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Resumen: M-019
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2006
Puesta a punto de una técnica para la identificación de Escherichia coli
diarreogénicas mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
2
2
1
Esquivel, G. Patricia - Lifschitz, Viviana - Medina, Marcelo G.
1
1
Gorodner, Jorge O. - Merino, Luis A.
(1)Instituto de Medicina Regional. Universidad Nacional del Nordeste.
Av. Las Heras 727. 3500 Resistencia (Argentina). Correo electrónico: lamerino@bib.unne.edu.ar.
(2)Facultad de Medicina. Universidad Nacional del Nordeste. Sargento Cabral 2001. 3400 Corrientes (Argentina).
INTRODUCCIÓN
Escherichia coli es el agente etiológico más importante de diarrea infantil y representa el mayor problema de salud
pública en los países en desarrollo (14). Esta bacteria presenta un amplio conjunto de serotipos entre los cuales sólo
algunos son responsables de causar enteritis en humanos. Esos serotipos actualmente son categorizados en base a sus
factores de virulencia o determinantes de patogenicidad (4).
Dado que la mayoría de los serotipos de Escherichia coli se encuentran formando parte de la biota habitual del tracto
digestivo del hombre, cada vez que se obtiene un aislamiento de esta bacteria a partir de heces diarreicas se hace
imprescindible diferenciar aquellos tipos capaces de producir enfermedad entérica de aquellos que sólo se encuentran
como saprófitos (14) .
Las categorías diarreogénicas de Escherichia coli se clasifican en (5):
• Escherichia coli Enterotoxigénica (ECET): la infección resulta en una diarrea no inflamatoria causada por una
enterotoxina termolábil y otra termoestable.
• Escherichia coli Enteropatogénica (ECEP): posee la capacidad de producir diarrea no inflamatoria siendo sus
determinantes de patogenicidad la intimina y el factor de attaching and effacing.
• Escherichia coli Enteroinvasiva (ECEI): produce una diarrea disenteriforme similar a la producida por Shigella.
• Escherichia coli Enteroagregativa (ECEA): es capaz de producir diarrea acuosa debido a la presencia de fimbrias
que ocasionan la agregación bacteriana sobre la superficie celular.
• Escherichia coli Enterohemorrágica (ECEH): da como resultado una diarrea sanguinolenta por producción de una
toxina similar a la toxina Shiga de Shigella dysenteriae.
Datos publicados por diversos autores atribuyen a cada tipo patogénico distribuciones diferentes según la edad de los
pacientes y regiones geográficas (9, 10).
Debido a la gran homogeneidad bioquímica que presentan las diferentes categorías patogénicas, la caracterización de
cada una de ellas debe realizarse a nivel molecular, detectando mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) la
presencia de los genes que codifican cada uno de los determinantes de patogenicidad (11).
OBJETIVOS
El objetivo del presente trabajo fue poner a punto una metodología para caracterizar aislamientos de Escherichia coli
diarreogénicas aplicando la técnica de PCR para la detección de sus determinantes de patogenicidad.
MATERIALES Y MÉTODOS
En el presente trabajo se procesaron cepas de Escherichia coli correspondientes a las diferentes categorías patogénicas
provistas gentilmente por personal del Instituto Nacional de Microbiología ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”.
Dichas cepas fueron cultivadas en agar Cisteína Lactosa Deficiente en Electrolitos (CLDE) durante 24 hs a 37ºC. Una
ansada de colonias de cada cepa se resuspendió en 100 µl de Tritón 1% en buffer Tris-EDTA (pH 8.0). Luego de 10
minutos de incubación en baño de agua a 100ºC las muestras fueron centrifugadas a 10000 rpm/min y el sobrenadante
fue usado como templado de ADN.
La amplificación mediante PCR se realizó de acuerdo al siguiente protocolo, estandarizado por Toma y cols. (20): la
mezcla de reacción contenía 10 mM de TRIS-HCl (pH 8,3), 50 mM de KCl, 0,1% de gelatina, 1,5 mM de Cl2Mg, 2,5 U
de Taq DNA polimerasa (Fermentas), 0.2 mM de trifosfato de desoxinucleótidos (dntp), los iniciadores en las
concentraciones que se muestran en la tabla 1 y 5 µl del templado de ADN.
El programa de amplificación fue de 30 ciclos de 1 min a 95ºC, 1 min a 52ºC y 1 min a 72ºC y una extensión final de 10
minutos a 72ºC (tiempo total de amplificación de 2 horas 20 minutos).
De cada producto final de la PCR, 20 µl se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 2% durante 35 minutos a 75
voltios. El gel fue teñido durante 10 minutos con de bromuro de etidio (0,5 µg/ml) y visualizado con transiluminación
con luz UV.
El buffer utilizado tanto en la cuba electroforética como en la preparación del gel de agarosa fue TRIS-Acetato-EDTA
(TAE). Los patrones de banda obtenidos se analizaron mediante el programa UVITec.
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DISCUSIÓN DE RESULTADOS
La metodología de PCR múltiple ha sido utilizada para identificar y diferenciar Escherichia coli patogénicos en
numerosos estudios. Algunos de estos estudios detectan un virotipo, como ECEH (8,16,25) mientras que otros se
dirigen a un único serotipo dentro de un determinado tipo patogénico, por ejemplo E. coli 0157:H7 (3,12,23).
