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RESPIRATORY VIRAL SCREENING MAb
ACRES: Kit para tinción de adenovirus, influenza A y B, virus sincitial
respiratorio y parainfluenza 1, 2 y 3 mediante técnica de
inmunofluorescencia.
La infección por virus de la gripe puede ser diagnosticada en el laboratorio
por métodos directos (detección de antígeno en muestras directa, técnicas
de cultivo celular y detección de ácidos nucleicos) o mediante pruebas
serológicas para medir la presencia de anticuerpos IgM o el aumento de los
títulos de IgG. Varias líneas celulares epiteliales continuas, concretamente
la MDCK, son útiles para el aislamiento primario. Las células MDCK
establemente transfectadas para expresar receptores de ácido siálico en
enlace α-2,6 parecen ser útiles para pruebas de susceptibilidad in vitro y
para aislamiento de virus de muestras clínicas.
RSV
Técnica de tinción para detección directa en muestras: 60 test.
El virus sincitial respiratorio (RSV) es la mayor causa de bronquiolitis y
neumonía en niños, y está asociado con tasas altas de morbilidad y
mortalidad.
INTRODUCCIÓN:
Adenovirus
Los adenovirus están muy relacionados con infecciones del tracto
respiratorio y conjuntivales y están presentes en el 5 al 8% de todas las
infecciones respiratorias pediátricas. Los adenovirus son también una
causa importante de diarrea infantil. También se han relacionado con
meningitis aséptica, encefalitis, hepatitis y cistitis hemorrágica y son
reconocidos cada vez más como una importante causa de morbilidad y
mortalidad en receptores de trasplantes de órganos sólidos y células madre.
Los Adenovirus han sido aislados de heces, escobillones de garganta,
aspirados nasofaríngeos, escobillones o raspados conjuntivales, orina,
líquido cefalorraquídeo, sangre y una variedad de muestras de biopsia. Las
muestras deben ser recogidas preferiblemente en la primera semana del
inicio de la enfermedad.
La infección por adenovirus puede ser diagnosticada en el laboratorio por
métodos directos (detección de antígeno en muestras directa, técnicas de
cultivo celular y detección de ácidos nucleicos) o mediante pruebas
serológicas para medir la presencia de anticuerpos IgM o el aumento de los
títulos de IgG. Todos los serotipos de los adenovirus, excepto el 40 y el 41,
crecen bien y producen efecto citopático en una variedad de células
epiteliales humanas, tales como A549, HeLa, HEp-2, KB, y MRC-5.
Algunas cepas de los serotipos entéricos 40 y 41 crecen la línea celular
Graham 293.
En climas templados, RSV produce epidemias anuales de bronquiolitis en
niños; en áreas tropicales, este carácter epidémico está menos claramente
marcado.
Generalmente predominan las infecciones por el subgrupo A de RSV, pero
a veces las infecciones por el subgrupo B son más prevalentes.
El lavado o aspirado nasal es el tipo de muestra preferida para el
diagnóstico de RSV en niños. La cantidad de RSV presente en muestras de
lavado nasal de niños pequeños es muy alta , entre 10³ y 108 PFU/ml. Las
muestras de adultos son menos sensibles debido a una menor carga viral.
Otras muestras clínicas útiles para la detección de RSV son los aspirados
endotraqueales, lavados broncoalveolares, raspados de la mucosa epitelial
nasal y tejido pulmonar.
La infección por RSV puede ser diagnosticada en el laboratorio por
métodos directos (detección de antígeno en muestras directa, técnicas de
cultivo celular y detección de ácidos nucleicos) o mediante pruebas
serológicas para medir la presencia de anticuerpos IgM o el aumento de los
títulos de IgG. Las líneas celulares heteroploides HEp-2 o Vero son usadas
en muchos laboratorios para el cultivo de RSV.
Parainfluenza
Los virus parainfluenza (PIV) tipo 1, 2 y 3 son la mayor causa de crup o
laringotraqueobronquitis en niños.
