y las líneas celulares generadas a partir
de esta invención. Dichos sistemas animales o de líneas celulares también pueden usarse para seleccionar compuestos
que podrían ser capaces de restaurar o modular la actividad del gen β2.
Los animales transgénicos obtenidos con la secuencia del gen de la subunidad β2 (fragmentos naturales o mutados
de la misma) puedan usarse para generar animales transgénicos dobles. Para este fin, el animal transgénico para la
subunidad β2 puede cruzarse con otros animales transgénicos de la misma especie o con animales mutantes naturales
de la misma especie. El animal transgénico doble resultante, o las células derivadas del mismo, pueden usarse en las
mismas aplicaciones que el animal transgénico para la subunidad β2 parental.
Tanto la secuencias promotoras como los clones genómicos pueden usarse para ensayar la presencia o la ausencia
de proteínas reguladoras. Los ensayos con cambio de gel, descritos a continuación, ejemplifican dicho uso. Las secuencias o clones también pueden usarse como sondas mediante la incorporación de marcadores unidos, tales como
radionúclidos, compuestos fluorescentes o proteínas o compuestos de entrecruzamiento, tales como avidina-biotina.
Estas sondas pueden usarse para identificar o ensayar proteínas, ácidos nucleicos u otros compuestos implicados en la
acción neuronal o el sistema receptor de la acetilcolina.
Junto con esta invención pueden usarse los procedimientos conocidos para mutar o modificar secuencias de ácido
nucleico para generar animales mutantes, líneas celulares o secuencias β2 útiles. Dichos procedimientos incluyen,
pero no se limitan a, mutaciones puntuales, mutagénesis dirigida, mutaciones por deleción, mutaciones por inserción,
mutaciones obtenibles a partir de recombinación homóloga y mutaciones obtenibles a partir del tratamiento químico o
por radiación del ADN o células portadoras del ADN. La secuenciación del ADN se usa para determinar la mutación
generada, si se desea o es necesario. Los animales, líneas celulares o secuencias mutantes se usan entonces en la
secuencias de ADN, sistemas, ensayos, procedimientos o procesos descritos por los inventores. El ADN mutado será,
por definición, diferente o no idéntico al ADN genómico. Los animales mutantes también se crean mediante el cruce
de un primer animal transgénico que contiene las secuencias aquí descritas o disponibles mediante esta invención, con
un segundo animal. El segundo animal puede contener un ADN que difiera del ADN contenido en el primer animal.
De este modo pueden crearse diversas líneas de animales mutantes.
Adicionalmente, están disponibles las técnicas de ADN recombinante para mutar las secuencias de ADN aquí
descritas, como anteriormente, unir estas secuencias de ADN a vectores de expresión y expresar la proteína o el
mutante de la subunidad β2 derivados de la secuencia de la subunidad β2. La subunidad o el mutante β2 puede por
tanto analizarse para comprobar la actividad bioquímica o conductista. De este modo pueden generarse secuencias de
ADN mutado que impidan la expresión de un RnAC eficiente.
Alternativamente, la secuencias promotoras descritas pueden usarse en vectores o sistemas de expresión para conducir la expresión de otras proteínas. La secuencia de ADN obtenible puede por tanto unirse a las secuencias promotora
o reguladora descritas por los inventores con objeto de transcribir aquellas secuencias de ADN o producir proteínas,
polipéptidos o péptidos codificados por aquellas secuencias de ADN.
Descripción de la técnica relacionada
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Estudios previos mediante hibridación in situ (Wada y col., 1989; Hill y col., 1993; Zoli y col., 1994) e inmunohistoquímica (Hill y col., 1993) muestran que todas las subunidades del RnAC neuronal clonadas hasta la fecha muestran
una estricta distribución específica neuronal. Pero diferentes subunidades muestran una distribución incluso más estrecha, únicamente en pequeños subconjuntos de neuronas en el cerebro. Por ejemplo, los transcritos de la subunidad
α2 del RnAC sólo se detectan en el núcleo spinformis lateralis del diencéfalo del pollo (Daubas y col., 1990) o en el
nucleus interpeduncularis de la rata (Wada y col., 1988). También, los transcritos de las subunidades β3, β4 y α3 sólo
se detectan en un pequeño conjunto de estructuras en el cerebro de vertebrados (referencias en Zoli y col., 1994).
Los transcritos del gen de la subunidad α4, α5, α7 y β2 del RnAC, en comparación, muestran una distribución
mucho más amplia. (Wada y col., 1989; referencias en Zoli y col., 1994). Por ejemplo, los transcritos de la subunidad
β2 se encuentran en la mayoría de las neuronas del SNC y en todas las neuronas periféricas que expresan el RnAC
(Role, 1992: Hill y col., 1993).
Como consecuencia de la expresión diferencial de estas subunidades se produce una amplia diversidad de especies
del RnAC en vertebrados. Cada especie tiene un patrón de expresión definido que implica diversas categorías o grupos
de neuronas. Por ejemplo, las neuronas de la habenula media se interconectan con las del nucleus interpeduncularis y
aún así cada una expresa distintos conjuntos de subunidades del RnAC (véase Role, 1992, como reseña) que muestran
diferentes perfiles fisiológicos y farmacológicos (Mulle y col., 1991).
Hasta la fecha sólo hay una limitada información disponible sobre los mecanismos genéticos que explican la
regulación de la transcripción del gen del RnAC en neuronas. El trabajo anterior sobre el promotor del gen de la
subunidad α7 del pollo analizado in vitro no logró caracterizar los elementos del ADN responsables de la regulación
de la transcripción (Matter-Sadzinski y col., 1992). En otro estudio se caracterizó parcialmente el promotor del gen de
la subunidad α2, y se describió y secuenció un silenciador (Bessis y col., 1993, véase también Daubas y col., 1993).
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Verificamos que ciertas evidencias conducen al estudio de la subunidad β2 en particular. Se expresa en la mayoría
de las neuronas del cerebro (Hill y col., 1993). También, el ritmo de aparición de los transcritos β2 va en estrecho
paralelismo con el de la diferenciación neuronal (Zoli y col., 1994). Decidimos por tanto estudiar los mecanismos
genéticos que regulan su transcripción.
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Breve descripción de la invención
Estructura del gen
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Hemos clonado un fragmento genómico que contiene las secuencias reguladoras y las secuencias que codifican el
gen de la subunidad β2 del RnAC de ratón. Los inventores han averiguado que al menos parte de la región reguladora
está conservada entre diferentes especies de mamíferos. Particularmente, la región entre los pb +16 y +38, correspondiente al NRSE/RE1, según se describe en la Figura 1. Usando una protección de la RNasa y la amplificación de los
productos del cebador de extensión, encontramos un sitio de inicio de la transcripción principal y tres secundarios (Figura 1). Los experimentos con el cebador de extensión se realizaron usando dos transcriptasas inversas diferentes, con
diferentes Zotes de ARNm y con diferentes cebadores. Estas técnicas basadas en la PCR nos permitieron amplificar y
subclonar los mismos fragmentos correspondientes a sitios de inicio de la transcripción en lugar de sitios de detención
de la transcriptasa inversa. Los sitios de inicio de la transcripción hemos caracterizado están localizados secuencia
abajo de la posición del extremo 5’ del ADNc de β2 más largo de la rata (Deneris y col., 1988) y del hombre (Anand
y Lindstrom, 1990) (véase la Figura 1). Esto implica que, en el hombre y la rata, se usa otro sitio de inicio de la
transcripción. Dicha discrepancia entre especies ya ha sido demostrada para la subunidad ε del RnAC muscular (Dürr
y col., 1994, véase también Dong y col., 1993; Toussaint y col., 1994). Por el contrario, con el gen de la subunidad α2
(Bessis y col., 1993), no pudo detectarse un exón secuencia arriba.
El análisis estructural de una región flanqueante de 1,2 kpb describió muchos motivos consenso para la unión de
la proteína nuclear, incluyendo un sitio Sp1 y una caja E. Se transcriben aproximadamente 90 pb del promotor de
1,2 kb no delecionado, y esta región contiene una secuencia NRSE/RE1 (Kraner y col., 1992; Mori y col., 1992).
Los elementos reguladores ya han sido descritos secuencia abajo del sitio de inicio de la transcripción en diferentes
sistemas, tales como el Poliomavirus (Bourachot y col., 1989) o el gen fos (Lamb y col., 1990).
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La región promotora está localizada entre el sitio Eco47III localizado en el exón 1 (véase la Figura 1) y el sitio
BamHI, de 4,5 kb secuencia arriba. Una forma de realización preferible es la secuencia de 1163 pb descrita en la
Figura 1 entre los sitios EcoRI y Eco47III. La secuencias reguladoras pueden estar localizadas en las 2 kb secuencia
abajo del sitio Eco47III. Pueden usarse los elementos reguladores de las secuencias de la subunidad β2 del RnAC para
dirigir la expresión específica neuronal de una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína, un polipéptido o
un péptido unidos a ellos. Dicha proteína, polipéptido o péptido pueden ser toxinas, factores tróficos, neuropéptidos,
proteínas carcinogénicas, oncogénicas o inmortalizantes, o cualquier otra proteína que pueda cambiar la función de la
neurona.
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Un promotor de 1163 pb consigue la transcripción específica celular
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El promotor de 1163 pb contiene secuencias reguladoras para la transcripción específica tisular y específica temporal del gen de la subunidad β2. Los experimentos de transfección transitoria demostraron que el fragmento de
1163 pb contiene información suficiente para conferir una expresión específica celular al gen de la subunidad β2 del
RnAC. Demostramos que el mismo promotor dirige una estricta transcripción específica celular del gen indicador de la
βgalactosidasa (β-gal). Además, el constructo transgénico parece activarse al mismo ritmo que el gen de la subunidad
β2 endógeno durante el desarrollo del sistema nervioso embrionario temprano (Zoli y col., 1994). En etapas tardías
del desarrollo, la mayoría de las neuronas periféricas que expresan β2 todavía están marcadas (Figura 4C, D).
