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COMUN ICA CIÓN BR EV E
S e ns ibilidad, e s pe cificidad y valo r pre dictivo
de l anális is g e né tico de variante s e n e l g e n S LC3 A1
aplicado al diagnóstico de cistinuria en población española
M. Guillén, D. Corella, M. L. Cabello*, C. Saiz y J. Hernández-Yago**
Unidad de Epidem iología Genética y Molecular. Departam en to de Medicin a Preven tiva y S alud Pública. Universitat de Valèn cia.
* Unidad de Metabolopatías. Hospital Universitario La Fe. ** In stituto de In vestigaciones Citológicas.
Fundación Valencian a de Investigaciones Biom édicas. Valencia.
Sensitivity, specificity and predictive value
of the genetic analysis of SLC3 A1 gene variants
used for the diagnosis of cystinuria among the
spanish population
O b je t iv o . Es timar la valide z clínica de l anális is
de las mutacio ne s puntuale s R4 5 2 W, M4 6 7 T,
1 1 4 C > A, 2 3 1 T > A, 1 1 3 6 + 3 de lT y
1 3 3 2 + 7 T > C e n e l g e n S LC3 A1 , as í co mo
de s us po s ible s haplo tipo s aplicado s al diagnó s tico
de cis tinuria e n po blació n me dite rráne a e s paño la.
Ma t e ria l y m é t o d o s . S e han e s tudiado
4 8 pacie nte s co n cis tinuria, 4 4 familiare s s in
cis tinuria y 8 1 co ntro le s s ano s . S e re alizó un
anális is g e né tico para la ide ntificació n de variante s
e n e l g e n S LC3 A1 . S e calculó la s e ns ibilidad,
e s pe cificidad y valo r pre dictivo para cada variante
g e né tica y para lo s po s ible s haplo tipo s .
R e s u lt a d o s . La e s pe cificidad de las mutacio ne s
M4 6 7 T, R4 5 2 W y 2 3 1 T > A aplicadas al
diag nó s tico de cis tinuria e n po blació n ge ne ral
o para lo s dife re nte s s ubtipo s de cis tinuria
e n familias afe ctadas fue s upe rio r al 9 0 %;
s in e mbarg o , ning una variante analizada alcanzó
una s e ns ibilidad s upe rio r al 8 0 %. En e l e s tudio
de haplo tipo s , la s e ns ibilidad más alta s e o btuvo
co n e l haplo tipo CTTT (8 3 ,8 %); s in e mbargo ,
s u e s pe cificidad y valo r pre dictivo fue ro n bajo s
(2 0 ,6 % y 5 3 ,4 %, re s pe ctivame nte ).
C o n clu s io n e s . Las variante s g e né ticas e s tudiadas
no mo s traro n s uficie nte valide z clínica.
PALABRAS CLAVE: cistinuria, validez clínica, gen
SLC3 A1 , diagnóstico genético, sensibilidad, especificidad.
Sensitivity, specificity and predictive value
of the genetic analysis of SLC3A1 gene variants
used for the diagnosis of cystinuria among
the spanish population
O b je ct iv e . To te s t the clinical us e fulne s s
o f the analys is o f po int mutatio ns R4 5 2 W, M4 6 7 T,
1 1 4 C > A, 2 3 1 T > A, 1 1 3 6 + 3 de lT
and 1 3 3 2 + 7 T > C in the g e ne S LC3 A1 as we ll as
the ir po s s ible haplo type s us e d fo r the diag no s is
o f cys tinuria in the me dite rrane an s panis h
po pulatio n.
Ma t e ria l a n d m e t h o d s . A to tal o f 4 8 patie nts
with cys tinuria, 4 4 re lative s witho ut cys tinuria,
and 8 1 he althy co ntro ls we re s tudie d. A ge ne tic
analys is was co nducte d in o rde r to ide ntify variants
in the ge ne S LC3 A1 . The s e ns itivity, s pe cificity,
and pre dictive value fo r e ach ge ne tic variant
and fo r the po s s ible haplo type s we re calculate d.
R e s u lt s . The s pe cificity o f mutatio ns M4 6 7 T,
R4 5 2 W, and 2 3 1 T > A us e d fo r the diagno s is
o f cys tinuria in the ge ne ral po pulatio n o r fo r
the diffe re nt s ubtype s o f cys tinuria in invo lve d
familie s , was highe r than 9 0 %; ne ve rte he le s s ,
no ne o f the analys e d variants re ache d a s e ns itivity
highe r than 8 0 %. In the s tudy o f haplo type s ,
the highe s t s e ns itivity was o btaine d with
the haplo type CTTT (8 3 .8 %); ho we ve r, its
s pe cificity and pre dictive value we re lo w
(2 0 .6 % and 5 3 .4 %, re s pe ctive ly).
