Download Selección de bacterias ácido lácticas con potencial

Selección de bacterias ácido lácticas con potencial
probiótico de interés en el sector piscícola
Selection of lactic acid bacteria with probiotic potential of interest in the fish farming sector
Katherinn Ruiz M.1, Diana Paola Ortega F.1, José Luis Hoyos C.1 y Gerardo Andrés Torres2
RESUMEN
ABSTRACT
A pesar que la tilapia roja (Oreochromis spp.) es considerada
una especie resistente, en la etapa de alevinaje se presentan altas
mortalidades generadas por bacterias. Con el fin de controlar
estas enfermedades, es importante hallar alternativas que generen efectos benéficos en la salud del pez, tales como el uso de
microorganismos probióticos. Por tanto, el presente trabajo se
enfocó en determinar el potencial probiótico de bacterias ácido
lácticas (BAL) aisladas en un sistema de producción de tilapia
roja, por medio de resistencia a diferentes pH, sales biliares y antagonismo. Según los resultados obtenidos, se seleccionó la BAL
056 (Lactobacillus plantarum) por ser potencialmente probiótica.
Although the red tilapia (Oreochromis spp.) is considered a hardy
species, in the spawning grounds stage high mortalities generated
by bacteria are present; in order to control these diseases, it is
important to find alternatives to generate beneficial effects on
fish health, such as the use of probiotic microorganisms. Therefore, this study focused on determine the probiotic potential of
lactic acid bacteria (LAB) isolated in a production system of red
tilapia, through resistance tests at different pH, bile salts and
antagonism. According to the results the BAL 056 (Lactobacillus
plantarum) was selected as being potentially probiotic.
Palabras clave: antagonismo, tilapia roja, resistencia, sales
biliares, probiótico.
Key words: antagonism, red tilapia, resistance, bile salts,
probiotic.
Introducción
Dado el constante crecimiento del sector piscícola a nivel
nacional e internacional, en los últimos años se han buscado
opciones que permitan disminuir los costos de producción,
mantener los individuos libres de enfermedades y que no
provoquen efectos secundarios para los sistemas de producción. Una de estas estrategias consiste en el uso de microorganismos probióticos (Solieri et al., 2014; WHO, 2002), que
tienen la habilidad de inhibir o incluso eliminar bacterias
potencialmente patógenas. Los probióticos pueden ser obtenidos en casas comerciales, sin embargo, el uso de cepas
probióticas silvestres confiere una ventaja debido a que están
adaptadas a los procesos naturales propios del ecosistema.
Materiales y métodos
Bacterias estudiadas
Se obtuvieron nueve muestras de agua y dos muestras de
intestinos de los sistemas de producción de alevinos de
tilapia roja, en la zona de Mindalá, del municipio de Suarez
(Cauca). Diluciones seriadas de muestras de 1 mL de agua
y 1 g de muestra de intestino, se prepararon en agua de
peptona y se distribuyeron en el MRS solidificado (Man,
Rogosa y Sharpe), suplementado con azul de anilina para la
selección de bacterias acido-lácticas y se incubaron a 37°C
durante 48 h. Se obtuvieron cultivos puros de las colonias
aisladas en placas de agar MRS. Cada cultivo se estudió
para la investigación morfológica (tipo de colonia, color,
margen, elevación, tamaño, propiedad óptica) (Díaz, 2009).
Conservación de los aislamientos
Se tomó una colonia del aislamiento puro y se inoculó en
caldo MRS, se incubó y centrifugó a 4500 rpm por 15 min
en la centrífuga Hermle Z306 serie 16135004. La biomasa se
distribuyó en 4 viales, se adicionó 1 mL de glicerina al 15%v/v
y se almacenaron bajo condiciones de congelación (-20°C).