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La secuencia promotora se probó en ratones transgénicos mediante la generación de dos líneas (13 y 26) que
expresaban el β-gal bajo el control del promotor de la subunidad β2. En el SNC, el patrón de expresión de la β-galactosidasa es diferente entre las dos líneas. Sólo un subconjunto de las células que normalmente expresan el β2 expresan
el transgén. Este tipo de discrepancia entre la expresión del transgén y el gen endógeno ya se ha descrito para el gen
promotor de la dopamina β-hidroxilasa (Mercer y col., 1991; Hoyle y col., 1994) o para el gen GAP-43 (Vanselow
y col., 1994). Se ha observado una inesperada expresión en la línea transgénica 13 de la protuberancia genital y en
músculos cutáneos. Probablemente esta expresión es debida al sitio de integración del transgén, dado que estos tejidos no están teñidos en la línea 26. Para nuestro conocimiento, la mayoría de los promotores neuronales estudiados
mediante transgénesis muestran una expresión ectópica en un cierto pequeño porcentaje de líneas transgénicas (ForssPetter y col., 1990; Kaneda y col., 1991; Banerjee y col., 1992; Hoesche y col., 1993; Logan y col., 1993, Vanselow y
col., 1994). Sin embargo, las técnicas de la materia facilitan la construcción de líneas en las que el patrón de expresión
del transgén refleja estrechamente o duplica el del gen original. Véanse las referencias para detalles adicionales que
demuestran el éxito del procedimiento de transgénesis.
Comparando la distribución celular positiva del β-gal con aquellas de otros marcadores neuronales conocidos,
resulta apreciable que existe una similitud entre la distribución de la acetiltransferasa de la colina, el TrkA (el receptor
de alta afinidad del factor de crecimiento nervioso), y las células que expresan el p75 (el receptor de baja afinidad del
factor de crecimiento nervioso) (Yan y Johnson, 1988: Pioro y Cuello, 1990a, b; Ringstedt y col.,1993). En particular,
en las ratas en desarrollo, el p75 se expresa en prácticamente todos los ganglios periféricos y núcleos centrales (con
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excepción de la zona incerta y los núcleos hipotalámicos), que expresan el transgén (Yan y Johnson, 1988). También es
interesante mencionar que la expresión del p75 (al igual que la expresión del transgén del promotor β2) es transitoria en
muchos ganglios periféricos y núcleos cerebrales, disminuyendo hasta niveles indetectables en las edades perinatales
y postnatales tempranas. Por lo tanto, es posible que el promotor de la subunidad β2 contenga un elemento controlado
mediante la activación del p75 , o que tanto el transgén β2 como el gen p75 estén controlados por un regulador común.
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En conclusión, aunque el promotor parece carecer de algunos elementos reguladores activos en el cerebro, los
elementos reguladores existentes son suficientes para permitir una expresión específica celular y del desarrollo de la
β-galactosidasa en el SNP, en la médula espinal y en numerosas estructuras del cerebro. El promotor también puede
usarse en ensayos para identificar las proteínas reguladoras en tejido neuronal.
Elementos reguladores del ADN
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Para caracterizar adicionalmente los elementos del ADN implicados en la transcripción del gen de la subunidad
β2, delecionamos o mutamos el promotor de 1163 pb y analizamos los constructos resultantes mediante transfección
transitoria. Un elemento represor presente en la región distal del extremo 5’ es activo en fibroblastos pero no en
neuroblastomas. Este elemento explica por tanto, al menos en parte, la expresión específica neuronal del gen de
la subunidad β2. Un análisis adicional del promotor demuestra que la deleción de 589 pb aumenta la actividad en
neuroblastomas, pero no en fibroblastos (Figura 6, comparar 862E y 283E-Luci).
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Hay un elemento NRSE/RE1 localizado en el extremo 3’ del promotor. Ya se ha demostrado que este elemento
restringe la actividad de los promotores en células neuronales (Kraner y col., 1992; Mori y col., 1992; Li y col., 1993).
En el promotor de 1163 pb del gen de la subunidad β2, una mutación puntual de esta secuencia conduce a un aumento
de 100 veces en la actividad transcripcional de los fibroblastos, lo que implica que esta secuencia está implicada en
la expresión específica neuronal del gen de la subunidad β2. Además, la comparación de la secuencia demuestra que
esta secuencia está altamente conservada en los ADNc de la subunidad β2 de la rata y del hombre (Deneris y col.,
1988; Anand y Lindstrom, 1990), así como en numerosos promotores de genes expresados en el sistema nervioso,
tales como el gen del neurofilamento de peso medio, el gen CAM-L1, el gen de la calbinbina o el gen de la proteína
de unión a Ca cerebelosa (véase la Tabla 1B).
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Los experimentos de deleción descritos en la Figura 6 demuestran que hay un elemento activador esencial presente
entre los nucleótidos -245 y -95. En esta región podrían detectarse un sitio de unión Sp1 y una caja E. Los sitios Sp1
son factores ubicuos, mientras que las cajas E se han implicado en numerosos mecanismos reguladores genéticos en
el músculo (véase Bessereau y col., 1994 para la subunidad α1 del RnAC), así como en neuronas (Guillemot y col.,
1993). También se ha informado sobre elementos en díada en algunos promotores neuronales, tales como aquellos del
gen de la tirosina hidroxilasa (Yoon y Chikaraishi, 1994), el gen SCG1O (Mori y col., 1990), el gen GAP43 (Nedivi y
col., 1992), o en la región flanqueantes del gen N-CAM (Chen y col., 1990). Los resultados mostrados en la Tabla 1A
demuestran que en neuroblastomas, el promotor de 1163 pb mutado en la caja E/Díada es significativamente menos
activo que el promotor natural. Además, un ensayo con cambio de gel (Figura 7) muestra adicionalmente que la caja
E/Díada es capaz de unir complejos específicos. Esto sugiere que la caja E/Díada es responsable de al menos parte
de la activación de la transcripción del gen de la subunidad β2. Sin embargo, los experimentos de transactivación de
promotores heterólogos sugieren que la caja E coopera con el sitio Sp1 localizado 27 pb secuencia arriba para activar
positivamente la transcripción. Este tipo de cooperación entre la caja E y el sitio de unión Sp1 ya se ha mostrado para
la regulación de la transcripción de la subunidad α1 del RnAC muscular (Bessereau y col., 1993).
En conclusión, hemos demostrado que el gen de la subunidad β2 está regulado principalmente mediante elementos
que actúan negativamente y mediante un elemento positivo que comprende una caja E. Esta doble regulación parece
ser una característica general compartida por numerosos genes neuronales (Mandel y Mckinnon, 1993) y permite un
ajuste fino de la transcripción de los genes neuronales. Además, nuestros estudios transgénicos demuestran que el promotor de 1163 pb confiere una expresión específica neuronal estrecha, pero carece de algunos elementos reguladores
específicos del desarrollo o del SNC.
Descripción de las figuras
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Figura 1: secuencia de nucleótidos de la región que rodea al ATG iniciador del gen de la subunidad β2.
Las cuatro cabezas de flechas verticales muestran los cuatro extremos encontrados usando RACE-PCR y SLIC,
correspondientes a los sitios de inicio de la transcripción. Las flechas verticales indican la posición correspondiente al
extremo 5’ de los clones del ADNc de la subunidad β2 más largos de rata (r) y de hombre (h) (Deneris y col., 1988).
Los puntos finales de las deleciones usados en los experimentos descritos en la Figura 3 se indican por encima de la
secuencia. Los nucleótidos localizados en el intrón aparecen en minúsculas.
Figura 2: cartografiado del extremo 5’ del ARNm de la subunidad β2.
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A. Experimentos de protección de la RNasa. Se hibridó el ARN total del DBA2 de cerebro de ratón (5 y 15 µg,
carriles 2 y 3 respectivamente) y ARNt de levadura (15 µg, carril 1) con una sonda de ARN marcado con 32 P que
contenía 158 nucleótidos del intrón 1 y 789 nucleótidos de secuencias secuencia arriba (-634/+155). El tamaño de
las bandas protegidas se estimó según la menor movilidad en acrilamida del ARN comparada con el ADN (Ausubel
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y col., 1994) y mediante comparación con la secuencia de M13mp18 cebado con el cebador universal. La fecha en la
parte izquierda del gel indica la banda protegida principal.
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B. Identificación del sitio de inicio de la transcripción usando una SLIC. La parte inferior de la Figura muestra la
estrategia y describe los oligonucleótidos usados para la SLIC o la RACE-PCR. En el experimento con la SLIC se
realizó una extensión del cebador usando el oligonucleótido pEx3. La primera hebra del ADNc se ligó subsiguientemente a los oligonucleótidos A5’, y el fragmento resultante se amplificó usando los oligonucleótidos A5’-1/p0, y
después A5’-2/p1. El fragmento amplificado se cargó entonces en un gel de agarosa al 1,2%. El gel se transfirió y se
hibridó con el oligonucleótido p2. Carril 1: 5µg de ARN total de DBA2 de cerebro de ratón. Carril 2-3: controles,
respectivamente sin transcriptasa inversa y sin ARN. Menos: se omitió la ARN T4 polimerasa. Se obtuvo el mismo
resultado usando RACE-PCR.
Figura 3: expresión específica celular del promotor de la subunidad β2 in vitro.
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La actividad luciferasa de los plásmidos se normalizó a la actividad del plásmido sin promotor (KS-Luci, descrita
en Materiales y Procedimientos). La RACE-PCR del ARNm extraído de SK-N-Be transfectado con EE1.2-Luci usando
oligonucleótidos de luciferasa (descrita en Materiales y Procedimientos) demostró que el fragmento amplificado tenía
el tamaño esperado del sitio de inicio de la transcripción correcto.
Figura 4: expresión específica celular del promotor de la subunidad β2 en ratones transgénicos.
A. Preparación microscópica completa coloreada de embriones E13. Las cabezas de flechas señalan la expresión
ectópica en músculos cutáneos.