C o n clu s io n s . The s tudie d g e ne tic variants did no t
s ho w e no ugh clinical us e fulne s s .
KEY WORDS : Cystinuria, clinical usefulness, gene
SLC3A1, genetic diagnosis, sensitivity, specificity.
(Rev Clín Esp 20 0 1; 2 0 1:25 6 -2 5 9)
Intro ducció n
En la actualidad se está comenzando a aplicar el análisis genético p ara la detección p recoz de errores
congénitos del metabolismo; sin embargo, estos anáCorrespondencia: M. Guillén.
Unidad de Epidemiología Genética y Molecular.
Departamento de Medicina Preventiva y Salud Pública.
Facultad de Medicina.
Avenida Blasco Ibáñez, 15 .
46010 Valencia.
Correo electrónico: marisa.guillen@uv.es
Aceptado para su publicación el 23 de noviembre de 2000.
256
lisis requieren una rigurosa evaluación de su validez y
de su utilidad 1,2 . La cistinuria es una enfermedad autosómica recesiva incompleta que se caracteriza por
una hiperexcreción urinaria de cistina, lisina, arginina y ornitina debido a una alteración en el transporte de estos aminoácidos en las células epiteliales del
túbulo renal 3 . Se han distinguido también diferentes
subtipos de cistinuria según la aminoaciduria presentada por el estado heterocigoto: tipo I y tipo no I 4 .
La detección temprana de pacientes cistinúricos y la
instauración de un tratamiento preventivo es decisivo
para el pronóstico de esta enfermedad 5 . La prueba
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M. GUILLÉN ET AL — SENSIBILIDAD, ESPECIFICIDAD Y VALOR PREDICTIVO DEL ANÁLISIS GENÉTICO DE VARIANTES
EN EL GEN SLC3A1 APLICADO AL DIAGNÓSTICO DE CISTINURIA EN POBLACIÓN ESPAÑOLA
del cianuro de nitroprusiato de Brand 6 es una prueba
cualitativa que pone de manifiesto la presencia de
cistina en orina mediante un cambio de color y es
ampliamente utilizada en programas de cribado neonatal. Las limitaciones que esta prueba presenta son
debidas a su baja sensibilidad (3 0 0 µmol cistina/ g
creatinina) y a los falsos positivos ocasionados por la
presencia de otras sustancias sulfuradas en la orina 7 .
Se introdujeron mejoras con la cromatografía en capa fina y con la de intercambio iónico. Actualmente,
la técnica más adecuada para el diagnóstico y tipificación de esta enfermedad es la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), pero todavía resulta cara y lenta para este fin 8 . Además, aquellos individuos
portadores silenciosos de la enfermedad (heterocigotos tipo I) y aquellos que hiperexcretaran cistina en
concentraciones ligeramente superiores a los rangos
de normalidad (algunos heterocigotos no tipo I) no
podrían ser detectados mediante técnicas cualitativas
y semicuantitativas («falsos negativos»). Por ello se
pensó que el diagnóstico genético aplicado a la cistinuria podría ser de gran utilidad. Calonge et al 9 demostraron que el gen SLC3 A1 estaba asociado a la
cistinuria humana, detectando distintas mutaciones.
El análisis de forma rápida y sencilla de estas variantes genéticas permitiría incluso detectar al portador
silente, que no manifestará fenotípicamente ningún
rasgo de la enfermedad, o al paciente con cistinuria
leve pero con posible riesgo de nefrolitiasis. Sin embargo, se ha descrito una importante heterogeneidad
alélica según el área geográfica 10 . Por otra parte, el
gen SLC3 A1 se ha asociado fundamentalmente a la
cistinuria tipo I 11 , revelando también heterogeneidad
genética como demuestra la reciente implicación del
gen SLC7 A9 12 en la cistinuria no tipo I. Por ello, el
objetivo de este trabajo es conocer la sensibilidad, especificidad y valor predictivo de las variantes genéticas
más prevalentes en el gen SLC3A1 en la población
mediterránea española 13,14 aplicadas al diagnóstico de
cistinuria.
