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PRÁCTICAS DE GENÉTICA Y
BIOTECNOLOGÍA AMBIENTAL
Cuaderno del alumno
Universidad Rey Juan Carlos.
Escuela Superior de Ciencias Experimentales y
Tecnología.
Prácticas de Genética y BTA
Prácticas de Genética y Biotecnología Ambiental.
3er Curso de CC. Ambientales.
NORMAS GENERALES
1. El uso de la bata es obligatorio.
2. Está absolutamente prohibido fumar o comer en el laboratorio.
3. Está absolutamente prohibido pipetear con la boca.
4. Leer cuidadosamente el guión que corresponda antes del comienzo de cada
práctica.
5. Las prácticas serán evaluadas mediante examen al final de las mismas.
6. Mantener limpio el puesto de trabajo durante el desarrollo de las prácticas, y
una vez acabadas limpiarlo completamente.
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PROGRAMA A DESARROLLAR
Sesión I.
-Introducción a las técnicas bioquímicas y microbiológicas utilizadas en
estas prácticas.
-Transformación de bacterias de E. coli con DNA plasmídico y siembra en un
medio sólido selectivo (Protocolo 1).
Sesión II.
-Comprobación de la aparición de colonias de bacterias resistentes en la
placa de antibiótico (eficacia de la transformación). Siembra de una colonia
en medio líquido selectivo.
-Mutagénesis producida por irradiación ultravioleta. El sistema de
reparación del ADN (Protocolo 2).
Sesión III.
-Seguimiento del efecto de la irradiación con UV de las placas de colonia de
bacterias mutantes carentes del sistema de reparación de ADN, y de
bacterias de una cepa salvaje.
-Purificación del ADN plasmídico contenido en las bacterias transformadas
(Protocolo 3).
Sesión IV.
-Incubación del plásmido obtenido con enzimas de restricción (Protocolo 4).
-Separación del plásmido en forma de ADN circular, o cortado con enzimas
de restricción, mediante electroforesis en gel de agarosa (Protocolo 5).
-Discusión general sobre los resultados obtenidos a lo largo de las prácticas.
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SESION I.
TRANSFORMACION
DE
BACTERIAS
CON
DNA
PLASMIDICO
Y
SELECCION DE CLONES QUE HAN INCORPORADO EL PLASMIDO
RECOMBINANTE.
Introducción.
El proceso por el cual un vector plasmídico es introducido y mantenido
de forma estable en una bacteria se denomina transformación. En la
bacteria Escherichia coli este proceso no ocurre de forma natural y ha de
inducirse en el laboratorio. Para facilitar este proceso, se tratan las
bacterias con calcio incubando en frío (a unos 4º C) lo cual estimula la
apertura de poros que facilitan la entrada de DNA exógeno. A estas
bacterias susceptibles de incorporar DNA exógeno las denominamos
bacterias competentes. El vector plasmídico que usaremos en el ensayo de
transformación será el plámido pBluescript (denominado de forma abreviada
pBl).
La introducción de DNA exógeno en las bacterias competentes es un
proceso muy ineficaz, y por ello es necesario utilizar un método que nos
permita identificar al reducido número de bacterias que han incorporado y
mantenido de forma estable el plásmido con el que las hemos transformado.
Con este objetivo a los plásmidos se les ha dotado de un sistema de
selección, que en el caso de pBL consiste en un
gen de resistencia a
ampicilina. Este gen confiere a las bacterias transformadas con el plásmido
un fenotipo fácilmente diferenciable: sólo las bacterias que han incorporado
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el plásmido serán capaces de crecer en presencia del antibiótico ampicilina
cuando son sembradas en una placa petri conteniendo medio de cultivo con
el mencionado antibiótico.
Figura 1. Esquema del vector plasmídico p Bluescript II sk (-) donde
aparecen indicados su origen de replicación (pUC ori), el gen que confiere a
la bacteria resistencia a la ampicilina (ampicillin), el origen de replicación del
bacteriófago filamentoso f1 (f1 (-) ori) el promotor del gen lac (P lac), el gen
lacZ que codigica para la b-Galactosidasa (lacZ) Y el sitio de clonaje
múltiple (MCS), que aparece descrito con mayor detalle debajo del esquema
del vector.