Influenza
Los virus de la gripe son únicos entre los virus debido a su variabilidad
antigénica, estacionalidad, e impacto sobre la población general. Pueden
causar brotes epidémicos de enfermedad respiratoria febril en todos los
grupos de edad y a menudo con una mortalidad elevada, particularmente
en personas de edad avanzada y con enfermedad crónica.
Los virus influenza incluyen tres tipos: A, B y C. Los subtipos ocurren
sólo dentro de los virus influenza A. La división en subtipos se basa en la
variabilidad de los genes de la hemaglutinina (HA) y la neuraminidasa
(NA). Tres subtipos HA (H1, H2, y H3) y 2 subtipos NA (N1 y N2) han
causado importantes brotes en humanos.
El inicio de la actividad de la gripe va de Octubre a Abril en el hemisferio
norte, pero normalmente el pico está entre Diciembre y Marzo. En el
hemisferio sur el pico tiene lugar normalmente entre Mayo y Agosto.
A veces se producen olas sucesivas y solapadas de infecciones por
diferentes subtipos de virus influenza A e influenza B prolongando el
periodo de actividad de la gripe. Los virus influenza B causan epidemias
generalizadas cada 3 ó 4 años, pero pueden cocircular 2 ó 3 virus
influenza A (H3 y H1) en una misma estación. Los virus influenza C
normalmente representan <1% de los casos.
Los virus influenza pueden ser fácilmente aislados al inicio de la
enfermedad a partir de varias muestras respiratorias, incluyendo nariz y
garganta, aspirados o lavados nasales, esputos, y aspirados traqueales. Los
escobillones o lavados de garganta contienen menor concentración de virus
y son generalmente menos sensibles.
El PIV tipo 1 causa crup epidémico cada año. Las infecciones del PIV tipo
2 generalmente siguen el mismo patrón que el PIV tipo 1, pero con
manifestaciones más suaves. El PIV tipo 3 es el menos predecible: las
infecciones siguen un patrón endémico la mayoría de las veces, con brotes
esporádicos, generalmente en primavera.
El tipo de muestra preferida para el diagnóstico de PIV en niños es el
lavado o aspirado nasal.
Las muestras de adultos son menos sensibles que las de niños debido a una
menor carga viral. Otras muestras clínicas útiles para la detección de PIV
son los aspirados traqueales, lavados broncoalveolares, raspados de
mucosa epitelial nasal y tejido pulmonar.
La infección por PIV puede ser diagnosticada en el laboratorio por
métodos directos (detección de antígeno en muestras directa, técnicas de
cultivo celular y detección de ácidos nucleicos) o mediante pruebas
serológicas para medir la presencia de anticuerpos IgM o el aumento de los
títulos de IgG. Para el aislamiento de PIV en el laboratorio clínico se
emplea las líneas celulares de mono LLC-MK2.
FUNDAMENTO DEL MÉTODO:
El método de inmunofluorescencia está basado en la reacción de los
anticuerpos específicos contenidos en el kit con el antígeno de la muestra.
Los anticuerpos reaccionan con el antígeno y los no unidos son eliminados
con el lavado. El complejo antígeno-anticuerpo es visualizado gracias a la
fluoresceína que está conjugada al anticuerpo bien directamente bien
mediante un conjugado secundario.
PRODUCTO PARA DIAGNOSTICO IN VITRO
Fabricante: VIRCELL, S.L. Pza. Dominguez Ortiz 1. Polígono Industrial Dos de Octubre.18320 Santa Fe *GRANADA* SPAIN* Tel.+34.958.441264* Fax+34.958.510712
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2.
CARACTERÍSTICAS:
Todos los reactivos a excepción del VIRCELL PBS 2 vienen listos para su
uso. Los componentes del equipo se presentan numerados para facilitar su
identificación inequívoca. En el Procedimiento del Ensayo se indican los
números de los reactivos que han de utilizarse en cada etapa.