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B. Detección de la actividad β-galactosidasa en el corte parasagital de un embrión E13 a nivel lumbosacro. Las cabezas de flecha indican el marcaje en las astas anterior y posterior de la médula espinal. C. Detección de los transcritos
de la subunidad β2 en un corte adyacente del mismo embrión. dr : ganglio de la raíz posterior; t : tectum; og : cadena
ganglionar ortosimpática; tr : ganglio trigémino.
Figura 5: expresión de la β-galactosidasa en ratones transgénicos.
A. tinción de la retina (re) y del ganglio trigémino (tr) (E14.5). B. Tinción de las neuronas ganglionares parasimpáticas cardiacas (pg) (E14.5). C. corte transversal de la médula espinal (P1). dr : ganglio de la raíz posterior, og :
ganglio ortosimpático. D. Vista anterior de la médula espinal (P1). Las flechas más pequeñas indican neuronas que no
han sido identificadas.
Figura 6: expresión de los genes de fusión de la Luciferasa que contienen las deleciones en los extremos 5’ del
promotor de la subunidad β.
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Los plásmidos se denominan nnnE-Luci, en el que nnn es el tamaño de los nucleótidos en la inserción, y E es el
sitio de restricción del extremo 5’ (Eco47III). La flecha indica el sitio de inicio de la transcripción. Las actividades de
EE1.2-Luci son las de la Figura 3.
Figura 7: experimento de cambio de gel. Autorradiograma del experimento de cambio de movilidad. La sonda
usada fue un oligonucleótido E-D bicatenario marcado con 32 P. Este oligonucleótido porta únicamente el elemento
caja E/Díada, mientras que el oligonucleótido S-E porta el sitio de unión Sp1 así como el elemento caja E/Díada.
Los oligonucléótidos competidores se usaron en un exceso molar de 10 y 100 veces, excepto para S-E, que se usó
únicamente con un exceso molar de 100 veces.
Tabla 1: elementos reguladores positivos y negativos en la región proximal del promotor de 1163 pb.
A. Efecto de las mutaciones en la parte proximal del promotor de 1163 pb. Las actividades de los promotores
naturales o mutados se normalizan a la actividad de la luciferasa del plásmido KS-Luci sin promotor. Las actividades
de EE1.2-Luci son las de la Figura 3.
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B. Alineación del silenciador proximal del promotor de la subunidad β con otros promotores neuronales. La secuencias se toman de (Maue y col., 1990, Na channel, número de acceso M31433), (Mori y col., 1990; SCG10, M90489),
(Sauerwald y col., 1990; Synapsin 1, M55301), (Kohl y col., 1992; gen CAML1, X63509), (Gill y Christakos, 1993,
gen Calbindin, L11891), (Zopf y col., 1990; gen Neurofilament, X17102, orientación inversa). La numeración se
refiere a la secuencias de la genoteca GenBank/EMBL.
Figura 8: desorganización del gen que codifica la subunidad β2 del RnAC neuronal. a-i, estructura genómica
normal del gen de la subunidad β2 de ratón. La porción del exón uno eliminada mediante el evento de recombinación
está sombreada en gris claro. Metionina del ATG iniciador. Las cajas representan los exones I-IV. a-ii, vector de
reemplazamiento de objetivo usado para desorganizar el gen endógeno de la subunidad β2. La metionina iniciadora y
el resto del primer exon se reemplazaron por la región codificante de NLS-lacZ y el casete de expresión25 MCI neoR . El
constructo fue capaz de dirigir la expresión de lacZ tras una transfección estable de células PC12 (no mostrado), pero
la expresión de lacZ no se detectó nunca en animales recombinantes, a pesar de la ausencia de la obvia recombinación
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en el ADN de lacZ. Se usó el gen de la toxina diftérica A (DTA)26 para seleccionar frente a una integración aleatoria.
a-iii, estructura del gen β2 mutado. Sitios de restricción: H, HindIII;R, EcoRI, E, Eco47III; P, PstI. Flechas negras,
cebadores usados para detectar los eventos de recombinación en células madre embrionarias (ES). Flechas grises,
cebadores usados para detectar los genes β2 naturales o mutados. b, análisis por PCR de la cola de ADN de un ratón
+/+, +/- y -/-. c, análisis por inmunotransferencia Southern de ADN de cola restringido con Hindi a partir del mismo
ratón analizado en el panel b. d, análisis por inmunotransferencia Western de la proteína cerebral total usando un
anticuerpo monoclonal creado contra la subunidad β2.
Procedimientos: a, el vector de asignación de objetivo β2 se construyó insertando un sitio de clonación múltiple
(MCS) en el casete MCI neo (GTC GAC GGT ACC GCC CGG GCA GGC CTG CTA GCT TAA TTA AGC GGC
CGC CTC GAG GGG CCC ATG CAT GGA TCC). Se clonaron un fragmento genómico 5’ de 4,1 kB EcoRI-Eco47III
de β2 al ATG y un fragmento genómico de 1,5 kB PstI de β2 comenzando dentro del primer intrón del gen β2 en el
MCS. Se transfectaron células madre embrionarias HMI27,28 (5 x 107 ) con el vector de asignación de objetivo linealizado mediante electroporación, según se describe25 . Mediante PCR se identificaron veinticuatro clones supervivientes
resistentes a G418 (cebador β2 - GCC CAG ACA TAG GTC ACA TGA TGG T; cebador neo - GTT TAT TGC AGC
TTA TAA TGG TTA CA). Cuatro fueron positivos, y se confirmaron posteriormente mediante un análisis de inmunotransferencia Southern. Los clones se inyectaron en blastocitos de 3,5 días de edad de ratones no cobayas C57BL/6 y
se implantaron en hembras receptivas. Todos los ratones quiméricos machos resultantes se cruzaron con hembras no
cobayas F1, C57BL/6xDBA/2. De 15 quimeras, una mostró una transmisión germinal. Se cruzaron heterocigotos β2
+/-, y la descendencia se evaluó mediante análisis por PCR (panel b). b, la PCR fue de 35 ciclos de 94º/1 min, 65º/2
min y 72º/1 min. c, la inmunotransferencia Southern se realizó según se describe29 . El fragmento genómico PstI de 1,5
kB usado para el constructo de asignación de objetivo se marcó mediante cebado aleatorio. d, la inmunotransferencia
Western se realizó según se describe29 usando un anticuerpo monoclonal 27011 .
Figura 9: cartografiado del RnAC neuronal de cerebro de ratón usando una hibridación in situ y una unión con
nicotina tritiada. A, hibridación in situ usando sondas oligonucleotídicas antisentido basadas en la secuencia de los
ADNc que codifican las subunidades β2, α4 y β4 del RnAC para detectar sus respectivos ARNm en cortes seriados de
los cerebros de ratones β2 +/+, +/- y -/-. Se muestran los cortes talámicos medios. Las flechas blancas indican las MHb
marcadas por el oligonucleótido β4 antisentido. B, autorradiografía del receptor usando nicotina tritiada que revela los
sitios de unión de alta afinidad en los cerebros de ratones naturales, heterocigotos y mutantes β2. Se muestran cortes
representativos a nivel del striatum, el tálamo y el tectum.
Procedimientos, A, la hibridación in situ se realizó como sigue:
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Procedimiento de hibridación in situ. Se cortaron tejidos congelados en el criostato [cortes de 14 µm de espesor],
se montaron descongelados en portaobjetos recubiertos con poli-1-lisina y se almacenaron a –80ºC durante 1-3 días.
El procedimiento se llevó a cabo según Young y col. (1986). En resumen, los cortes se fijaron con paraformaldehído
al 4% durante 5 min a temperatura ambiente, se lavaron con disolución salina tamponada con fosfato (PBS) y después se acetilaron y deslipidemizaron con etanol y cloroformo (5 min). Se prehibridaron durante 2-4 h a 37ºC bajo
cubreobjetos de parafilm. La composición de las mezclas de la prehibridación y la hibridación era formamida al 50%,
NaCl 0,6 M, ditiotreitol 0,1 M, sulfato de dextrano al 10%, ácido etilendiaminotetracético (EDTA) 1 mM, disolución
de Denhardt 1X (50X = albúmina sérica bovina al 1% / Ficoll al 1% / polivinilpirrolidona al 1%), 0,1 mg/ml de poliA
(Boehringer), 0,5 mg/ml de ARN de levadura (Sigma), 0,05 mg/ml de ADN de esperma de arenque (Promega) en TrisHCl 0,02 M, pH 7,5. Las sondas se aplicaron a una concentración de 2000-3000 Bcq/30 µl de corte (correspondiente
a alrededor de 15 fmol/corte). Después de retirar los cubreobjetos y de un lavado inicial con 2X disolución de citrato
salino estándar (SCC) (NaCl 3 M / citrato sódico 0,3 M) a temperatura ambiente (dos veces durante 5 min), los cortes
se lavaron cuatro veces durante 15 min con 2X SSC / formamida al 50% a 42ºC, y después dos veces durante 30
min con 1X SSC a temperatura ambiente. Se añadió ditiotreitol 1 mM a todas las disoluciones de lavado. Después de
enjuagar con agua destilada enfriada en hielo y secar, se expusieron durante 10-20 días a Hyperfilm βmax (Amersham)
y después a una emulsión fotográfica (NTB2, Kodak) durante 1-2 meses.
Análisis de las preparaciones histológicas. El análisis del patrón de marcaje de los diferentes ARNm se llevó a cabo
en autorradiogramas en lámina y en emulsión. La identificación de las estructuras anatómicas se llevó a cabo después
de la tinción de contraste de cortes seriados de los embriones completos con azul de toluidina. La definición de las
zonas anatómicas del cerebro y el reconocimiento de las estructuras del sistema nervioso periférico (SNP) se basó en
diferentes atlas, incluyendo The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates (Paxinos y Watson, 1986), el Atlas of Developing
Rat Brain (Paxinos y col. 1991), el Atlas of Mouse Development (Kaufman, 1992), y el Atlas of the Prenatal Mouse
Brain (Schambra y col., 1992). Para el desarrollo de los ganglios de los nervios craneales, se consultaron las láminas y
las descripciones de Altman y Bayer (1982). Con objeto de confirmar la identificación de algunas estructuras centrales
y periféricas (por ejemplo, los núcleos motores de los nervios craneales, los ganglios motores autónomos), se realizó
una hibridación in situ para la colina acetiltransferasa en algunos cortes.
