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Preliminary Results of applying an “ex vivo” model for preclinical evaluation of
Biomaterials
Resultados Preliminares de la aplicación de un modelo “ex vivo” para la
evaluación preclínica de Biomateriales
Itamys C. García Villar1, Haney Castro Fernández2, Oscar E. Ledea Lozano2, Yamila
Rodríguez1, Julio C. García Rodríguez1 y Ramón González Santos1
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CENPALAB.Bejucal Apartado 3 Habana, Cuba.
Departamento de Investigación Desarrollo, Dirección de Química Centro Nacional de
Investigaciones Científicas, Avenida 25, Esq. 58, Apartado Postal 6214- 6414,
Cubanacán, Playa, Ciudad de la Habana (Cuba)
investigacion@cenpalab.inf.cu
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Preliminary Results of applying an “ex vivo” model for preclinical evaluation of
Biomaterials
ABSTRACT
Introduction: The chorioallantoic membrane of chicken egg is an alternative methods
validated in vitro, with the aim of reducing the suffering of animals. This method is very
useful for examining phenomena of irritability, mutagenesis and angiogenesis because
of its low cost, ease manipulation and the absence of a mature immune system. The
aim of this work was the application the “ex vivo” model of chorioallantoic membrane of
chicken egg in the preclinical evaluation of Biomaterials. Materials and Methods: A
composite formed by ceramics and polymer was used in this work. Were analyzed
three groups: seven, eight and nine days of the embryonic development during 72
hours. In all groups the negatives controls (chicken egg without biomaterials) and study
groups (chicken egg with biomaterials) were studied. Finally the number of vases
generate were determinate. Results and Discussion: The study demonstrated that
the chicken eggs in the presence of the studied composite had higher blood vessel
development in all analyzed periods of embryonic development .The most
vascularization increment occurred at 24 hours in all groups and the period of seven
days of embryo growth was the most vascularization. Only embryonic deaths occurred
in the group of nine days of embryonic development. Conclusion: Marked differences
between the negatives controls and study groups were observed.These results giving
us an idea of the feasibility of this model for preclinical studies of biomaterials.
Keywords: Model ex vivo, preclinic evaluation, Biomaterials.
RESUMEN
Introducción: El método de la membrana corioalantoidea del huevo de gallina ha sido
validado como alternativa in vitro, con el objetivo de reducir el sufrimiento de los
animales. Este método es muy útil para examinar fenómenos de irritabilidad,
mutagénesis y angiogénesis por su bajo costo, la facilidad en su preparación y la
ausencia de un sistema inmune maduro. El objetivo de este trabajo fue la aplicación
del modelo “ex vivo” de la membrana corioalantoidea del embrión del huevo de gallina
en la evaluación preclínica de Biomateriales. Materiales y Métodos: Se utilizó un
biomaterial compuesto por cerámica y polímero. Se analizaron tres grupos
correspondientes a: siete, ocho y nueve días de desarrollo embrionario durante 72
horas. En todos los grupos de estudio se analizaron controles negativos (embriones
sin biomaterial) y muestras problemas (embriones con biomaterial). Finalmente, se
determinó el número de vasos generados. Resultados y Discusión: Se demostró con
el estudio ex vivo en el modelo de la membrana corioalantoidea del embrión de gallina,
que las muestras en presencia del biomaterial compuesto presentaron un mayor
desarrollo de vasos sanguíneos en todos los periodos de desarrollo embrionario
analizados. La mayor vascularización se produjo a las 24 horas en todos los períodos
de crecimiento y el periodo de siete días de crecimiento del embrión fue el de mayor
vascularización. Solamente se produjeron muertes en el grupo de nueve días de
desarrollo embrionario. Conclusiones: Se observaron grandes diferencias entre los
controles negativos y muestras problemas, lo que indica la factibilidad de este modelo
para la evaluación preclínica de biomateriales.
Palabras claves: Modelo ex vivo, evaluación preclínica, Biomateriales.
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INTRODUCCION
Desde los años 90 se han realizado varios estudios de validación de alternativas
in vitro, con el objetivo de desarrollar nuevos métodos que reduzcan el sufrimiento de
los animales (1,2). Entre estos métodos está el de la membrana corioalantoidea del
huevo de gallina. El método de la membrana corioalantoidea del huevo de gallina es
muy útil para examinar fenómenos de irritabilidad, mutagénesis y angiogénicos por su
bajo costo, la facilidad en su preparación y la ausencia de un sistema inmune maduro
(3). En Francia y Alemania, entre otros países europeos, las autoridades reguladoras
han aceptado este método para ensayar la seguridad de cosméticos y hoy en día
nuestro país ya lo ha puesto en práctica en este campo.
Los biomateriales por definición son cualquier sustancia (diferente a una droga) o
combinación de sustancias, de origen sintético o natural que se use por cualquier
lapso de tiempo, como un todo o formando parte de un sistema que trata, aumenta, o
reemplaza cualquier tejido, órgano o función del organismo (4,5).
Un material compuesto es un sistema integrado por una mezcla o combinación de dos
o más micro o macroconstituyentes que difieren en forma y composición química y que
son esencialmente insolubles entre sí. El objetivo de los materiales compuestos es el
de la adición de propiedades que no pueden ser obtenidas por los materiales
originales. En este caso hemos utilizado un biomaterial compuesto por cerámicas y
polímero (5).