CONTENIDO DEL KIT:
1 VIRCELL VIRAL SCREENING FITC-MAb: 1 ml de una mezcla de
anticuerpos monoclonales marcados con isotiocianato de fluoresceína
frente a:
-nucleoproteína del virus de la influenza A
-hemaglutinina del virus de la influenza B
-antígeno común de hexón de adenovirus
-proteína F de parainfluenza 1
-hemaglutinina de parainfluenza 2 y 3
-nucleoproteína de RSV
diluidos en una solución tampón con fosfatos, seroalbúmina bovina, azida
sódica y Azul de Evans como contracolorante.
2 VIRCELL PBS: 1 vial para preparar 1 l de PBS pH 7,2.
3 VIRCELL VIRAL SCREENING CONTROL: 2 portaobjetos de control
positivo conteniendo cada uno dos filas de antígenos en las siguientes
posiciones:
-Pocillo 1 y 6: Virus sincitial respiratorio crecido en células HEp-2.
-Pocillo 2 y 7: Virus influenza A crecido en células MDCK.
-Pocillo 3 y 8: Virus influenza b crecido en células MDCK.
-Pocillo 4 y 9: Virus parainfluenza 1, 2 y 3 crecido en células LLC-MK2.
-Pocillo 5 y 10: Adenovirus crecido en células HEp-2.
6 VIRCELL MOUNTING MEDIUM: 3 ml de medio de montaje: glicerol
tamponado (contiene azida sódica).
Material necesario no contenido en el kit.
-Pipetas de precisión adecuadas.
-Centrífuga de cabezal oscilante que alcance al menos 1500 g.
-Incubador termostatizado.
-Agua destilada.
-Cubreobjetos de 24x60 mm.
-Microscopio de fluorescencia y filtros apropiados según recomendaciones
del fabricante.
-DPX.
-Cámara húmeda.
CONSERVACIÓN:
Conservar entre 2 y 8ºC. No utilizar los componentes del kit después de la
fecha de caducidad. La caducidad indicada será válida siempre que los
componentes se mantengan cerrados y conservados a la temperatura
indicada.
CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD DE LOS COMPONENTES
UNA VEZ ABIERTOS:
COMPONENTE
PBS reconstituido
Resto de componentes
ESTABILIDAD
4 meses a 2-8ºC, siempre dentro de su fecha de
caducidad
Fecha indicada en envase a 2-8ºC
ESTABILIDAD Y USO DE LOS REACTIVOS:
Usar todos los reactivos en condiciones asépticas para evitar
contaminaciones microbianas.
Utilizar sólo la cantidad de cada componente necesaria para la realización
de la prueba. No devolver a los viales el exceso sobrante.
VIRCELL SL no se responsabiliza de la inadecuada utilización de los
reactivos contenidos en el kit.
RECOMENDACIONES Y PRECAUCIONES:
1.
Este producto es sólo para diagnóstico in vitro y está destinado al uso
por personal sanitario cualificado.
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Usar sólo componentes del kit. No mezclar los componentes de
diferentes kits o fabricantes. Sólo el VIRCELL PBS y el VIRCELL
MOUNTING MEDIUM son compatibles con los equivalentes en
otras referencias y lotes de MAb VIRCELL. El resto de los
componentes son compatibles entre distintos equipos cuando
coincida el lote.
Utilizar puntas de pipeta diferentes y limpias para cada fase del
ensayo. Utilizar sólo material limpio y preferentemente desechable.
No utilizar en caso de deterioro del envase.
No pipetear con la boca.
El VIRCELL FITC-MAb de este equipo contienen material de origen
animal. El VIRCELL CONTROL contiene antígenos fijados. Las
muestras procesadas pueden contener microorganismos infecciosos;
es necesario manejar el VIRCELL CONTROL y las muestras del
paciente como potencialmente patógenos. Ningún método actual
puede asegurar por completo la ausencia de agentes infecciosos.
Todo el material debe ser manipulado y desechado como
potencialmente infeccioso. Observe la regulación local en materia de
residuos clínicos.