Se asignó una puntuación desde 1+ (baja intensidad) hasta 3+ (alta intensidad) al marcaje de las estructuras anatómicas según una evaluación subjetiva de dos experimentos. El marcaje de fondo se consideró la densidad de granos en
tejidos no neuronales muy celularizados (tal como el hígado y los músculos) o con una alta densidad de matriz extra
celular (tal como el cartílago) o la densidad de marcaje en estructuras nerviosas tras el desplazamiento con 20X de una
sonda fría. En ausencia de recuento de granos a nivel celular, las puntuaciones deben ser consideradas con precaución.
Por ejemplo, un descenso en la intensidad del marcaje de una estructura en desarrollo puede ser debido a la dispersión
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de células positivas de la estructura causada por la multiplicación de células negativas o por la formación de procesos
neuronales. Aunque los oligonucleótidos tenían la misma longitud y estaban marcados según el mismo protocolo, no
se realizó ningún intento de comparar la intensidad de señal o diferentes transcritos. Salvo que se indiquen lo contrario, el marcaje mostrado en los dibujos se ha obtenido usando los oligonucleótidos nos 31 (α3), 47 (α4), 51 (α2)
y 62 (α4) (véase la Tabla 1 para las características de los oligonucleótidos). Controles de especificidad. Para cada
ARNm se eligieron de dos a cuatro oligonucleótidos en partes únicas de la secuencia (por ejemplo, el supuesto bucle
citoplasmático entre M3 y M4 para las subunidades del RnAC). Se realizó una evaluación inicial de la especificidad
buscando la posible homología con otras secuencias conocidas en GenBank/EMBL. Como pruebas histológicas de especificidad se consideraron las siguientes: 1. Dos o más sondas oligonucleotídicas para cada ARNm dieron el mismo
patrón de hibridación (fig. 1). 2. El patrón de marcaje de las estructuras centrales en la rata adulta estaba de acuerdo
con el observado por otros autores (Wada y col., 1989; Dineley-Miller y Patrick, 1992). 3. Dado que la mayoría de
los oligonucleótidos usados eran 45-meros con un contenido similar de GC (Tabla 1), cada sonda oligonucleotídica
constituía un control para la especificidad de las otras. 4. La adición a la mezcla de hibridación de un exceso de 20
veces de sonda fría produjo la completa desaparición del marcaje (Fig. 2).
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Las sondas oligonucleotídicas usadas cumplían todos estos criterios, con la excepción de cuatro sondas contra
ARNm α3, que no satisfacía el criterio 2. Estudios previos basados en sondas de ARNc demostraron una distribución
relativamente extensa de este ARNm de subunidad en ratas adultas, notablemente altos niveles en la capa IV de la
corteza cerebral, en la capa II de la corteza entortinal, en los núcleos talámicos anteriores y ventrales, en los núcleos
del cuerpo geniculado lateral y medial, en la habenula media, en el hipotálamo posterior y los núcleos supramamilares,
en la glándula pineal, en los núcleos motores de los nervios V y VII, en el locus coeruleus, en el nucleous ambiguus
y en el área postrema (Wada y col., 1989). En desacuerdo con estas observaciones, en ratas adultas pudimos detectar
altos niveles de señal del ARNm de α3 sólo en la habenula media, intermedios en la glándula pineal, el área postrema,
el núcleo motor del nervio V y el cerebelo, bajos en unos pocos núcleos talámicos y en el locus coeruleus. Parte de
la discrepancia puede atribuirse a una menor sensibilidad de las sondas oligonucleotídicas frente a las ribosondas. Sin
embargo, considerando la dificultad para llevar a cabo controles específicos para las sondas de ARNc, especialmente
cuando la hidrólisis de la sonda se realiza en el procedimiento histológico (Wada y col., 1989), es posible que algún
marcaje previamente atribuido al ARNm de α3 derive realmente de la hibridación con otras secuencias de ARN
relacionadas con el RnAC.
Oligonucleótidos: β2: 5’-TCG CAT GTG GTC CGC AAT GAA GCG TAC GCC ATC CAC TGC TTC CCG-3’;
α4: 5’-CCT TCT CAA CCT CTG ATG TCT TCA AGT CAG GGA CCT CAA GGG GGG-3’; β4:5’-ACC AGG CTG
ACT TCA AGA CCG GGA CGC TTC ATG AAG AGG AAG GTG-3’. B, se realizó una unión con 3 H-nicotina según
describen Clarke y col.30 . Se incubaron catorce cortes en corona de 1 µm a temperatura ambiente durante 30 min en
Tris 50 mM, pH 7,4 / CaCl2 8 mM / 3 H-L-nicotina 4 nM. La unión no específica se evaluó en presencia de bitartrato
de L-nicotina 10 µm. Tras la incubación, los cortes se enjuagaron 2 x 2 min con PBS enfriado en hielo y se enjuagaron
brevemente con agua enfriada en hielo. Los portaobjetos se expusieron durante 60 días a Hyperfilm 3 H.
Figura 10: registro del parche de clampado de corrientes evocadas por nicotina en la MHb y el tálamo anterior
de ratones β2 +/+ y -/-. A, registros representativos de células en la MHb y el tálamo anterior de ratones β2 -/- y
naturales. La tasa de disociación del agonista es significativamente mayor en la MHb que en el tálamo anterior, dando
como resultado diferentes cinéticas de respuesta en las dos estructuras. La respuesta a los agonistas nicotínicos de
la MHb se mantiene en animales β2 -, mientras que la respuesta a los agonistas nicotínicos del tálamo anterior está
completamente anulada en ratones β2 -/-. B, tabla de respuestas a los agonistas nicotínicos en varios núcleos de ratones
β2 +/+ y -/-.
Procedimientos, se obtuvieron secciones en corona del tálamo de ratones de 8-12 días de edad usando un cortador
Dosaka en medio ACSF enfriado en hielo (NaCl 125 mM / NaHCO3 26 mM / glucosa 25 mM / NaH2 PO4 1,25 mM
/ KCl 2,5 mM / CaCl2 2 mM / MgCl2 1 mM, pH 7,3). Los cortes se mantuvieron en el mismo medio durante 1-8
horas. Las células de los cortes se visualizaron mediante un microscopio Zeiss. Se obtuvieron registros de células
completas con pipetas de vidrio sólido de 2-4 MOhm que contenían CsCl 150 mM / EGTA 10 mM / HEPES 10 mM
/ ATP disódico 4 mM / MgCl2 4 mM, y el pH ajustado a 7,3 con KOH. Se aplicaron rápidamente pulsos de cinco a
diez pulsos de fármaco a la célula mediante una pipeta de 50 µM de diámetro por encima del corte, alimentada por
gravedad con una disolución que contiene NaCl 150 mM / HEPES 10 mM / KCl 2,5 mM / CaCl2 2 mM / MgCl2 1
mM. los registros se realizaron en presencia de CNQX (5 µM) y del antagonista del GABAA SR-95531 (10 µM). Las
corrientes se registraron con un amplificador de parche Axopatch ID (Axon Instrument), se digitalizaron en un PC
Compaq y se analizaron adicionalmente con el programa Pclamp (Axon Instrument).
Figura 11: comportamiento de los ratones β2 -/- y sus hermanos naturales en la prueba de evitación pasiva. A, respuesta a varios niveles de choque eléctrico en pruebas de retención subsiguientes a una inyección post-entrenamiento
bien de vehículo o bien de nicotina (10 µg/kg). La latencia media por etapas durante el ensayo de entrenamiento fue
de 17,0 ± 3,6 s para los ratones mutantes y de 15,0 ± 3,5 s para sus hermanos no mutantes. B, gráfico de barras que
muestran la diferencia en la latencia de retención entre ratones naturales y mutantes homocigóticos β2 inyectados
bien con vehículo o bien con nicotina (10 µg/kg) a una intensidad de choque eléctrico de 2,00 mA. Los datos están
representados como medias ± EEM de los siguientes grupos: natural + vehículo (n=27); natural + nicotina (n=23);
ratón mutante β2 + vehículo (n=17); ratón mutante β2 + nicotina (n=17). El análisis estadístico se realizó usando un
análisis factorial mixto de la variancia seguido de una prueba a posteriori de los efectos simples. #, p < 0,05, ratones
naturales frente a mutantes tras la inyección de vehículo; *, p < 0,01, nicotina frente a vehículo en ratones naturales.
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Procedimientos, la prueba de evitación pasiva se realizó según se describe en el texto, según Nordberg y Bergh20
y Faiman y col.20 . La nicotina (bitartrato, Sigma) se disolvió de nuevo en PBS. La inyección IP del mismo volumen
bien de nicotina o bien de vehículo siguió inmediatamente al choque eléctrico durante el ensayo de entrenamiento.
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Figura 12: fago y plásmidos que contienen todo o parte del gen y el promotor de la subunidad β2. En los nombres
de los plásmidos, los números indican el tamaño del fragmento y las letras indican los sitios de restricción usados para
generarlo.
Descripción detallada
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Las descripciones y los ejemplos siguientes son ejemplares de las formas de realización y el ámbito de esta invención. La invención no se limita al ámbito de esta descripción. Adicionalmente, esta descripción, junto con las
secciones anexas de esta memoria descriptiva y el material incorporado como referencia, permite la práctica de todas
las reivindicaciones que siguen.
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Los ejemplos y las formas de realización que siguen pueden, por supuesto, ser modificados mediante técnicas
conocidas en la materia. Pueden producirse variaciones en las secuencias de los ácidos nucleicos descritas o reivindicadas mediante procedimientos conocidos sin alterar los efectos o las ventajas que los inventores han demostrado.