excreción de aminoácidos fuera normal fueron clasificados
como heterocigotos tipo I (n = 5 ). Aquellos sujetos con hiperexcreción de al menos un aminoácido y la suma superior al correspondiente rango de referencia, pero cuyos
niveles de cistina fuesen inferiores a 2 5 0 mg cistina/ g de
creatinina fueron clasificados como heterocigotos no tipo I
(n = 3 4 ). El resto de individuos (n = 3 9 ) con aminoaciduria
dentro del rango de normalidad 15 fueron clasificados como
fa m ilia re s sin cistin uria . Se e sco gió un grup o co n tro l
(n = 8 1 ) apareado por edad y sexo y de la misma procedencia geográfica.
A n álisis de varian tes en el gen S LC3 A 1
Se obtuvo el ADN y mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se amplificaron varios fragmentos del gen SLC3A1,
que contenían las variantes genéticas (R4 5 2 W, M4 6 7 T,
114C > A, 231T > A, 1136 + 3delT y 1332 + 7T > C). Mediante los polimorfismos en longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) se detectaron todas las variantes excepto R452W,
que se detectó mediante secuenciación directa. Para la construcción de los haplotipos en aquellas familias que fueron informativas y de las cuales se obtuvo la colaboración de un número suficiente de miembros para poder construir las fases (n = 13) se
utilizaron los cuatro polimorfismos anteriormente descritos:
114C > A, 231T > A, 1136 + 3delT y 1332 + 7T > C.
A n álisis estadístico
La sensibilidad se calculó como la proporción de personas
con cistinuria, con presencia de una determinada variante o
haplotipo del gen SLC3A1 respecto al total de personas con
cistinuria. La proporción de personas sin cistinuria negativas
para la prueba (ausencia de una determinada variante o haplotipo del gen SLC3A1), respecto al total de personas sin
cistinuria fue la especificidad. El valor predictivo positivo o
negativo de las pruebas se calculó como el porcentaje de personas con cistinuria y presencia o ausencia, respectivamente,
de una variante o haplotipo del gen SLC3A1 sobre el total
de aquéllas con presencia o ausencia de dicha variante o
haplotipo. La sensibilidad, especificidad y valor predictivo se
calcularon también para los distintos subtipos de cistinuria. El
análisis de los datos se realizó con el programa SPSS.
Re s ultado s
Mate rial y mé to do s
S ujetos del estudio: clasificación bioquím ica
Los pacientes con cistinuria a partir de los cuales se inició
el estudio cumplían alguno de estos criterios: a) positividad
de la prueba de Brand durante el primer año de vida en niños detectados a través de un programa de cribado (Unidad de Metabolopatías del Hospital Infantil La Fe, 1 9 8 3 1 9 8 6 ), y/ o b) haber formado y/ o expulsado cálculos de
cistina. La confirmación final del diagnóstico se realizó
mediante la cuantificación en orina de cistina, lisina, arginina y ornitina HPLC y su comparación con los valores de
referencia en nuestra población 15 . Se solicitó la colaboración de los familiares de primer y segundo grado de cada
paciente con cistinuria. Se obtuvo una muestra de orina de
primera hora de la mañana y una muestra de sangre de la
cual se aisló el ADN. Tras la clasificación de aminoácidos
por HPLC se identificaron 4 8 pacientes con cistinuria y
4 4 familiares. Para la clasificación de los diferentes tipos
de cistinuria se consideró homocigoto aquel cuya excreción de cistina fuese superior a 2 5 0 mg cistina/ g de creatinina (n = 1 4 ). Los padres de aquellos homocigotos cuya
La tabla 1 muestra las frecuencias para el alelo mutado de las variantes R4 5 2 W, M4 6 7 T, 1 1 4 C > A,
2 3 1 T > A, 1 1 3 6 + 3 delT y 1 3 3 2 + 7 T > C en paTABLA 1
Fre c u e nc ia s a lé lic a s d e la s va ria nte s d e l g e n
S LC3 A1 a na liza d a s e n p a c ie nte s c o n c is tinu ria ,
fa m ilia re s s a no s y c o ntro le s , e n p o b la c ió n
m e d ite rrá ne a e s p a ño la
Va ria nte
g e né tic a
Pa c ie nte s
c o n c is tinu ria
Fre c u e nc ia *
Fa m ilia re s
s a no s
Fre c u e nc ia *
Co ntro le s
Fre c u e nc ia *
R452W
M467T
114C > A
231T > A
1136 + 3delT
1332 + 7T > C
1/ 90
5/ 92
20/ 90
5/ 92
13/ 90
30/ 90
2/ 82
3/ 84
25/ 80
3/ 84
13/ 80
33/ 80
0/ 162
0/ 162
48 / 162
0/ 162
15 / 152
49 / 162
* Número de cromosomas positivos/ número de cromosomas analizados.