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PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL.
A) MEDIOS Y SOLUCIONES
Medio de cultivo LB: Extracto de levadura, 5 g; Bactotriptona, 10 g;
ClNa, 10 g; H2O hasta 1 l; NaOH, ajustar a pH 6,1
Buffer de transformación y almacenamiento (TSB): medio de cultivo
LB a pH 6.1, conteniendo un 10% de polietilen glicol (PEG), 5% de
dimetilsulfóxido (DMSO) y 20 mM de Mg++ (10 mM de MgCl2 +10 mM de
MgSO4).
Buffer TSB-glucosa: Buffer TSB conteniendo glucosa 20 mM
Tris-EDTA (TE): Tris (base) 10 mM; EDTA-Na2, 1 mM; ClH, ajustar a
pH 8,0.
Tampón de muestras: glicerol 80 ml, 27 %; azul de bromofenol 0,25 g,
0,08 %; H2O hasta 300 ml.
Tampón de electroforesis Tris-Borato-EDTA o (TBE): Tris base 10,8
g; ácido bórico 5,5 g; EDTA 0,5 M pH 8.0, 4 ml; H2O hasta 1 litro.
B) PRECAUCIONES GENERALES
Manipulación de material y soluciones estériles: Las asas de siembra,
las puntas de micropipeta, las placas de agar, las soluciones de IPTG y XGal, y el medio de cultivo LB deben mantenerse estériles. Mantener
abiertos los tubos y placas solo el tiempo mínimo imprescindible. No tocar
con los dedos ni con ningún otro material presuntamente contaminado
(mesa, etc.) las puntas de micropipeta.
Manipulación de bacterias competentes: El tubo que contiene las
bacterias competentes debe mantenerse en hielo en todo momento,
excepto para el choque térmico a 42 °C y la incubación a 37 °C. Las
bacterias competentes tienen una resistencia mecánica menor que las
normales: no agitar con fuerza.
Manipulación de compuestos químicos: El Bromuro de Etidio es una
sustancia mutagénica, por lo que es absolutamente imprescindible el
utilizar guantes cuando se hagan los geles de agarosa. No tocar nunca los
geles directamente con las manos sin proteger.
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PROTOCOLO 1.
Transformación de bacterias competentes con DNA de plásmidos.
1.
Marcar una identificacion del grupo de trabajo en el tubo de bacterias
competentes.
2. Pipetear 2 µl (25 ng) de la solución de DNA plasmídico con micropipeta
de 20 µl en el tubo de las bacterias competentes. Mezclar lentamente y
con cuidado (las bacterias competentes son muy frágiles). Poner el tubo
en hielo durante 15 minutos.
3. Marcar la placa de LB/agar + ampicilina con identificación del grupo, el
día de la semana y la fecha.
4. Transcurridos los 15 minutos de incubación en hielo, poner el tubo de
bacterias competentes en un baño de agua a 42 °C durante 2 minutos.
5. Introducir inmediatamente el tubo con bacterias competentes en el
recipiente que contiene el hielo.
6. Pipetear 900 µl de buffer TSB-glucosa -precalentado a 37 °C- con una
micropipeta
de 1 ml y añadir los 900 µl al tubo de bacterias
transformadas. Cerrar el tubo y mezclar invirtiéndolo con cuidado.
Incubar el tubo en un baño de agua a 37 °C durante 30 minutos.
7. Sumergir el asa de siembra en etanol y secar al aire. Mezclar por
inversión el cultivo contenido en el tubo de bacterias competentes (las
bacterias E. coli no son móviles y tienden a sedimentar en cultivos no
mantenidos en agitación).
8. Pipetear 100 µl del cultivo sobre la superficie de agar de la placa de
LB/agar + ampicilina. Con el asa de siembra, extender los 100 µl sobre
toda la superficie de agar.
9. Poner la placa boca abajo en la estufa incubadora a 37 °C. Las placas se
dejarán incubando a 37 °C durante toda la noche.
Al día siguiente se comprueba si en la placa han crecido colonias. Si la
siembra de las bacterias sobre la superficie de la placa se realizó el día
anterior de manera homogénea, las colonias crecidas mostrarán una
distribución uniforme sobre toda la superficie de la placa.
