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INGENIERÍA GENÉTICA II • • Primrose SB, Twyman RM y Old RW. (2001). “Principles of Gene Manipulation”, 6th ed. Blackwell Science. Sambrook J, Russell DW y Sambrook J. (2001). “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1 1.ENZIMAS DE RESTRICCIÓN 2. VECTORES DE CLONACIÓN 3. BIBLIOTECAS GENÓMICAS 4. BIBLIOTECAS DE ADNc 2 ENZIMAS DE RESTRICCIÓN • Reconocen secuencias concretas • Simetría (palíndromes) 3 Ejemplos de palíndromes • Dabale arroz a la zorra el abad • La ruta natural • A man, a plan, a canal: Panama 4 Enzimas de restricción • Reconocen secuencias concretas • Simetría (palíndromes) • Número de nucleótidos en la secuencia N1N2N3N4 N1N2N3N4N5N6 N1N2N3N4N5N6N7N8 44 46 48 256 4096 65536 5 6 Extremos cohesivos EcoRI G-3’ CTTAA-5’ GAATTC CTTAAG 5’-AATTC 3’-G 7 Extremos cohesivos PstI CTGCA-3’ G-5’ CTGCAG GACGTC 5’-G 3’-ACGTC 8 Extremos romos SmaI CCC-3’ GGG-5’ CCCGGG GGGCCC 5’-GGG 3’-CCC 9 Extremos compatibles (I) EcoRI GAATTC CTTAAG EcoRI GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG 10 Extremos compatibles (II) SalI GTCGAC CAGCTG XhoI GTCGAG CAGCTC CTCGAG GAGCTC 11 Extremos romos (siempre compatibles) SmaI CCCGGG GGGCCC EcoRV CCCATC GGGTAG GATATC CTATAG 12 Extremos no compatibles rellenados, transformados en romos (siempre compatibles) EcoRI GAATTC CTTAAG G-3’ AATT-3’ CTTAA-5’ + dNTPs XhoI CTCGAG GAGCTC GAATT TCGAG CTTAA AGCTC 5’-TCGAG GCT 3’-A3’-C •Degradado de cadena sencilla 13 Extremos no compatibles transformados en compatibles • Rellenado parcial HindIII AAGCTT TTCGAA A-3’ AG-3’ TTCGA-5’ + dATP, + dGTP XbaI TCTAGA AGATCT AAGCTAGA TTCGA TCC 5’-CTAGA 3’-T 3’-C C + dCTP, + dTTP 14 VECTORES DE CLONACIÓN • Plásmidos • Bacteriófagos • Cósmidos • Vectores de alta capacidad 15 pBR322 16 SP6 SfiI (43'0) XbaI XhoI EcoRI BamHI NotI SacI SacI NotI BamHI EcoRI XhoI XbaI T7 (0'0) Sfi I brazo izquierdo (20 kpb) región central (14 kpb) dispensable brazo (9 kpb) derecho λ-GEM-12 17 Ssp I Xmn I PvuII Ssp I Ssp I Ec oRI No tI Ba mHI No tI Ec oRI PvuII f1(+) ori ScaI Cm cos c olE 1 or i T c yc1 ble PvuII HindIII Sa lI XhoI Kp nI Ec oRV Stu I Izt apaCos 8.3 kpb cos NheI Xba I pp cbC Sm aI NcoI PstI* Sa cI Xba I* Ap aI 18 Cromosoma eucariótico Vector de clonaje (plásmido) Digestión Digestión ADN Ligasa 19 Sitio de corte Secuencias de reconocimiento Sitio de corte ADN cromosómico Extremos cohesivos Extremos romos ADN Ligasa Vector de clonación digerido con EcoRI y PvuII 20 pBR322 PstI ADN “Extraño” ADN Ligasa ADN Hospedador Transformación de células de E. coli 21 ADN Hospedador Transformación de células de E. coli Selección Todas las colonias que tienen plásmidos Agar + tet Colonias con plásmidos recombinantes Agar + tet (control) Agar + tet + amp 22 23 Agrobacterium invade aprovechando los cortes Transferencia a placas con agar Placas con agar, hormonas y kanamicina Las plantas, resistentes a kanamicina, contienen el gen “extraño” Regeneración de las plantas 24 Planta transformada con el gen para la GFP (proteína verde fluorescente) 25 26 27 28 29 30 31 32 BIBLIOTECAS GENÓMICAS 33 34 N= ln (1-p) ln (1-t) p = probabilidad de encontrar el fragmento deseado tamaño del inserto t = tamaño del genoma 35 BIBLIOTECAS DE ADNc 36 5'- conector-cebador TTTTTTTTTTTTGAGCTC-5' AAAAAAAAAAAA-3' ARNm Transcriptasa reversa 5-metil dCTP dATP, dGTP, dTTP CH3 C H3 CH 3 CH 3 CH3 XhoI TTTTTTTTTTTTGAGCTC-5' AAAAAAAAAAAA-3' ADNc 5-met ARN 3'5'- ARNasa H ADN polimerasa I dNTPs CH3 C H3 3'5'- CH 3 CH3 CH 3 XhoI TTTTTTTTTTTTGAGCTC-5' AAAAAAAAAAAACTCGAG-3' ADNc 5-met ADN Ada ptadores EcoR1 ADN ligasa de T4 CH 3 EcoRI 3'-G... 5'-AATTC... CH3 CH 3 CH3 CH3 ADNc 5-met ADN XhoI EcoRI TTTTTTTTTTTTGAGCTC...CTTAA-5' AAAAAAAAAAAACTCGAG...G-3' Digestión Xho 1 EcoRI 3'-G... 5'-AATTC... CH3 CH3 CH3 CH 3 ADNc 5-met ADN CH3 XhoI TTTTTTTTTTTTGAGCT-5' AAAAAAAAAAAAC-3' 37