Determinación de las propiedades probióticas
Prueba de resistencia a diferentes pH
Se ajustó caldo MRS a pH 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0 y 7,0,
empleando ácido clorhídrico. Se tomó un mililitro de cada
bacteria, se inoculó en 9 mL de caldo MRS a los diferentes
pH, se incubaron y se realizó medición de absorbancia a 600
nm en el tiempo 0 y a las 24 h de incubación, con el fin de determinar el porcentaje de resistencia (Kumar y Kumar, 2015).
ISSN: 0120-9965 Fecha de recepción: 15-06-2016 Aceptado para publicación: 21-09-2016
Doi: 10.15446/agron.colomb.v34n1supl.58237
1
Grupo Aprovechamiento de Subproductos Agroindustriales (Asubagroin), Universidad del Cauca. Popayán (Colombia). jlhoyosc@yahoo.com
2
Grupo de Investigación en Microscopia y Análisis de Imágenes (GIMAI), Universidad del Cauca. Popayán (Colombia).
Agronomía Colombiana 34(1Supl.), S1009-S1012, 2016
% de resistencia =
% de resistencia =
DO en caldo MRS a diferentes pH
DO en caldo MRS control
incremento de DO en MRS con diferentes concentraciones sales
incremento de la DO en MRS sin modificación
Evaluación del potencial antagónico
Para desarrollar esta prueba, se emplearon las bacterias
patógenas: Pseudomona fluorecens, Aeromona hidrophyla
y Streptococcus agalactiae, las cuales se activaron en caldo
nutritivo y se incubaron a 35°C durante 18 h. Posteriormente, se sembraron masivamente en agar nutritivo (Muñoz
et al., 2014). Los aislamientos de bacterias acido-lácticas
se sembraron en caldo MRS y se incubaron durante 24 h,
se centrifugaron a 4.500 rpm durante 15 min para obtener sobrenadante. La bacteria patógena se expuso a tres
sendidiscos impregnados con sobrenadante, como control
negativo se utilizó caldo sin inocular; las cajas se incubaron
a 35°C durante 24 h. Una vez transcurrido este tiempo, se
midió el halo de inhibición que generaba cada aislamiento
(Muñoz et al., 2014; Zago et al., 2011).
Selección de BAL
Como criterios de selección, se tuvo en cuenta que las BAL
presentaran antagonismo y porcentaje de resistencia superiores a 50% y a pH inferiores a 4. Las BAL seleccionadas
se trataron con sales biliares.
Prueba de resistencia a diferentes
concentraciones de sales biliares
Se tomaron 0,2 mL de cada asilamiento en 10 mL de caldo
MRS con diferentes concentraciones de sales biliares: 0,3%
y 0,5 (w/v) y MRS sin bilis como control. Se incubaron y se
midió absorbancia a 600 nm en el tiempo 0 y 6 h de incubación, con el fin de determinar el porcentaje de resistencia
(Kumar y Kumar, 2015).
Caracterización bioquímica
Se realizó mediante sistemas miniaturizados API®, siguiendo las instrucciones del fabricante (Biomérieux).
Resultados y discusión
Se obtuvieron inicialmente treinta y seis aislados bacterianos de las muestras de agua e intestinos, recolectadas
en los sistemas de producción de alevinos de tilapia y el
agua de suministro. La caracterización de aislamientos se
realizó sobre la base de sus características morfológicas
y pruebas bioquímicas específicas para acido-lácticas.
S1010
(1)
100
(2)
100
Los aislamientos fueron conservados y depositados en la
colección de cepas del grupo de investigación Asubagroin,
adscrito al Laboratorio de Biotecnología la Universidad
del Cauca.
Descripción macroscópica y
microscópica de los aislamientos
Todas las BAL fueron gram positivas con morfologías
diferentes y agrupaciones, tales como: estreptobacilos,
cocobacilos, diplococos, bacilos cortos en dupla y bacilos.
