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REPRODUCCIÓN ASISTIDA EN EL VACUNO DE LECHE
Congelación
J. De la Fuente
INIA – Reproducción Animal y
Conservación Recursos Zoogenéticos
jfuente@inia.es
Máster Interuni versitario en Zootecni a y Gestión Sostenible:
ganadería ecológica e integrada.
Instituto de Estudios de Postgrado
Universidad de Córdoba
Córdoba , Mayo 2009
TRANSFERENCIA DE EMBRIONES BOVINOS
SELECCIÓN DE DONANTES
SUPEROVULACIÓN
MANIPULACIÓN:
OBTENCIÓN
EVALUACIÓN
CONSERVACIÓN
TRANSFERENCIA
¿Que es la criopreser vación?
Enfriamiento reversible de células hasta una
temperatura en la cual cesa la actividad biológica.
3 pasos:
* Preparación y enfriamiento
* Conservación a baja temperatura
* Descongelaci ón
Mecanismos de da ño celular durante la
criopreservaci ón
•Formación de cristales de hielo
•Daño osmótico
•Efecto tóxico del crioprotector
•Fractura de la zona y del embrión
•Daño en las organelas intracelulares
•Ruptura de los contactos entre células
CRIOPROT ECTORES
Son necesarios en las soluciones de congelación para prevenir el daño celular
durante la congelación y descongelación.
Grupos de crioprotectores:
1.- De bajo Pm y permeables , como: Etilenglicol, 1-2 Propanodi ol, Glicerol y otros.
- Reemplazan el agua intracelular minimizando la formación de cristales.
- Regulan la deshidratación y protegen la estructura proteica.
2.- De bajo Pm y no permeables , como: Glucosa, Sacarosa y otros azucares.
- Deshidratan las células antes de la congelación minimizando la formación de cristales.
- Estabilizan la estructura de la membrana.
3.- De alto Pm no permeables , como: Polivinilpirrolidona, Polivinil alcohol
y otros polímeros como el Ficol.
- Protegen en congelación/descongelación alterando el tamaño y la forma de los cristales.
En la congelación se utilizan concentraciones del ~10% de crioprotectores
En la vitrificación se utilizan mezclas de altas concentrac iones de crioprotectores;
etilenglicol, glicerol y propanodiol ~40%, en combi nación con azucares
Adición del crioprotector a la congelación
Obtenci ón
Glicerol
Glicerol
Sacarosa
Etilenglicol
Equilibrio Osmótico y formación de cristales en la congelación
H 2O
20ºC
H 2O
-5ºC
Enfriamiento
Rápido
Lento
H 2O
H 2O
H 2O
H 2O
H 2O
H 2O H 2O
H 2O
Hielo
intracelular
H 2O
Supervivencia
H 2O
100
100
0
0
0.5
Velocid ad (ºC/min) 1.5
CURVA DE CONGELACI ÓN DE EMBRIONES
20
INTRODUCCI ÓN EN EL CONGELAD OR
CRISTALIZACIÓN
TEMPERATURA
10
0
-6,5
-10
-6,5
8’
8’
0,5ºC/mi.
-20
-30
-35
-40
0'
8
16'
73'= 1h 13'
TIEMPO
LN 2
CURVA DE DESCONGELACI ÓN DE
EMBRIONES
RETIRADA DEL CONGELADOR
20
TEMPERATURA
10
0
-10
-20
-30
-35
-40
TIEMPO
LN2
Retirada del crioprotector a la descongelación
TE
DESCONGELACIÓN DE EMBRIONES
TRANSFERENCIA
DIRECTA
ETILEN GLICOL
1,5M
CAMBIO DE ESTADO
10” AIRE+
20” H2O A 27ºC
10%
GLICEROL
5’
5’
5’
6,6% GLICEROL
+
SACAROSA 0,3M
en PBS+0,4% BSA
3,3% GLICEROL
+
SACAROSA 0,3M
en PBS+0,4% BSA
0% GLICEROL
+
SACAROSA 0,3M
en PBS+0,4% BSA
8’
0% GLICEROL
+
SACAROSA 1M
en PBS+0,4% BSA
5’
PBS+0,4% BSA
5’
PBS+0,4% BSA
TRANSFERENCIA
Transferencia de embriones vacunos
Congelados
Frescos
C1
C2
Total
Descongelados
Degenerados
C1
C2
Total
224
74
298
25 (11%)
30* (40%)
55
TE
33
87
120
199
44
243
Gestaciones
20
53
73
108
23
131
% Gestación
60.6
61
60.8
54.2
53.8
53.9
*: p<0.001
RESULTADOS
CALIDAD
GLICEROL
ETILENGLICOL
FRESCO
EMBRIONES
TRANSFERIDOS
C1
C2
TOTAL
C1
C2
TOTAL
C1
C2+C3
TOTAL
TOTALES
a vs b: P<0.01; c vs d: P<0.01; e vs f: P<0.01
PARTOS
Nº
112
17
129
103
24
127
41
46
87
51
8
59
56
6
62
29
18
47
343
168
%
45,5 a
47,1
45,7
54,4 ab, c
25 d
48,8
70,7 b, e
39,1 f
54
48,9
Vitrificación
- Es el término usado en la criopreservación a bajas temperaturas creando un estado vitreo
completo (congelamiento sin cristales de hielo). Para suprimir la formación de cristales
al bajar la temperatura, la solución ha de alcanzar una alta viscosidad y eventualmente
entrar en una fase vítrea.