Dichas variaciones están, por tanto, incluidas dentro del ámbito de esta descripción e invención.
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Materiales y procedimientos
Aislamiento de los clones genómicos
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El plásmido PCX49 (Deneris y col., 1988), que contiene el ADNc completo de rata (cedido amablemente por los
Drs. J. Boulter y S. Heinemann, The Salk Institute, San Diego, CA), se cortó con EcoRI, el fragmento de ∼2,2 kb
se aisló y se usó como sonda para identificar una genoteca del bacteriófago EMBL3 de ADN genómico de DBA2 de
ratón. Se obtuvo un único clon que abarcaba ∼15 kb de ADN secuencia arriba y ∼5 kb secuencia abajo a partir del
primer exón. La Figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos de 1,2 kb secuencia arriba del ATG iniciador.
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Las condiciones de hibridación pueden modificarse mediante técnicas conocidas29 para determinar las condiciones
rigurosas para esta sonda. Pueden realizarse cambios en las condiciones de hibridación, tales como en la temperatura
(desde aproximadamente 45ºC hasta aproximadamente 65ºC) y en la concentración del tampón SSC (desde aproximadamente 0,1 X SSC hasta aproximadamente 6 X SSC), así como cambios en la temperatura y en el tampón para las
condiciones de lavado, para desarrollar unas condiciones lo suficientemente rigurosas para permitir la hibridación de
las secuencias de la subunidad β2. Pueden por tanto aislarse otras secuencias relacionadas a partir de otras genotecas
según este procedimiento de hibridación. Las secuencias humanas se aislarán usando unas condiciones de hibridación
tales como 45ºC y 6X SSC.
Se realizaron tres depósitos el 13 de diciembre de 1994 en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes
(CNCM), Institut Pasteur, 25 Rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, Francia. Un fago, el λβ2 RnAC, es
depositado con el número de acceso I-1503. Este fago contiene 15-20 kb de ADN genómico, incluyendo las secuencias
promotoras y las secuencias codificantes de todos los exones de la subunidad β2 murina del RnAC neuronal. También
se han depositado dos cultivos de E. coli portadores de plásmidos. El plásmido pSA9 de E. coli DH5α tiene el número
de acceso I-1501 y contiene 9 kb de ADN genómico murino, incluyendo las secuencias reguladoras y las regiones
codificantes para los exones 1, 2 y 3 de la subunidad β2. El plásmido pEA5 de E. coli DH5α tiene el número de acceso
I-1502 y contiene 5 kb de ADN genómico murino, incluyendo una región de aproximadamente 1,2 kb secuencia
arriba del sitio Eco47-III y una región codificante para los exones 1 a 5 de la subunidad β2. Los inventores pretenden
depositar los datos de la secuencia de nucleótidos aquí referida en el EMBL, el GenBank y la DDBJ Nucleotide
Sequence Databases con el número de acceso: X82655.
Cartografiado del sitio de inicio de la transcripción
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Para el cartografiado del ARNm usamos diferentes lotes del ARN total extraído de embriones DBA2 en la etapa
E13 o E15. Las muestras de ARN se digirieron inicialmente con DNasa para evitar la contaminación por ADN.
Protección de la RNasa. Se insertó un fragmento XbaI/PstI que contiene parte del intrón 1 en Bluescript SK
(Stratagene). El plásmido se linealizó entonces mediante Bg1II, y se sintetizó una sonda de ARN usando el promotor
T7. Los experimentos de protección se realizaron entonces según describen Ausubel y col. (1994).
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RACE-PCR (Frohman y col., 1988). El ARNm se hibridó durante 5 minutos a 80ºC con 10 pmol de cebador. La
síntesis del ADNc se realizó usando 400 u de MMLV (Gibco) durante 45 minutos a 37ºC en el tampón recomendado
por el proveedor. Tras una extracción en fenol/cloroformo, el ADNc se precipitó en etanol. La reacción de la transferasa
terminal se realizó en cacodilato potásico 0,2 M; Tris-HCl 25 mM, pH 6,6; 25 mg/ml de BSA; CoCl2 1,5 mM; dATP
50 nM y 50 u de transferasa terminal (Boehringer) durante 30 minutos a 37ºC. Tras la extracción con fenol/cloroformo
y la precipitación en etanol, se había amplificado un décimo de la reacción de la transferasa terminal usando ADN
polimerasa Taq de Promega (30 ciclos, 1 minuto a: 94ºC; 55ºC; 72ºC). Entonces el fragmento amplificado se cargó
en un gel de agarosa. El gel se transfirió y se hibridó con el oligonucleótido p2. Usamos pEx2 como cebador para la
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síntesis del ADNc, y pO/BEpT para la PCR para cartografiar el ARNm del cerebro. Se usaron OLUCI3 (síntesis del
ADNc) y OLUCI2/BEpT (PCR) para cartografiar el ARNm de las células transfectadas.
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SLIC (Dumas Milnes Edwards y col., 1991). Primero se sintetizó el ADNc a partir 5 µg de ARN total usando pEx3
(6 pmol) como cebador en Tris-HCl 50 mM, pH 8,3; KCl 8 mM; MgCl2 1,6 mM; espermidina 5 mM; dNTP 0,5 mM;
1 µ/µl de RNasin; 0,1 mg/ml de BSA; β-mercaptoetanol 70 mM; 80 u de transcriptasa inversa de AMV (Promega) a
42º durante 45 minutos. El ARN se degradó subsiguientemente en NaOH. La primera hebra del ANDc se ligó entonces
con el oligonucleótido A5’. Al ADNc monocatenario resultante se sometió entonces a dos rondas de amplificación por
PCR con los oligonucleótidos A5’-1/p0 y A5’-2/pl (35 ciclos: 94ºC, 1 minuto; 60ºC, 30 segundos; 72ºC, 45 segundos).
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Las secuencias de los oligonucleótidos fueron las siguientes:
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Construcción de los plásmidos
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KS-Luci: se sucblonó el fragmento de restricción HindIII/KpnI del plásmido pSVOAL (de Wet y col., 1987) en
el sitio correspondiente de Bluescript KS. Entonces se eliminó el fragmento más 5’ EcoRI/BsmI (45 pb) del gen de
la Luciferasa según (de Wet y col., 1987) y se reemplazó por un sitio SaI I. El fragmento de restricción de 342 pb
PvuII/HindIII de SV40 que contenía los sitios de poliadenilación se subclonó subsiguientemente en los sitios EagI
usando adaptadores.
EE1.2-Luci: el fragmento de 1,2 kpb de EcoRI/Eco47II del fago λβ2 se insertó en los sitios EagI/SaII de KS-Luci
usando adaptadores. Las deleciones en el extremo 5’ del promotor se obtuvieron usando exonucleasa BaI3.1 como en
Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, y col., 1994).
Las mutaciones se introdujeron usando el kit Sculptor (Amersham). En la secuencia NRSE/RE1, la secuencia
mutada era: +24 ACCACTTACA en lugar de ACCACCGACA, dado que se demostró que esta mutación reducía
la actividad del elemento NRSE (Mori y col., 1992). En la secuencia de la caja E, la secuencia mutada era: -120
TCCTCAGG en lugar de TCCACTTG. La Figura 7 demuestra que una proteína nuclear es capaz de unirse a la
secuencia natural, pero no a la secuencia mutada.
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Transfección de las células
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Se hicieron crecer neuroblastomas N1E115, SK-N-Be humanos, HeLa y fibroblastos 3T6, células de riñón humano
293 y células estriadas SVLT (Evrard y col., 1990) en DMEM + FCS al 10% complementado con glutamina al 1% y
estreptomicina al 1%. Las células PC12 se hicieron crecer en DMEM + HS al 10% + FCS al 5% complementado con
glutamina al 1% y estreptomicina al 1%.
Las células se colocaron en placas a desde 105 hasta 4x105 céls/placas de 60 mm2 . Al día siguiente las células se
transfectaron en 750 µl de DMEM + Penicilina/Estreptomicina al 2% durante desde 5 hasta 12 horas con 1 µg de ADN
mezclado con 2,5 µl de Transfectam (IBF/Sepracor) en NaCl 150 mM. La actividad de la Luciferasa se midió 48 horas
después. El ADN se preparó usando kits Qiagen o Wizard prep (Promega). Cuando se compararon las actividades de
los plásmidos, todos los plásmidos se prepararon el mismo día. Se probaron al menos dos preparaciones diferentes de
ADN para cada plásmido. Toda las transfecciones se realizaron por duplicado y se repitieron al menos tres veces.
Producción de ratones transgénicos
Se extirpó el gen de la luciferasa de EE1.2-Luci y se reemplazó por el gen nlsLacZ (Kalderon y col., 1984). El
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fragmento β2-promotor/nlsLacZ se electroeluyó desde un gel de agarosa TAE y después se purificó adicionalmente
mediante precipitación en etanol, y finalmente se resuspendió en Tris-HCl 10 mM, pH 7,5; EDTA 0,1 mM. La disolución de ADN (3 ng/ml) se inyectó en ovocitos fertilizados de híbridos C57BL6xSJL. La tinción de los tejidos se
realizó según se describe en Mercer y col., 1991.
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Véanse también los procedimientos en la figura 8.
Ensayo con cambio de gel
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Se marcaron oligonucleótidos bien con γ[32 P]ATP y T4 polinucleótido cinasa, o bien con α[32 P]CTP y enzima
Klenow, como en Current Protocols in Molecular Biology. Los extractos nucleares se prepararon a partir de ∝107
células, según se describe (Bessis y col., 1993). Para la unión se mezcló 1 nmol de oligonucleótido marcado con
0,5 µg de extracto de proteína en HEPES 10 mM, pH 8, glicerol al 10%, EDTA 0,1 mM, NaCl 0,1 M, DTT 2 mM,
0,1 mg/ml de BSA, MgCl2 4 mM, espermidina 4 mM, PMSF 1 mM, 1 µg de polidIdC en 20 µl. La reacción se
incubó durante 10 minutos en hielo. Los complejos ADN-proteína se analizaron entonces en un gel de poliacrilamida
al 7%.