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Sesión I: Observaciones y comentarios.
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SESION II
ACCION MUTAGENICA DE LA RADIACION ULTRAVIOLETA.
La acción mutagénica de la radiación utltravioleta se debe a que este agente
físico induce la formación de dímeros de timina en la secuencia del ADN.
Los organismos disponen de mecanismos de reparación del ADN, que
eliminan tales dímeros e impiden que este fenómeno produzca graves
alteraciones en la estructura y función del ADN. Sin embargo es éste
actualmente un tema de gran interés ambiental, por cuanto es sabido que la
capa de ozono que rodea la Tierra ha disminuido, provocando un aumento en
la magnitud de la radiación
UV que alcanza la superficie terrestre;
paralelamente, se ha observado un aumento en la incidencia de cánceres de
piel y de ojo.
-BACTERIAS SENSIBLES A LA RADIACIÓN ULTRAVIOLETA.
En esta práctica se trata de analizar la sensibilidad de diferentes cepas de
la bacteria Escherichia coli a la luz UV. Disponemos de dos cepas de tipo
silvestre (E. coli OV2 y E. coli MC1061) que posee los mecanismos normales
de reparación de DNA de esta bacteria y que es, por ello, resistentes a la
acción de la luz ultravioleta. Además, disponemos de cepas derivada de las
anteriores (E. coli OV2 recA Tn10 y E. coli MC1061 recA Tn10) en la que una
mutación producida por inserción de un transposón Tn10 ha inutilizado el
gen recA. Dado que este gen está involucrado en uno de los mecanismos
principales de reparación de lesiones del ADN producidas por UV, las
bacterias mutantes tienen una sensibilidad a UV extremadamente alta, que
les impide sobrevivir tras exponerlas a dosis moderadas de radiación UV.
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PROTOCOLO 2.
1. Cada grupo de trabajo recibirá cuatro placas de Petri, sobre cuya
superficie se sembrarán -en dos áreas perfectamente delimitadas- un
inóculo de bacterias OV2 y MC1061, y de bacterias OV2 recA Tn 10 y
MC1061 recA Tn10, que se han mantenido en oscuridad.
2. Las bacterias sembradas en las placas de cultivo se iluminan con luz UV en
un transiluminador aplicando diferentes dosis de radiación (0,001-0,005
Julios/ cm).
3. Se depositan todas las placas del paso anterior en el incubador a 37º C, y
se mantienen hasta el dia siguiente, en que se analizarán los resultados
Sesión II: Condiciones experimentales empleadas por el grupo de
trabajo.
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Sesión II: Aspecto de las colonias obtenidas en las placas petri
irradiadas con luz U.V.
0.001 J/Cm2
0.005 J/Cm2
OV2 y OV2 recA Tn 10,
0.001 J/Cm2
0.005 J/Cm2
MC1061 y MC1061 recA Tn10
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SESION III
PURIFICACION DE DNA PLASMIDICO.
Se inoculará en medio líquido una colonia (bacterias descendientes de
una única célula inicial) en medio líquido de crecimiento. El DNA plasmídico
se replica utilizando la maquinaria de la bacteria y el origen de replicación
del plásmido (ORI). El número de copias de plásmido por bacteria puede
llegar a ser muy elevado. A partir de estos cultivos líquidos de bacterias
provenientes de una única bacteria portadora del plásmido recombinante, se
obtiene el DNA plasmídico utilizando el protocolo 3, que nos permitirá
separarlo del DNA bacteriano.
PROTOCOLO 3.
Minipreparación de DNA plasmídico.
1.
Marcar un tubo de minicentrífuga para identificar el grupo de trabajo.
2. Pipetear 1,5 ml del cultivo en un tubo de minicentrífuga (tres veces 500
µl).
3. Centrifugar durante 1 min. en una minicentrífuga.
4. Extraer el sobrenadante con una pipeta "Pasteur", procurando dejar las
bacterias lo más secas posibles.
5. Poner el tubo en hielo.
6. Pipetear 250 µl de disolución de resuspensión (contiene tampón/RNasa)
que se encuentra en el frasco de tapón blanco. Resuspender las
bacterias agitándolas hasta que la suspensión sea totalmente
homogénea.