Pruebas de selección
Prueba de resistencia a diferentes pH
De las 36 BAL aisladas, 20 de ellas presentaron resistencia
superior al 50% en pH inferiores a 4 (Tab. 1). Las BAL resistentes a pH bajos es un importante criterio de selección
(WHO, 2002), puesto que se requiere que estos sean viables
cuando lleguen al estómago del pez, en el cual se encuentran
las glándulas gástricas que producen la mayor parte del jugo
gástrico, lo que genera una disminución de pH hasta rangos
cercanos a 2 (Wilson y Castro, 2010). Investigaciones señalan que cepas caracterizadas como probióticos presentaron
resistencia a pH bajo (menor o igual a 3,0), considerándose
como resistentes a situaciones extremas (Solieri et al., 2014)
Prueba de antagonismo
Evaluación del potencial antagónico
Ningún aislamiento presentó inhibición frente a la bacteria
A. hidrophyla y S. agalactiae, sin embargo, como se muestra
en la figura 1, cuatro BAL codificadas como BAL 056, 076,
079 y 086 presentaron efecto inhibitorio frente a la bacteria
patógena P. fluorecens, con halos de inhibición de 2,63; 3,6;
3,15 y 2,7 mm, respectivamente. El anterior comportamiento puede estar dado porque los aislados, a pesar de producir
sustancias antibacteriales como peróxido de hidrógeno y
bacteriocinas (Muñoz et al., 2014), su concentración no fue
suficiente para desplazar las bacterias patógenas o estas no
eran sensibles a estas sustancias.
Prueba de resistencia a diferentes
concentraciones de sales biliares
Agron. Colomb. 34(1Supl.), 2016
TABLA 1. Resistencia a diferentes niveles de pH.
Resistencia a diferentes pH (%)
Como se muestra en la tabla 2, las cuatro BAL seleccionadas presentaron resistencia a sales biliares. Los resultados
obtenidos sugieren que las BAL, que presentaron una resistencia superior al 50%, tienen actividad metabólica que
permitirá la colonización del intestino (Perricone et al.,
2014), dado que en la parte anterior del mismo entran en
contacto directo con sales biliares (Lazo, 2000).
Bacteria
pH
pH2
pH3
pH4
pH5
pH7
BAL 052
3,3
2,8
64,0
95,2
100,0
58,0
BAL 054
0,0
0,0
63,9
89,0
100,0
54,5
BAL 056
0,0
35,6
57,7
88,6
100,0
58,8
BAL 058
0,0
5,0
62,2
88,8
100,0
61,3
BAL 059
0,0
0,3
56,6
95,0
100,0
71,6
BAL 061
1,4
0,7
51,9
76,0
96,8
98,4
BAL 063
1,0
1,5
56,3
80,1
85,2
96,6
BAL 064
0,2
1,5
53,9
71,8
83,5
96,7
BAL 068
0,1
0,5
52,0
75,5
80,2
100,0
BAL 070
1,8
1,4
54,2
71,8
81,5
98,1
BAL 079
37,8
17,4
BAL074
3,0
20,3
65,1
93,6
100,0
95,6
BAL 086
100,0
18,8
BAL077
2,8
14,3
62,5
91,1
100,0
93,3
BAL 056
77,9
7,2
BAL078
0,7
7,4
50,7
81,4
97,3
90,2
BAL079
3,3
14,2
58,3
83,2
100,0
85,7
BAL080
0,2
0,7
55,2
82,6
98,7
82,2
BAL082
0,4
0,7
54,9
83,4
100,0
84,6
BAL083
0,1
2,2
53,1
82,8
100,0
81,8
BAL084
2,4
9,7
64,0
91,5
100,0
81,2
BAL086
3,3
5,4
67,1
91,5
100,0
85,7
BAL088
0,4
8,5
52,2
83,1
75,0
84,2
TABLA 2. Porcentaje de resistencia a diferentes concentraciones de
sales biliares
Aislamiento
Resistencia a sales biliares
0,30% SB
0,50% SB
BAL 085
69,7
25,2
BAL076
100,0
20,1
A partir de los resultados obtenidos, se escogió la BAL
056 por ser acido-resistente, tolerante a sales biliares y con
características antagónicas frente a la bacteria patógena
aislada P. fluorecens, que provoca septicemia hemorrágica
y exoftalmia.