Los oligonucleótidos usados en estos experimentos eran bicatenarios, con las siguientes secuencias (los nucleótidos
subrayados están cambiados entre los oligonucléotidos mutados y los naturales):
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Resultados
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Caracterización de las secuencias flanqueantes 5’ del gen que codifica la subunidad β2
Se clonó un fago λ, que contenía el gen que codifica la subunidad β2 y se secuenció una región que rodea al
ATG iniciador (Figura 1). El sitio de inicio de la transcripción se cartografió inicialmente mediante protección de
RNasa (Figura 2A). Este procedimiento nos permitió detectar al menos tres sitios de inicio. Sin embargo, en estos
experimentos podrían no haberse detectado sitios de inicio menores. El tamaño de la principal banda protegida se
estimó en aproximadamente 150 nucleótidos. Para confirmar y localizar los sitios de inicio de forma más precisa,
realizamos tanto una RACE-PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends; Frohman y col., 1988) como una SLIC (Single
Strand Ligation of cDNA; Dumas Milnes Edwards y col., 1991), que consiste en la amplificación del producto del
cebador de extensión (Figura 2B). Ambas técnicas nos permitieron subclonar y secuenciar los mismos fragmentos
correspondientes a los cuatros sitios de inicio descritos en la Figura 1. Es probable que el sitio de inicio -13 fuera muy
raro y no fuera detectado mediante el cartografiado con la RNasa.
El análisis de la secuencia de la región flanqueante (Figura 1) reveló numerosos elementos de unión del ADN
consenso: un sitio Sp1 (-146); un sitio de unión que responde al elemento AMPc (CREB) (-287; Sassone-Corsi;
1988), un elemento de respuesta al receptor nuclear (de -344 a -356; Parker, 1993), un sitio GATA-3 (-1073; Ko y
Engel, 1993), y un motivo octámero débilmente degenerado (-522). Además, pudo reconocerse una caja E (-118)
contenida en un elemento simétrico en diada. La región proximal (de -245 a +82) también tiene un contenido en GC
inusualmente alto (67%) y un elevado número de dinucleótidos CpG que podrían tener alguna importancia reguladora
(Antequera y Bird, 1993). Finalmente, se encontró una secuencia de 20 pb idéntica a la secuencia del NRSE (Neural
Restrictive Silencer Element; Mori y col., 1992) o del RE1 (Restrictive Element; Kraner y col., 1992) en el extremo
3’ del fragmento de 1,2 kpb (de +18 a +38).
Un fragmento de 1,2 kpb de la secuencia flanqueante del gen de la subunidad β2 promueve la expresión específica
neuronal in vitro.
Se generó un constructo que contenía el fragmento de 1163 pb EcoRI/Eco47III (desde -1125 hasta + 38) de la
región flanqueante 5’ de la subunidad β2 fusionado al gen de la Luciferasa (de Wet y col., 1987) (plásmido EE1.2Luci). Se insertaron los sitios de poliadenilación del SV40 secuencia arriba de las secuencias de la subunidad β2 para
evitar la ultralectura. Entonces se comprobó la actividad transcripcional del plásmido EE1.2-Luci mediante transfección transitoria en células de feocromocitoma (PC12), en líneas celulares de neuroblastoma NIE 115 y SK-N-Be, en
SVLT, en una línea celular estriada (Evrard y col., 1990), en fibroblastos NIH3T6 o HeLa y en la línea celular de riñón
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humano 293. Usando la RT-PCR, verificamos que los neuroblastomas y las células PC12 expresaban normalmente el
ARNm de la subunidad β2, pero no la líneas celulares estriadas SVLT ni los fibroblastos 3T6. La Figura 3 demuestra
que en células PC12 y en neuroblastomas, el fragmento de 1,2 kpb es de 20 a 180 veces más activo en la mediación
de la transcripción del gen indicador que en otras líneas celulares. En fibroblastos, en células 293 y en células SVLT,
la actividad transcripcional del fragmento de 1,2 kpb no es significativamente mayor que la del vector sin promotor
(Figura 3). Por lo tanto, el promotor de la subunidad β2 no es activo en estas líneas celulares Estos experimentos de
transfección in vitro demuestran que el fragmento de 1163 pb imita el patrón de expresión del gen de la subunidad β2
endógeno, y que contiene, por tanto, un promotor específico celular.
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El promotor de 1163 pb en ratones transgénicos
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Para probar el promotor de 1163 pb in vivo, se ligó el fragmento EcoRI/Eco47III secuencia arriba del gen informador de la nls-β-galactosidasa (Kalderon y col., 1984). Las señales de poliadenilación del SV40 se ligaron secuencia abajo de las secuencias codificantes. El fragmento resultante de 4,7 kb se microinyectó subsiguientemente
en los pronúcleos machos de huevos fertilizados de ratones híbridos F1 (C57B16xSJL). El ADN extraído de las colas de la descendencia se analizó para comprobar la presencia del gen de la β-galactosidasa mediante la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR). Se obtuvieron tres fundadores independientes, y se analizaron para comprobar
expresión.
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Dos líneas (13 y 26) tuvieron expresión en neuronas y la tercera línea no se expresó. Esto demuestra que el promotor de 1163 pb contiene elementos reguladores suficientes para dirigir la expresión específica neuronal in vivo.
En el sistema nervioso periférico, SNP, ambas líneas expresaron la misma estructura. Por el contrario, en el SNC
el patrón de marcaje de la línea 26 es un subconjunto del de la línea 13. Sólo describiremos al detalles la línea 13.
Como se esperaba, la mayoría de los ganglios periféricos que expresaban β2 expresaron la β-galactosidasa (β-gal),
mientras que en el SNC sólo un subconjunto de regiones β2 positivas expresaron la β-gal. Por ejemplo, la Figura 4C
demuestra que la gran mayoría de las neuronas de la médula espinal lumbosacra expresó los transcritos de la subunidad β2, mientras que sólo un subconjunto de neuronas de las astas anteriores y posteriores muestran una actividad
β-gal.
La expresión del transgén pudo detectarse en los ganglios periféricos de embriones E10.5 y El1. Se examinó el
marcaje de todos los embriones E13 (Figura 4A) y en los cerebros en etapas posteriores (E17; PO y edad adulta). En
E13, el marcaje destacado en el SNP: se observó un fuerte marcaje en los ganglios de la raíces posteriores (DRG,
Figuras 4 y 5 C, D); en algunos ganglios asociados con los nervios craneales (el trigémino, véase la Figura 5A, geniculado, ganglios glosofaríngeo y vagal); los ganglios de la cadena simpática (Figura 5C, D); las células ganglionares
de la retina (Figura 5A); y los supuestos ganglios parasimpáticos de las paredes cardíacas (Figura 5B). En E13 también había presentes agrupaciones de células positivas en numerosos niveles del axón, tanto en el tronco encefálico
como en el proencéfalo. También se observaron agrupaciones de neuronas teñidas en la médula espinal anterior y
lateral.
Más tarde en el desarrollo (E17) se encontraron neuronas positivas agrupadas en numerosos núcleos basales telencefálicos, mientras que se tiñeron células dispersas en el putamen y el núcleo caudato. A nivel del diencéfalo había
presentes agrupaciones positivas en la zona incerta y el núcleo talámico reticular, y en muchos núcleos hipotalámicos.
En el tronco encefálico, la mayoría de los núcleos motores de los nervios craneales (con la excepción del núcleo motor
posterior del nervio vago) mostraron entre un poco y un elevado marcaje. Además, las células dispersas del V núcleo
mesencefálico aparecían fuertemente teñidas, así como los núcleos de la protuberancia, el núcleo hipogloso prepósito
y unas pocas células dispersas en el tegumento de la protuberancia.
En el PO de la línea 13, la distribución de células positivas ya aparecía más restringida que en etapas anteriores
(por ejemplo, el marcaje en el telencéfalo basal y en los núcleos oculomotores estaba claramente disminuido). En
el SNC de animales adultos sólo se detectaron células marcadas en el hipotálamo. En la línea 13 se tiñeron algunas
agrupaciones de células en la mucosa del tracto gastrointestinal (estómago y duodeno) y en el páncreas. Se detectó un
marcaje ectópico en la protuberancia genital y en numerosos músculos superficiales de la línea 13, pero ninguno de
estos tejidos se tiñó en la línea 26.
Identificación de un promotor específico celular mínimo
Para investigar con más detalle los elementos reguladores implicados en la actividad del promotor, generamos
una serie de plásmidos que contenían deleciones 5’ del promotor de 1163 pb. Estos plásmidos se probaron mediante
transfección transitoria en fibroblastos y células SK-N-Be. Se eligieron éstas dos líneas celulares porque eran las líneas
celulares que se transfectaban con más facilidad. Además, la líneas del neuroblastoma se aisló inicialmente a partir de
estructuras periféricas (Biedler y col., 1978) y es una herramienta adecuada para estudiar los elementos reguladores
portados por el promotor de 1163 pb.
Cuando se eliminaron 157 pb del extremo 5’ del promotor de 1163 pb (plásmido 1006E-Luci, descrito en la
Figura 1), la actividad de la luciferasa no cambió significativamente en los neuroblastomas, pero aumentó en los
fibroblastos (Figura 6). Cuando se eliminaron otros 301 pb, la actividad del promotor remanente continuó aumentando
en los fibroblastos pero no en los neuroblastomas (véase el plásmido 862E-Luci, Figura 6). Por tanto, los plásmidos
eliminados de 157 y 301 pb portan elementos represores que sólo son activos en los fibroblastos. Sin embargo, el
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promotor truncado de 862 pb todavía mostraba una actividad específica neuronal (Figura 6, comparar la actividad
de 862E-Luci en ambas líneas celulares), demostrando que los elementos reguladores adicionales son portados por
el promotor de 1,2 kpb. Además, podría haber presente un represor entre -824 y -245 (comparar las actividades de
862E y 283E-Luci en los neuroblastomas). Este supuesto elemento regulador no se analizó adicionalmente. De hecho,
un promotor de 283 pb (plásmido 283E-Luci) es todavía ∝160 veces más activo en los neuroblastomas que en los
fibroblastos, confirmando la presencia de otros elementos reguladores específicos neuronales en esta porción proximal
del promotor.