7. Pipetear 250 µl de disolución de lisis (en el frasco de tapón rojo) sobre
la suspensión de bacterias, mezclando con suavidad por inversión del
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tubo 3-6 veces. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
Transcurrido ese tiempo, la solución se vuelve viscosa y clara.
8. Añadir 350 µl de solución tampón de fijación (o binding buffer
contenido en el frasco de tapón verde), previamente enfriado en hielo.
Mezclar suavemente por inversión del tubo unas 3-6 veces. Incubr los
tubos durante 5 min. en hielo. Aparecen flóculos en la solución, con
tendencia a precipitar en el fondo del tubo
9. Centrifugar 10 min en la minicentrífuga a aprox. 14.000 rpm.
10. Introducir un filtro High Pure en un tubo colector. Depositar el
sobrenadante obtenido tras la centrifugación del paso anterior en la
cámara superior del filtro High Pure. Centrifugar de nuevo a 14.000 rpm
durante 30-60 seg.
11. Separar el filtro del tubo colector y descartar el líquido recogido en
éste. Colocar de nuevo el filtro sobre el tubo colector y añadir 700 µl de
líquido de lavado (frasco de tapón azul) y centrifugar a 14.000 rpm
durante 30-60 seg.
12. Separar el filtro del tubo colector y descartar el líquido recogido en
éste. Colocar de nuevo el filtro sobre el tubo colector y centrifugar a
14.000 rpm durante 30-60 seg. Para eliminar posibles restos de la
solución de lavado.
13. Descartar el líquido recogido y el propio tubo colector, que es sustituído
por un tubo Eppendorf limpio de 1,5 ml. Añadir 100 µl de tampón de
elución (frasco de tapón no coloreado) y centrifugar a 14.000 rpm
durante 30-60 seg.
14. El tubo de 1,5 ml contiene ahora el plásmido eluído.
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Sesión III: Observaciones y comentarios.
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SESION IV
ANALISIS DE RESTRICCION.
Se digerirá el plásmido purificado con la endonucleasa de restricción
Eco RI, según el Protocolo 4. Los fragmentos obtenidos se separarán por
electroforesis en gel de agarosa (Protocolo 5). Se discutirán los resultados
obtenidos por cada grupo y se identificarán las diferentes movilidades que
muestran los plásmidos intactos, o los que han sido cortados por el enzima
de restricción.
PROTOCOLO 4.
Incubación de DNA con Eco RI.
1. En un tubo Eppendorf de 1,5 ml se pipetean sucesivamente los siguientes
componentes de la reacción:
DNA de plásmido eluído
10 µl
Buffer de restricción
3 µl
Endonucleasa Eco RI (Roche)
5 unidades
Agua desionizada
27 µl
2. Se incuba a 37º C durante un mínimo de 2 horas.
Mientras se incuba la reacción, se procede a preparar un gel de agarosa al
1% (en peso/volumen) en el que cargaremos las reacciones al finalizar la
incubación para resolver mediante electroforesis los fragmentos de ADN
obtenidos.
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Electroforesis del ADN del plámido en geles de agarosa.
Polímero de agarosa
Estados sólido-líquido
Aparatos utilizados (Cubeta, fuente , transiluminador)
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Protocolo 5.
1. Se toman 20 µl de cada una de las muestras de DNA que se vayan a
analizar y se depositan en tubos separados. A cada tubo se le añade
ahora 2 µl de solución de muestra para electroforesis y se mezcla bien.
2. Cada muestra se deposita en un pocillo independiente del gel de agarosa,
sumergido en el tampón de electroforesis. Además, se incluye una
muestra del DNA marcador (mezcla de fragmentos de DNA de peso
molecular conocido) para poder calibrar el tamaño de los DNA
detectados.
3. Se aplica una corriente de voltaje constante de 100 voltios y se mantiene
hasta que el colorante llegue al final del recorrido del gel.
4. Como el gel de electroforesis contiene bromuro de etidio, que es un
agente intercalante de DNA, las moléculas de DNA pueden visualizarse
mediante irradiación del gel con luz ultravioleta, utilizando un
transiluminador adecuado.
Sesión IV: Observaciones y comentarios.
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