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REVISTA CLÍNICA ESPAÑOLA, VOL. 201, NÚM. 5 , MAYO 2 0 0 1
TABLA 2
S e ns ib ilid a d , e s p e c ific id a d y va lo r p re d ic tivo
d e la s d ife re nte s va ria nte s d e l g e n S LC3 A1 p a ra
e l d ia g nó s tic o d e c is tinu ria e n p o b la c ió n
m e d ite rrá ne a e s p a ño la
R452W
M467T
114C > A
231T > A
1136 + 3delT
1332 + 7T > C
S e ns ibilida d
(%)
Es pe cificida d
(%)
VP po s itivo
(%)
VP ne g a tivo
(%)
2,2
10,9
40,9
10,9
24,4
55,5
98,4
97,6
54,5
97,6
76,1
38,5
33,3
62,5
24,7
62,5
28,2
27,2
26,8
74,5
71,7
74,5
72,4
67,7
VP: valor predictivo. Total de individuos analizados: n = 1 6 8 . Número de
pacientes con cistinuria con análisis genético: n = 4 5. Número de pacientes
con aminoaciduria dentro del rango de normalidad (familiares sin cistinuria y
controles) con análisis genético: n = 123.
cientes cistinúricos, en sus familiares y en población
control. La distribución de los genotipos de las diferentes variantes genéticas en los tres grupos está de
acuerdo con el equilibrio de Hardy-Weinberg. La tabla 2 muestra la sensibilidad, especificidad y valor
predictivo de las diferentes variantes genéticas para
la detección de individuos con cistinuria. Se observa
que ninguna de las variantes analizadas alcanzó una
sensibilidad superior al 6 0 %. Para conocer si la validez aumentaba al considerar los distintos subtipos
de cistinuria, se consideraron éstos tal como se indica en métodos. La tabla 3 muestra la sensibilidad,
especificidad y valor predictivo de las variantes genéticas estudiadas para la detección de los pacientes
homocigotos, de heterocigotos no tipo I y de heterocigotos tipo I en las familias afectadas. El polimorfismo 1 1 4 C > A presentó la mayor sensibilidad para
detectar los diferentes subtipos; sin embargo, su especificidad fue muy baja. Por último, se construyeron haplotipos de riesgo analizando conjuntamente
diferentes variantes genéticas. Estos loci deben ser
lo suficientemente polimórficos para que las fases
no sean ambiguas. Por este motivo se utilizaron los
polimorfismos 1 1 4 C > A, 2 3 1 T > A, 1 1 3 6 + 3 delT
y 1 3 3 2 + 7 T > C. La tabla 4 muestra la sensibilidad, especificidad y valor predictivo de los nueve haplotipos encontrados para la detección de pacientes
con cistinuria.
TABLA 4
S e ns ib ilid a d , e s p e c ific id a d y va lo r p re d ic tivo
d e lo s ha p lo tip o s d e l g e n S LC3 A1 p a ra
e l d ia g nó s tic o d e c is tinu ria e n la s fa m ilia s
info rm a tiva s
Ha plo tipo s *
CTTT
CTTC
ATTC
ATdelTC
ATTT
CATT
AATT
CATC
ATdelTT
S e ns ibilida d
(%)
Es pe cificida d
(%)
VP po s itivo
(%)
VP ne g a tivo
(%)
83,8
27,7
27,7
19,4
13,9
11,1
8,3
8,3
5,5
20,6
79,4
64,7
70,6
97,0
94,1
97,0
94,1
88,3
53,4
58,8
45,6
41,2
83,3
66,7
75,0
60,0
33,3
53,8
50,9
45,8
45,3
51,6
50,0
50,0
58,2
46,9
VP: valor predictivo. * La primera letra del haplotipo corresponde al alelo C
o A 1 1 4 C > A, la segunda letra al alelo T o A del polimorfismo 23 1T > A,
la tercera letra al alelo T o delT del polimorfismo 1 13 6 + 3delT, y la cuarta
al alelo T o C del polimorfismo 1 33 2 + 7T > C.