Cuando se eliminaron 150 pb del extremo 5’ del promotor proximal de 283 pb, se detectó un descenso muy fuerte
en la actividad transcripcional tanto en fibroblastos como en neuroblastomas (véase la actividad del plásmido 133ELuci). Esto demuestra que se han eliminado elementos reguladores positivos cruciales. Estos elementos positivos
y negativos se investigaron adicionalmente mediante estudios de deleción y mutación de la porción proximal del
promotor.
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Elementos reguladores negativos y positivos en la región proximal
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El extremo 3’ de la subunidad β2 del promotor contiene sitios de unión opcionales de factor proteico. Para analizar
el papel de estos elementos en la regulación del gen de la subunidad β2, generamos plásmidos que contenían mutaciones en estos sitios de unión. Usando experimentos de delección se detectó un activador entre -95 y -245 (véase
la Figura 3, la diferencia entre 283E y 133E-Luci). Como la caja E localizada en el nt-118 era un buen candidato,
analizamos el efecto de las mutaciones en este elemento sobre la actividad transcripcional. La Tabla IA muestra una
reducción del 40% en la actividad transcripcional del promotor mutado en comparación con la del promotor natural.
El papel de la caja E en tejidos no neuronales fue más difícil de evaluar, dado que el nivel de transcripción basal ya
era bajo en los fibroblastos.
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Para comprender mejor el papel de la caja E en la regulación del promotor, investigamos los complejos proteicos
capaces de interactuar con esta secuencia. Se realizaron ensayos con cambio de gel usando la secuencia de 33 pb (nt135 a 103, oligonucleótido E-D) como sonda. Cuando el oligonucleótido marcado con 32 -P se mezcló con extractos nucleares de neuroblastomas o fibroblastos, se observaron tres complejos (Figura 7). Todos ellos estaban completamente
desplazados por un exceso de oligonucleótido E-D no marcado. Por el contrario, no se observó competición cuando
el oligonucleótido competidor estaba mutado dentro de la caja E/Díada (oligonucleótido Mut.E, véase la Figura 7,
carril “Mut-E”). Esto demuestra que la caja E/Díada es el único elemento contenido dentro de la secuencia - 135/103
capaz de unir la proteína nuclear. Ésta secuencia está probablemente implicada en la actividad del promotor de la
subunidad β.
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También hay presente una secuencia NRSE/RE1 en la región proximal, y se ha demostrado que actúa como un
silenciador en los fibroblastos, pero no en las células PC12 ni en los neuroblastomas (Kraner y col., 1992; Li y
col.,1993; Mori y col., 1992). Una mutación puntual de esta secuencia en el contexto del promotor de 1163 pb dio
como resultado un aumento de 105 veces en la actividad transcripcional de los fibroblastos, y sólo un aumento de 3
veces en los neuroblastomas (Tabla 1A). Esta secuencia es, por tanto, responsable de al menos parte de la expresión
específica celular del gen de la subunidad β2.
La eliminación del receptor de nicotina de alta afinidad en ratones transgénicos da como resultado una alteración en
el aprendizaje de evitación
Se desorganizó la subunidad β2 del RnAC en células madre embrionarias (ES), y subsiguientemente se generaron
ratones deficientes en esta subunidad (Fig. 8). Los ratones β2 -/- eran viables, se cruzaron normalmente y no mostraron
defectos físicos obvios. El tamaño y la organización cerebral global eran normales (véase, por ejemplo, la Fig. 9, A
y B). El análisis por inmunotrasferencia Western de homogeneizados de cerebro total usando anti-β2 monoclonales
27011 (Fig. 8d) e inmunocitoquímica por todo el cerebro usando un anticuerpo policlonal anti-β29 mostró que la
inmunorreactividad detectada en los ratones de control estaba ausente en los ratones β2 -/-, y estaba disminuida en los
ratones β +/-. El ARNm que codificaba la β2 era indetectable en ratones β2 -/- mediante hibridación in situ usando
oligonucleótidos antisentido β2 (Fig. 9A).
Las distribuciones de las subunidades α4 y β2 se solapan ampliamente en el cerebro, y se cree que estas subunidades se combinan para formar la isoforma del RnAC predominante en el SNC12 . Según unos experimentos de expresión
en ovocitos6 , la β4 es la única subunidad identificada hasta ahora que también podría ser capaz de formar heteropentámeros funcionales con la subunidad α4. La subunidad β4 se expresó normalmente en los cerebros de ratones β2 +/o ratones β2 -/- con expresión en la habenula media (MHb) y el nucleus interpeduncular (IPN)10 , y no hay ninguna
regulación por incremento en ningún otro sitio del cerebro para reemplazar a la subunidad β2 (Fig. 9A). Tampoco
estaba significativamente alterada la expresión de los ARNm de las subunidades α4 (Fig. 9A), α5 ni β3 en los ratones
mutantes.
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Los experimentos de unión en equilibrio han demostrado que la nicotina se une a una población de sitios de alta
afinidad (KD próxima a 10 nM13,14 ) cuya distribución se corresponde bien con la de las subunidades α4 y β213−15 . Se
realizó una autorradiografía cuantitativa del recetor usando 3 H-nicotina (4 nM) para visualizar los RnAC de alta afini14
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dad en secciones cerebrales de ratones β2 +/+, +/- y -/- (Fig. 9B). La unión de la nicotina in situ estaba completamente
anulada en animales β2 -/-, y se redujo en aproximadamente un 50% en todas las zonas del cerebro de animales β2 +/que implicaban a la subunidad β2 en la mediación de esta unión de alta afinidad.
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Electrofisiología de ratones transgénicos
Se estudiaron las neuronas del tálamo anterior, que expresan niveles muy altos de ARNm de la subunidad β2 (y
α4) (Fig. 9A), para comprobar su respuesta electrofisiológica a la nicotina. Esta zona, fácilmente accesible en una preparación en corte, respondió uniformemente a nicotina 10 µM en animales naturales, con una corriente entrante media
de 155 ± 73 pA, que se bloqueó mediante dihidro-β-eritroidina 1 µM. El orden de repuesta del agonista era compatible
con el observado para receptores nicotínicos que contienen α4/β2 in vitro6 (nicotina > DMPP > citisina) (Figura 10A).
Las neuronas talámicas anteriores requirieron de muchos minutos a una hora para una completa recuperación de la
respuesta del agonista, lo que sugiere que la respuesta del receptor tiende a una desensibilización. Además, se requirió
una dosis relativamente alta de 1 µM para una respuesta reproducible, lo que implica que la nicotina no se une a su
sitio de alta afinidad para activarlo. Los sitios de unión de alta afinidad de la nicotina pueden ser por tanto los RnAC
en una conformación desensibilizada.
En ratones β2 -/-, la respuesta de las neuronas talámicas anteriores a la nicotina estaba completamente anulada en
el 100% de las neuronas comprobadas (Figura 10B). Como control también se comprobaron las neuronas de la MHb,
en las que tanto α3 como β4 se expresan fuertemente. La nicotina causó una corriente entrante media de 505 ± 132
pA en ratones naturales, y la potencia del agonista de esta respuesta siguió el orden jerárquico para el receptor que
contiene α3/β4 (citisina = nicotina >DMPP) (Figura 10A). Como se esperaba, la respuesta de las células de la MHb a
la nicotina se mantuvo en los ratones mutantes.
La subunidad β2 se expresa en los ganglios de animales naturales8−10 pero no había ninguna diferencia aparente
en la frecuencia cardiaca o la temperatura corporal basal. La actividad locomotora espontánea, que es sensible a altas
dosis de nicotina y que no se ve modificada por fármacos selectivos para la isoforma β2/α4 del RnAC16 , no fue
significativamente diferente en ratones β2 -/-, β +/1 y β +/+.
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Resultados cognitivos y conductistas
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Se examinó el aprendizaje y la memoria de ratones naturales y mutantes usando dos procedimientos. El laberinto
de agua de Morris17,18 evalúa el aprendizaje de la orientación espacial. El rendimiento del ratón mutante en esta prueba
no difiere del ratón natural cuando se prueba en la tarea de plataforma visible o en la tarea de plataforma oculta
(tiempo de nado mínimo alcanzado tras 5 días de entrenamiento: mutantes (n=8): 7,4 ± 1,4 s; naturales (n=8): 8,2
± 2,0 s). En la prueba de transferencia ambos grupos de animales invirtieron aproximadamente el 35% del tiempo
en el cuadrante de la plataforma, con el mismo número de cruces de la plataforma (mutantes: 4 ± 0,4; naturales:
3,9 ± 0,6).
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Se evaluó la retención de una respuesta de evitación inhibidora usando la prueba de evitación pasiva, que también
se eligió por su sensibilidad farmacológica a la administración de nicotina19,21 . Ésta prueba consistió en un ensayo de
entrenamiento en el que el ratón se colocó en una cámara bien iluminada de una caja con compuerta corredera, y se
midió la latencia para entrar a la cámara oscura adyacente. Tras entrar a la cámara oscura, se administró un choque
eléctrico ineludible suave, y se inyectó vehículo o nicotina (10 µg/kg) al ratón. Veinticuatro (24) horas después, se
evaluó la retención midiendo la latencia para entrar en la cámara oscura. El tiempo invertido en la cámara iluminada
(latencia de retención) aumentó proporcionalmente al choque eléctrico aplicado tanto en los ratones mutantes como en
los naturales. Sin embargo, el tratamiento con nicotina facilitó consecuentemente la retención (p < 0,01) modificando
ascendentemente la curva en aproximadamente sólo 80 s en los ratones naturales (Fig. 10A). La administración de
nicotina fue completamente ineficaz en los ratones mutantes. Interesantemente, la latencia de retención fue significativamente mayor en los ratones mutantes que en sus hermanos no mutantes a los que se les inyectó vehículo (p < 0,05)
(Fig. 10B).