Caracterización bioquímica
FIGURA 1. Halos de inhibición de BAL frente a la bacteria patógena P. fluorecens.
Ruiz M., Ortega F., Hoyos C. y Torres: Selección de bacterias ácido lácticas con potencial probiótico de interés en el sector piscícola
S1011
Según la lectura de la prueba API 50 CH (Fig. 2), se obtuvo
que la BAL 056 seleccionada corresponde a Lactobacillus
plantarum, bacteria reportada comúnmente como cepa
probiótica.
Agradecimientos
Los autores agradecen a la Universidad del Cauca y a Colciencias por la financiación de esta investigación.
Literatura citada
Díaz, G. 2009. Fundamentos y técnicas de análisis microbiológicos: morfología y estructura bacteriana. Morfología y estructura bacteriana. En: https://microbitos.files.wordpress.
com/2010/06/morfologia-y-estructura-bacteriana.pdf; consulta: abril de 2016.
Kumar, A. y D. Kumar. 2015. Characterization of Lactobacillus
isolated from dairy samples for probiotic propetiers. Anaerobe
33, 117-123. Doi: 10.1016/j.anaerobe.2015.03.004
Lazo, J.P. 2000. Conocimiento actual y nuevas perspectivas en el
desarrollo de dietas para larvas de peces marinos. pp. V 19-22.
Memorias del V Simposio Internacional de Nutrición Acuícola
- Avances en Nutrición Acuícola, Mérida, Yucatan, México.
Muñoz, E., C. Araújo, S. Magadán, P.E. Hernández, C. Herranz, Y.
Santos y L.M. Cintas. 2014. In vitro and in vivo evaluation of
lactic acid bacteria of aquatic origin as probiotics for turbot
(Scophthalmus maximus L.) farming. Fish Shellfish Immun.
41(2), 570-580.
Perricone, M., A. Bevilacqua, M.R. Corbo y M. Sinigaglia. 2014.
Technological characterization and probiotic traits of yeasts
isolate from Altamura sourdough to select promising microorganisms as functional starter cultures for cereal-based products. Food Microbiol. 38, 26-35. Doi: 10.1016/j.fm.2013.08.006
Solieri, L., A. Bianchi, G. Mottolese, F. Lemmetti y P. Giudici. 2014.
Tailoring the probiotic potential of non-Starter Lactobacillus
strains from ripened Parmigiano reggiano cheese by In vitro
screening and principal component analysis. Food Microbiol.
38, 240-249. Doi: 10.1016/j.fm.2013.10.003
FIGURA 2. Resultado de pruebas API.
Conclusiones
El agua de los sistemas de producción y el intestino de
tilapia roja albergan bacterias ácido lácticas, de las cuales
el 11% de las BAL aisladas presentan potencial probiótico.
Sin embargo, solo la BAL 056 (Lactobacillus plantarum)
presentó las mejores características, por tal razón tiene
potencial en el desarrollo de productos probióticos para la
agroindustria piscícola.
S1012
Wilson, J.M. y L.F.C. Castro. 2010. Morphological diversity of the
gastrointestinal tract in fishes. Fish Physiol. 30.1-55. Doi:
10.1016/S1546-5098(10)03001-3
WHO - World Health Organization. 2002. Guidelines for the evaluation of probiotics in food. Report of a joint FAO/WHO working
group on drafting guidelines for the evaluation of probiotics
in food. Food and Agriculture Organization. En: http://www.
who.int/foodsafety/fs_management/en/probiotic_guidelines.
pdf; consulta: marzo de 2015.
Zago, M., M.E. Fornasari, D. Carminati, P. Burns, V. Suàrez, G.
Vinderola, J. Reinheimer y G. Giraffa. 2011. Characterization
and probiotic potential of Lactobacillus plantarum strains
isolated from cheeses. Food Microbiol. 28, 1033-1040. Doi:
10.1016/j.fm.2011.02.009
Agron. Colomb. 34(1Supl.), 2016