A nivel mundial es ampliamente utilizado el modelo de la Membrana corioalantoidea
del huevo de gallina fundamentalmente con la finalidad de estudiar la irritabilidad de
cosméticos y medicamentos de uso tópico. Sin embargo, hasta el momento no hemos
encontrado reportes de su aplicación en estudios preclínicos con biomateriales, de ahí
que el objetivo de este trabajo sea reportar los resultados preliminares obtenidos de la
aplicación del modelo “ex vivo” de la membrana corioalantoidea del embrión del huevo
de gallina en la evaluación preclínica de Biomateriales.
MATERIALES Y METODOS
Preparación de la formulación a estudiar
Los ensayos se realizaron empleando laminas de un biomaterial compuesto cerámica polímero de dimensiones (0,5x0,5x0,2) cm elaborados según la ISO 13779-1 del 2000
(6).
Selección de los grupos de estudio
Para llevar a cabo este estudio se utilizaron 18 embriones de gallina con los cuales se
conformaron tres grupos:
A: Embriones con 7 días de desarrollo
B: Embriones con 8 días de desarrollo
C: Embriones con 9 días de desarrollo
Todos los embriones se revisaron por transiluminación y se desecharon los muertos.
El sitio de implantación se marcó sobre el lado de la cascara de huevo donde se
localiza la cámara de aire.
En cada grupo de desarrollo embrionario fueron analizados:
• Controles Negativos: Embriones sin composite
• Muestras Problemas: Embriones con composite
Las muestras fueron colocadas sobre la membrana corioalantoidea de los huevos de
gallina. Los huevos fueron incubados nuevamente a (37 ± 0,1) °C durante 72 horas.
De cada grupo fueron retirados para análisis a las 24, 48 y 72 horas un control
negativo (CN) y una muestra problema (MP). Se utilizó el programa UTHSCSA Image
Tool para Windows versión 3.0 para determinar el número de vasos de los embriones
estudiados.
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RESULTADOS Y DISCUSION
En este estudio en el caso de los Controles Negativos (CN), prácticamente se mantuvo
el mismo nivel de aparición y/o crecimiento de vasos en la membrana en todos los
periodos de desarrollo embrionario analizados, manteniendo una media de formación
de vasos de 57 a lo largo del estudio, Fig 1. Sin embargo en el grupo Muestra
Proplema (MP) si se observó una variación significativa del número de vasos con el
tiempo (Tab. 1, Fig 2), lo cual nos indica que la presencia del biomaterial o de algún
componente del mismo favorece el desarrollo del embrión expresándose en este caso
con un aumento en el número de vasos sanguíneos.
A. Tiempo Cero
B. 72 Horas
Fig. 1. A. Control Negativo a Tiempo Cero. B. Control Negativo a las 72 Horas.
Tab.1. Δ Número de vasos en el tiempo de las Muestras Problemas (MP).
Tiempo
(Horas)
24
48
72
Δ Número de vasos
A
B
C
50
60
70
43
52
62
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Muerte
Muerte
Leyenda: A- grupo de desarrollo embrionario de 7 días, B- grupo de desarrollo
embrionario de 8 días C- grupo de desarrollo embrionario de 9 días, Muerte- Muerte de
los embriones ensayados.
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HORA CERO
HORA 72
A
B
C
MUERTE
Fig. 2. Fotografías de los controles Negativos a tiempo cero y 72 horas en los
diferentes grupos de desarrollo embrionario.
En todos los grupos de desarrollo embrionario analizados, el mayor aumento del
número de vasos se produjo durante las primeras 24 horas, siendo el grupo de 7 días
de desarrollo embrionario donde se observó la mayor vascularización. Es importante
destacar que solamente en el grupo de 9 días de desarrollo embrionario se produjeron
muertes, lo cual nos da idea de que es un tiempo de mayor sensibilidad para el
embrión, de ahí que durante este tiempo no ha de ser recomendable su utilización en
este tipo de estudios.
CONCLUSIONES
Se demostró con el estudio ex vivo en el modelo de la membrana corioalantoidea del
embrión de gallina, que las muestras en presencia del biomaterial compuesto
presentaron un aumento en el número de vasos sanguíneos en todos los periodos de
desarrollo embrionario analizados en comparación con el grupo CN. La mayor
vascularización se produjo a las 24 horas en todos los períodos de crecimiento y el
periodo de siete días de crecimiento del embrión fue el de mayor vascularización.
Solamente se produjeron muertes embrionarias en el grupo de 9 días de desarrollo
embrionario. Estos resultados nos dan idea de la factibilidad de este modelo para los
estudios preclínicos de biomateriales.
BIBLIOGRAFIA
1. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals No 401: Acute Oral Toxicity, Paris:
Organization for Economic Cooperation and Development. 1987.
2. OECD Guideline for the Testing of
Irritation/Corrosion. Paris: Organization
Development. 2002.
Chemicals No.
for Economic
405: Acute
Cooperation
eye
and
3. Camps D, Samar M, Ávila R. Procedimientos utilizados en el estudio de eventos
angiogénicos en membrana corioalantoidea de embriones de pollo sometidos a
radiaciones ultravioletas. Archivos de Medicina; 2008.
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4. Dee K, Puleo DA, Bizios R. Wound healing In: An Introduction to tissue-Biomaterial
Interactions, Wiley-Liss, Hoboken, New Jersey: John Wiley & Sons Inc.; 2002;
p.165-214.
5. Gil AJ, Garrido LR, Gil AR, Melgosa GM. Materiales para la reparación y
sustitución ósea. Factores de crecimiento y terapia genética en cirugía ortopédica y
traumatología. MAPFRE MEDICINA 2003; 14: 51-65.
6. ISO 13779-1. Implants for surgery - Hydroxyapatite - Part I: Ceramic
hydroxyapatite. International Organization for Standardization, 2000.
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