- Para lograr la vitrificación en tasas de enfriamiento prácticas se necesitan concentraciones
multimolares de los crioprotectores permeables (mayor al 30%), la toxicidad de los
solutos involucrados es muy alta.
-Los métodos para minimizar los efectos tóxicos de altas concentraciones de crioprotectores,
incluyen:
La equilibración de los embriones en dos pasos
El equilibrado a bajas temperaturas
La reducción de los tiempos de equilibrio
El uso de sustancias como la sacarosa que pueden disminuir la toxicidad.
Vitrificación
Para alcanzar la vitrificaci ón:
Inmersión directa en LN 2 en pajuelas de 0.25 a ~2500 C/mi n.
Altas concentraciones de crioprotectores (del 30%) implican
una alta toxicidad celular al tener que equi librarse con el material biológico.
Métodos para disminuir la toxicidad de altas concentraciones de cr ioprotector:
Equilibración de embriones en dos pasos.
Equilibración a bajas temperaturas .
Reducción del tiempo de equi librado.
La formaci ón de cristales letales depender á de:
El volumen de la muestra a c ongelar.
La velocidad de enfri amiento.
La viscosidad de la solución.
Métodos para vitrificar:
Píldoras.
Open pull straw (OPS).
Cryo-loops (CLV).
Vitrificación
- Resulta mayor el daño producido por la formación de cristales durante
la descongelación que durante l a vitrificación.
- Incrementar la concentración de solutos con crioprotectores no permeables
permite poder disminuir los crioprotectores permeables más tóxicos.
- La probabilidad de formaci ón de cristales es directamente proporci onal al
volumen e inversa a la viscosidad y a la vel ocidad de enfriamiento.
- Una reducc ión del volumen de 20 µl (pajuelas de 0.25 ml ) a 0.1 µl hace
incrementar la velocidad desde 1,200 C/min (inmersión en LN 2 de pajuelas
de 0.25 ml ) a 5.300 C/min (OPS) .
- El método OPS (Vajta, 1998) resulta el mas eficaz actualmente.
Aunque el contacto directo con el nitrógeno es una limitante importante,
por la posible contaminac ión.
* En la actualidad aun no se puede abordar c omercialmente la vitrificación
en las especies domésticas.
Congelación rápida
- La congelación rápida es la criopreservación de embriones parcialmente
deshidratados antes de aplicarles tasas de enfriamiento de aproximadamente 1.250 ºC/min.
- Se utiliza una solución con 2 a 4,5M de un crioprotector permeable (glicerol, propanediol,
DMSO o etilenglicol), y 0,25 a 0,5M de otro no permeable (sacarosa, tetralosa, lactosa).
- Después de un período de equilibración (30 seg. a 3 min.) los embriones en estado de
deshidratación parcial se enfrían en vapor de nitrógeno antes de sumergirlos en LN2.
- En contraste con la vitrificación, el agua extracelular se congela y la osmolaridad de la
solución aumenta, causando la pérdida de agua del embrión.
- La congelación de embriones bovinos ha resultado en tasas de supervivencia
menores (33,3%) cuando se comparó con métodos convencionales de congelado.
VENTAJAS DE LA CONGEL ACIÓN
A) Difusión de genes:
Incremento de la producción
Implantación rápida de cambios en la producción
B) Sanidad:
Limita la transmisión de enfermedades
Permite la limpieza sanitaria de las ganaderías
C) Conservación:
Animales en peligro de extinción (incrementa el n)
Permite la limpieza sanitaria de las ganaderías
D) De cobertura mundial ilimitada
Fin