Puede observarse una retención incrementada en la prueba de evitación pasiva en animales con un umbral al
dolor disminuido o una emotividad incrementada. Por lo tanto, se realizó una prueba conductista adicional en todos
los ratones incluidos en este experimento. Los ratones mutantes no difirieron de sus hermanos no mutantes en la
respuesta de respingo, vocalización o salto ante el choque eléctrico. Se comprobó la emotividad midiendo la actividad
exploradora en un aparato de dos compartimentos durante 15 min21,22 . El tiempo medio invertido en el compartimento
oscuro, la actividad locomotora en el compartimento oscuro y las transiciones entre compartimentos no difirieron
entre los ratones mutantes y los naturales. Por lo tanto, ni los cambios en la sensibilidad al dolor ni los cambios en la
emotividad pueden tenerse en cuenta para la diferencia en la latencia de retención observada en la prueba de evitación
pasiva.
Los estudios con bajas dosis de nicotina23 o con agonistas16 nicotínicos específicos sugieren que los RnAC de
alta afinidad en el cerebro median en los efectos de la nicotina en la evitación pasiva. Consecuentemente, la nicotina
no puede cambiar el rendimiento del ratón β2 -/- en esta prueba, dado que carece de sitios de unión de alta afinidad. Sin embargo, el rendimiento mejorado del ratón mutante frente al ratón natural es bastante sorprendente. Pueden
proponerse numerosas explicaciones para el efecto paradójico de la mutación de la subunidad β2. Una hipótesis es
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que la inyección de nicotina mejora el rendimiento de los ratones naturales en la evitación pasiva como resultado de
una desensibilización, y por tanto una inactivación de los RnAC, que conduce a un rendimiento mejorado en esta
prueba. Por lo tanto, el comportamiento del ratón que carece del receptor podría imitar al del ratón cuyos receptores han sido desensibilizados24 . Otra posibilidad es que haya presentes RnAC en al menos dos vías que interactúan
con efectos opuestos para generar el comportamiento medido en la evitación pasiva. Si una de las vías es fisiológicamente más activa que la otra, la vía inactiva será estimulada preferentemente mediante la inyección de nicotina
en animales naturales, mientras que la vía más activa se verá preferentemente influenciada por la inactivación del
gen β2.
Los experimentos descritos anteriormente demuestran que en los RnAC que contienen la subunidad β median los
efectos de la nicotina en la evitación pasiva, una tarea de aprendizaje específica. Estos ratones proporcionan un sistema
modelo para el estudio de los efectos farmacológicos de la nicotina en el SNC, y son útiles para esclarecer el papel de
los RnAC de alta afinidad en los procesos cognitivos, la adicción a la nicotina y las demencias que implican carencias
del sistema nicotínico.
15
Referencias
Cada referencia a continuación se incorpora específicamente a la presente memoria descriptiva como referencia.
20
25
Anand, R. y Lindstrom, J. (1990). Nucleotide sequence of the human nicotinic acetylcholine receptor β2 subunit
gene. Nucl Acids Res 18, 4272.
Antequera, F. y Bird, A. (1993). Number of CpG islands and genes in human and mouse. Proc Natl Acad Sci
EE.UU. 90, 11995-11999.
Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R., Moore, D., Seidman, J., Smith, J., y Struhl, K. (1994). Current Protocols
in Molecular Biology. (Ed. Janssen, Kareen) John Wisley and Sons, Inc.
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40
Banerjee, S. A., Hoppe, P., Brilliant, M. y Chikaraishi, D. M. (1992). 5’ flanking sequences of the rat tyrosine
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5
10
15
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REIVINDICACIONES
1. Un ADN aislado que contiene:
5
a. un promotor de la subunidad β2 de ratón del receptor nicotínico neuronal de la acetilcolina que comprende
la secuencia establecida en la Figura 1, o
b. un ácido nucleico que hibrida con la secuencia establecida en la Figura 1 en condiciones rigurosas, o
10
c. un fragmento de la secuencia establecida en la Figura 1
en el que dicho ácido nucleico que hibrida según se define en (b) o fragmento según se define en (c) promueven la
transcripción específica neuronal de una secuencia de ADN unida operativamente.
15
2. Un ADN aislado que comprende el ADN según la Reivindicación 1, unido operativamente a una secuencia de
nucleótidos que codifica una proteína, un polipéptido o un péptido.
3. Un ADN aislado según la Reivindicación 2, en el que la proteína, el polipéptido o el péptido es un gen indicador.
20
4. Un ADN aislado según la Reivindicación 3, en el que el gen indicador es lacZ o Luciferasa.
5. Un ácido nucleico aislado complementario de un ADN aislado de la Reivindicación 1.
25
6. El ADN aislado según la Reivindicación 1, que comprende una secuencia desde el nucleótido -245 hasta el
nucleótido -95 de la Figura 1.
7. El ADN aislado según la Reivindicación 1, en el que la secuencia es la secuencia desde el nucleótido -245 hasta
el nucleótido -824 de la Figura 1.
30
35
8. El ADN aislado según la Reivindicación 1, en el que la secuencia es la secuencia desde el nucleótido -135 hasta
el nucleótido -103 de la Figura 1.
9. El ADN aislado según la Reivindicación 1, en el que la secuencia es la secuencia desde el nucleótido +16 hasta
el nucleótido +36 de la Figura 1.
10. El ADN aislado según la Reivindicación 1, en el que la secuencia es la secuencia desde el nucleótido -1125
hasta el nucleótido -825 de la Figura 1.
11. Un vector recombinante que contiene la secuencia de nucleótidos de la Reivindicación 1.
40
12. Un vector recombinante que contiene la secuencia de nucleótidos de la Reivindicación 2.
13. Un organismo no humano transformado que contiene el vector de la Reivindicación 11 o de la Reivindicación
45
12.
14. Un ADN aislado con una secuencia que comprende el ADN de la reivindicación 1 unido operativamente a un
gen carcinogénico, oncogénico o inmortalizante.
50
55
15. Un mamífero no humano transgénico en el que todas sus células germinales y somáticas contienen un ADN
según la Reivindicación 1 ó 2, en el que dicho ADN se introdujo en el mamífero o en un ancestro del mamífero en una
etapa embrionaria.
16. Un procedimiento para el cultivo in vitro de células de mamífero, en el que las células se aíslan a partir del
mamífero de la Reivindicación 15.
17. El mamífero según la Reivindicación 15, en el que dicho mamífero es un ratón.
18. Un procedimiento según la Reivindicación 16, en el que dicho mamífero es un ratón.
60
19. Plásmido pSA9.
20. Plásmido pEA5.
65
21. Fago λβ2 del RnAC.
22. Una sonda de ácido nucleico que comprende la secuencia de ADN de la Reivindicación 1.
21
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23. Un complejo macromolecular que comprende un ADN de la Reivindicación 1 y una proteína.
24. Un procedimiento para el ensayo o la identificación de proteínas transcripcionalmente activas, en el que dicho
ADN de la reivindicación 1 se incuba en condiciones adecuadas con extractos nucleares.
5
25. El procedimiento según la Reivindicación 24, en el que el ADN es la secuencia de oligonucleótidos E-D, MutE o S-E.
10
15
20
25
30
26. Un procedimiento para aislar neuronas a partir de un tejido no humano que comprende proporcionar un mamífero transgénico según se reivindica en la Reivindicación 15, en el que la proteína codificada es un gen indicador,
identificar las neuronas que expresan el gen indicador y separar las neuronas que expresan el gen indicador de otras
células.
27. Un procedimiento para la asignación como objetivo de la expresión de un producto polipeptídico, proteico
o peptídico deseado en neuronas de un mamífero transgénico no humano que comprende reemplazar el gen de la
subunidad β2 del receptor nicotínico neuronal de la acetilcolina por el ADN que codifica el producto deseado en el
genoma del mamífero mediante recombinación homóloga, en el que dicho producto está codificado por una secuencia
de ADN.
28. El mamífero según la Reivindicación 15, en el que dicho ADN introducido en el mamífero o en un ancestro del
mamífero ha sido mutado mediante mutación puntual, deleción, inserción u otros medios, alterando así la actividad
del receptor nicotínico neuronal de la acetilcolina medida mediante un ensayo bioquímico o un ensayo conductista en
un mamífero transgénico.
29. Una línea celular producida a partir del mamífero de la Reivindicación 28.
30. Un ADN aislado que contiene un promotor de la subunidad β2 del receptor nicotínico neuronal de la acetilcolina que comprende la secuencia establecida en la figura 1, en el que dicho promotor ha sido mutado mediante
mutación puntual, deleción, inserción u otros medios, alterando así la expresión de la subunidad β2 del receptor nicotínico neuronal de la acetilcolina medida mediante un ensayo bioquímico o un ensayo conductista en un mamífero
transgénico.
31. El ADN aislado de la Reivindicación 30, que es un ADN mutado de la Reivindicación 1.
35
40
32. Una línea celular que comprende en su genoma una secuencia de nucleótidos foránea correspondiente al ADN
según se reivindica en una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 10, o 14.
33. Un procedimiento para identificar compuestos según su capacidad de restaurar o afectar de forma detectable a
la actividad del receptor nicotínico neuronal de la acetilcolina, que comprende añadir el compuesto a una línea celular
de la Reivindicación 29 o de la Reivindicación 32, o introducir el compuesto en un mamífero de la Reivindicación 28.
34. El ADN aislado de la Reivindicación 30, en el que dicho ADN evita la expresión de un receptor nicotínico de
la acetilcolina eficiente en un sistema de expresión y en un hospedador adecuados.
45
35. El mamífero transgénico según la Reivindicación 15, que puede generarse proporcionando un primer mamífero
portador de un ADN natural o mutado; y cruzando dicho primer animal con un segundo mamífero portador de un ADN
diferente y no idéntico.
50
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