Dis cus ió n
La dificultad para detectar al paciente con cistinuria
radica en que la manifestación clínica suele ser tardía
y el único signo temprano es la hiperexcreción de
aminoácidos 3 . Partiendo de estudios previos en los
que mutaciones en el gen SLC3A1 se han asociado
a distintos fenotipos de cistinuria 9 ,1 0 ,1 4 ,1 5 hemos evaluado la validez clínica de las variantes más comunes
en este gen en p oblación mediterránea esp añola
aplicadas a su diagnóstico. En la evaluación general
se ha utilizado una aproximación de casos y controles en lugar de realizar un cribado en recién nacidos
por razones técnicas y económicas, asumiendo que
el valor predictivo depende de la prevalencia de la
enfermedad en nuestra muestra. Los resultados obtenidos en esta aproximación indican que ninguna de
las variantes estudiadas posee la suficiente validez clínica para ser utilizada en el cribado de cistinuria. La
sensibilidad, especificidad y valor predictivo de las diferentes variantes genéticas mejoró cuando éstas fueron utilizadas en el cribado de familias con cistinuria,
pero no se llegó a alcanzar la validez clínica en ninguna de ellas, ni siquiera aplicadas a los distintos tipos de la misma. El análisis de haplotipos en familias
de miembros diagnosticados de cistinuria también
TABLA 3
S e ns ib ilid a d , e s p e c ific id a d y va lo r p re d ic tivo d e la s va ria nte s d e l g e n S LC3 A1 p a ra la d e te c c ió n
d e lo s d ife re nte s s u b tip o s d e c is tinu ria e n la s fa m ilia s a fe c ta d a s
S e ns ibilidad (%)
Ho m o
R452W
M467T
114C > A
231T > A
1136 + 3delT
1332 + 7T > C
7,7
21,4
77,3
21,4
30,8
46,1
Es pe cificidad (%)
He t. no tipo I He t. tipo I
0,0
6,1
50,0
6,1
29,4
66,6
33,3
75,0
66,6
75,0
33,3
33,3
Ho m o
97,3
93,2
48,6
93,2
71,6
33,3
Valo r pre dictivo po s itivo (%)
He t. no tipo I He t. tipo I Ho m o
94,3
89,0
53,8
89,0
71,7
38,5
97,6
94,0
53,1
94,0
71,4
35,8
33,3
37,5
7,7
37,5
16,0
11,1
Valo r pre dictivo ne g ativo (%)
He t. no tipo I He t. tipo I Ho m o He t. no tipo I He t. tipo I
0,0
25,0
40,0
25,0
40,0
40,7
33,3
37,5
5,0
37,5
4,0
1,8
85,7
86,2
92,3
86,2
85,5
77,4
59,5
61,2
63,6
61,2
61,3
64,5
Homo: homocigotos (n = 1 3 ); Het. no tipo I: heterocigotos no tipo I (n = 3 2 ); Het. tipo I: heterocigotos tipo I (portadores asintomáticos) (n = 3).
258
2,4
98,8
97,7
98,8
96,7
93,5
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M. GUILLÉN ET AL — SENSIBILIDAD, ESPECIFICIDAD Y VALOR PREDICTIVO DEL ANÁLISIS GENÉTICO DE VARIANTES
EN EL GEN SLC3A1 APLICADO AL DIAGNÓSTICO DE CISTINURIA EN POBLACIÓN ESPAÑOLA
mostró una sensibilidad, una especificidad y un valor
predictivo reducidos. Por ser éste el primer estudio
que se realiza aplicado al diagnóstico genético de la
cistinuria, no disponemos de datos con los que establecer una comparación con otras poblaciones, pero
teniendo en cuenta la baja recurrencia de mutaciones
a nivel mundial en el gen SLC3 A1 1 0 ,1 1 y la posible
implicación de otros genes 1 2 los resultados de su evaluación como prueba diagnóstica serían comparables
a los nuestros. Se deben, por tanto, realizar nuevos
estudios para identificar otras variantes genéticas que
aporten una mayor validez clínica en la aplicación
diagnóstica de estas técnicas moleculares que tanto
impacto tendrán en un futuro próximo.
Agrade cimie nto s
Este trabajo ha sido parcialmente financiado por una beca del
Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS 0 7 2 5 / 0 0 ). M. Guillén es
becaria del Instituto de Salud Carlos III.
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259