Por contener azida sódica (concentración <0,1%), debe evitarse el
contacto del VIRCELL FITC-MAb y el VIRCELL MOUNTING
MEDIUM con ácidos y metales pesados.
Por contener glicerol, debe evitarse el contacto del VIRCELL
MOUNTING MEDIUM con ácidos. No exponer a temperaturas
elevadas.
El Azul de Evans (concentración <0,1%), es cancerígeno. Evite el
contacto con la piel o los ojos. En caso de contacto lavar la superficie
afectada con agua y solicitar asistencia médica.
Use únicamente los protocolos descritos en este prospecto. Si los
intervalos o temperaturas de incubación empleados en la prueba no
son los especificados, los resultados pueden ser erróneos.
La óptica del microscopio, el mantenimiento y el tipo de fuente de
luz pueden afectar la calidad de la fluorescencia.
No dejar los reactivos a temperatura ambiente más tiempo del
absolutamente necesario.
El kit contiene elementos de vidrio que en caso de rotura podrían
provocar lesiones físicas. Manipular con precaución.
PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS:
El único reactivo que es necesario preparar con antelación a la realización
de la prueba es el VIRCELL PBS 2. Para ello, agregar el contenido del
vial 2 a 1 litro de agua destilada y agitar hasta completa disolución. Una
vez preparada conservar entre 2 y 8ºC.
PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO:
TÉCNICA DE TINCIÓN PARA DETECCIÓN DIRECTA EN
MUESTRAS
Las muestras para detección directa podrían ser escobillones
nasofaríngeos, escobillones faríngeos, lavados broncoalveolares, lavados
bronquiales y aspirados nasofaríngeos.
Las muestras en escobillón deben transportarse en 1 o 2 ml de medio de
transporte . No prepare portaobjetos a partir de escobillones secos.
Las muestras fluidas deben recogerse en contenedores estériles.
Si las muestras no son procesadas inmediatamente, conservar entre 2ºC y
8ºC hasta máximo de 48 horas. Para periodos más prolongados conservar
netre -70ºC y -90ºC.
PREPARACIÓN DE SPOT DE CÉLULAS
A.-Aspirados o fluidos con células:
1.-Transferir la muestra a un tubo de centrífuga cónico y centrifugar a 300500 g durante 10 minutos a 2-8ºC.
2.-Retirar y descartar el sobrenadante, incluido el moco que puede rodear
el botón de células.
3.-Golpear el tubo suavemente para soltar las células, añadir PBS y
resuspender las células pipeteando suavemente.
4.-Repetir la centrifugación.
5.-Retirar y descartar el sobrenadante.
6.-Golpear el tubo y añadir suficiente PBS para obtener una suspensión
celular opalescente.
PRODUCTO PARA DIAGNOSTICO IN VITRO
Fabricante: VIRCELL, S.L. Pza. Dominguez Ortiz 1. Polígono Industrial Dos de Octubre.18320 Santa Fe *GRANADA* SPAIN* Tel.+34.958.441264* Fax+34.958.510712
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7.-Poner aproximadamente 5-15 µl de la suspensión celular en un pocillo
de un portaobjetos recubierto de Teflon y observar al microscopio para
asegurar que la concentración celular es adecuada.
8.-Dejar secar el portaobjetos completamente a temperatura ambiente.
9.-Fijar las células introduciendo el portaobjetos en un baño de acetona
durante 10 minutos a 2-8ºC.
10.-Sacar los portaobjetos de la acetona y dejar secar completamente a
temperatura ambiente.
B.-Escobillones:
1.- Estas muestras deben transportarse en medio de transporte. Agitar en un
Vortex el tubo que contiene el escobillón para desprender las células.
2.-Continuar el protocolo que describe el apartado A anterior.
Los portaobjetos pueden conservarse durante 2 o 3 dias a 2-8ºC en un
recipiente hermético con desecante o a temperatura inferior a –20ºC para
almacenamientos más prolongados. Antes de sacar el portaobjetos del
recipiente, dejar que alcance temperatura ambiente.