Esta metodología también ha sido aplicada en la diferenciación de E. coli de otros patógenos que producen cuadros
clínicos similares, como ser EIEC y Shigella (1,7).
Otros estudios fueron diseñados para diferenciar virotipos de E. coli apuntando a detectar genes de virulencia y otros
genes necesarios para desarrollar la infección (19,21,22). Algunos de ellos estaban dirigidos a los cuatro tipos
patogénicos mayores: EHEC, ETEC, EPEC y EIEC. Estos estudios aplicaron tres (2,18) o cuatro (13,17) diseños de
PCR múltiple diferentes dirigidas a 8 u 11 genes para la identificación de esos 4 virotipos.
Con la idea de reunir en una sola reacción el número mínimo de cebadores que permitan caracterizar los cinco tipos
patogénicos de E. coli, se diseñaron PCR múltiples con diferentes combinaciones de iniciadores (6).
Así, Nguyen y cols. (15) estudiaron los siguientes genes: eaeA (gen structural de la intimina de ECEH y ECEP), bfpA
(gen estructural de los pili de EPEC), vt1 y/o vt2 (genes de las toxinas Shiga 1 y 2 de ECEH), eltB y/o estA (genes de
las enterotoxinas de ECET), ial (locus asociado al plásmido de invasión en ECEI), y pCVD (la secuencia nucleotídica
del fragmento de pCVD432 de ECEA). Por su parte, Watterworth y cols (24) enfocaron su estudio en los genes stxI y
stxII (genes de toxina Shiga-like I y II de E. coli verotoxigénica, respectivamente), st y lt (genes de las toxinas
termoestable y termolábil de E. coli enterotoxigenica, respectivamente), eaf (gen del factor de adherencia de E. coli
enteropatogénica) y el IAL (el plásmido de invasividad de E. coli enteroinvasiva).
Para el presente trabajo se eligió adaptar la técnica PCR múltiple utilizada por Toma y cols. (20), debido a su
simplicidad en el protocolo de amplificación como así también, por la diferencia entre los pesos moleculares de las
bandas correspondientes a cada tipo patogénico o virotipo.
En la figura 1 se muestran las bandas obtenidas para cada tipo patogénico mediante electroforesis en gel de agarosa de
los productos de amplificación. En la misma puede observarse la óptima diferenciación entre bandas, mediante las
cuales se pudieron definir los diferentes tipos patogénicos.
Aunque la técnica descripta por Toma y cols. (20) utiliza cepas cultivadas en un medio líquido (caldo Luria-Bertani), la
utilización de aislamientos a partir de un medio sólido parece no influir en el resultado final del método. De la misma
manera, no se vio afectado el resultado al sustituir el buffer conteniendo Tween 20 y proteinasa K por buffer
suplementado con Triton 1% para la extracción del ADN bacteriano.
CONCLUSIÓN
Esta técnica modificada resultó apta para la caracterización molecular de cepas diarreogénicas de Escherichia coli,
aportando simplicidad y menores costos.
AGRADECIMIENTOS
Los autores desean expresar su agradecimiento al Bioq. Gerardo Deluca por su invalorable apoyo técnico y al personal
del Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán” por la provisión de las cepas
control. El presente trabajo forma parte de un proyecto acreditado ante la Secretaría general de Ciencia y técnica
(UNNE) y se realizó gracias a un subsidio otorgado por la Fundación “Alberto J. Roemmers”.
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Tabla I: Características de los cebadores utilizados para el desarrollo de la PCR múltiple
Cebador
SK1
SK2
VTcom-u
VTcom-d
AL65
AL125
LTL
LTR
ipaIII
ipaIV
aggRks1
aggRkas2
Concentración
en la mezcla
0,125 µM
0,125 µM
0,25 µM
0,25 µM
0,5 µM
0,5 µM
0,25 µM
0,25 µM
0,125 µM
0,125 µM
0,25 µM
0,25 µM
Categoría
de E. coli
ECEP, ECEH
ECEH
ECET
ECET
ECEI
ECEA
Sequencia (5´ to 3’)
CCCGAATTCGGCACAAGCATAAGC
CCCGGATCCGTCTCGCCAGTATTCG
GAGCGAAATAATTTATATGTG
TGATGATGGCAATTCAGTAT
TTAATAGCACCCGGTACAAGCAGG
CCTGACTCTTCAAAAGAGAAAATTAC
TCTCTATGTGCATACGGAGC
CCATACTGATTGCCGCAAT
GTTCCTTGACCGCCTTTCCGATACCGTC
GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC
GTATACACAAAAGAAGGAAGC
ACAGAATCGTCAGCATCAGC
Gene
Tamaño
(pb)
eae
881
stx
518
est
147
elt
322
ipaH
619
aggR
254
Resumen: M-019
UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDEST E
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2006
Fig. 1: Electroforesis de los productos de amplificación mediante PCR múltiple de
los diferentes tipos patogénicos de E. coli. Línea 1: ECEP, Línea 2: ECET,
Línea 3: ECEA, Línea 4: ECEI, Línea 5: ECET, Línea 6: ECEH.
1
2
3
4
5
6
genes
eae
ipaH
stx
elt
aggR
est