PROCEDIMIENTO DE TINCIÓN
1.-Añadir 15 µl de VIRCELL FITC-MAb 1 a cada pocillo e incubar
durante 30 minutos a 36-38ºC en cámara húmeda.
2.-Lavar con PBS durante 10 minutos.
3.-Secar y añadir una gota de VIRCELL MOUNTING MEDIUM 6.
Colocar un cubreobjetos y presionar suavemente para eliminar burbujas.
4.-Observar al microscopio de fluorescencia a 400 x.
CONTROL DE CALIDAD INTERNO:
Cada lote se somete a Control de Calidad Interno antes de su liberación.
Nº
MUESTRAS
57
55
55
60
56
52
Adenovirus
Influenza A y B
RSV
Parainfluenza 1
Parainfluenza 2
Parainfluenza 3
SENSIBILIDAD
ESPECIFICIDAD
94,7%
94,7%
95%
94,4%
94,7%
94,7%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
PRECISIÓN INTRAENSAYO
Se ensayaron 7 muestras, (1 positiva para cada patógeno y 1 negativa),
ensayadas individualmente en grupos de 5 en un único ensayo realizado
por el mismo operador en condiciones de trabajo idénticas.
En todos los ensayos se observaron resultados similares.
PRECISIÓN INTERENSAYO
Se ensayaron 7 muestras, (1 positiva para cada patógeno y 1 negativa),
ensayadas individualmente en 5 condiciones diferentes en las que variaron
el operador o el día de realización.
En todos los ensayos se observaron resultados similares.
REACCIÓN CRUZADA E INTERFERENCIAS
Se ensayaron muestras caracterizadas positivas frente a otros
microorganismos del grupo sindrómico (Chlamydia trachomatis y
Chlamydophila pneumoniae).
Las muestras ensayadas dieron resultados negativos, demostrando la
reacción específica del ensayo sin reacción cruzada o interferencias
ocasionadas por los agentes descritos.
SÍMBOLOS UTILIZADOS EN EL PRODUCTO:
PROTOCOLO DE VALIDACIÓN POR EL USUARIO:
Un control positivo debe incluirse para comprobar el correcto
funcionamiento del test cada vez que un nuevo kit es abierto. Su utilización
permite la validación de la prueba y el equipo.
El modelo de fluorescencia que debe observarse será:
Control positivo: células fluorescentes verde manzana y aspecto
característico.
Producto para el diagnóstico in vitro
Fecha de caducidad
Conservar entre x-yºC
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:
Una muestra positiva es aquella en que una o más células intactas
muestran un patrón de fluorescencia verde manzana característica con una
intensidad igual o superior a 2+.
Una muestra negativa es aquella que contiene un adecuado número de
células típicas y en la que todas ellas muestran una mínima fluorescencia
(<1) o ausencia de fluorescencia (0).
Las muestras con una tinción débil y/o una sola célula positiva deben ser
consideradas dudosas.
Una muestra inválida es aquella que presenta una fuerte tinción no
específica o contiene demasiadas pocas células intactas.
Las muestras deben contener varias células en varios campos 100x.
Contiene suficiente para <X> pruebas
Lote
Referencia (catálogo)
Consultar instrucciones de uso
<X> pocillos
LIMITACIONES DEL MÉTODO:
1.-El uso de este kit requiere la cuidadosa lectura y comprensión del folleto
de instrucciones. Es necesario seguir estrictamente el protocolo para
obtener resultados fiables.
2.-Un resultado negativo no excluye una infección.
3.-Los resultados de las muestras deben ser valorados junto con la
sintomatología clínica y otros procedimientos diagnósticos.
PRESTACIONES:
SENSIBILIDAD Y ESPECIFICIDAD
Se ensayaron muestras con RESPIRATORY VIRAL SCREENING MAb
frente a un equipo de otra casa comercial, obteniendo los siguientes
resultados:
BIBLIOGRAFÍA:
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REVISADO: 05/2013
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