Download Presentación de PowerPoint

Expresión de genes en E.coli
Factores que influyen en la elección de un
sistema de expresión
• tamaño de la proteína
• cantidad de proteína necesaria
• proteína activa
Promotores más utilizados
•
•
•
•
•
lac (or lacUV5)
trc
tac
phage T7 gene 10
phage λ pL
Regulación del operon lac
Promotor tac (trc)
• Híbrido de promotores lac y trp
región -35 de trp
region -10 de lac
– separados por 16bp = promotor tac
– separados por 17bp = promotor trc
• Regulado por el represor lac
• Independiente de la regulación por cAMP
• 3x más fuerte que trp
• 10x más fuerte que lac
Promotor del gen 10 del fago T7
• Todos los promotores del fago T7 (incluído
el gen 10) requieren la T7 RNA Polimerasa
para expresarse
– El gen de la T7 RNA Pol puede estar bajo el
control del promotor lac en cél de E.coli
– El gen de interés puede estar bajo el control del
promotor del gen 10
Promotor del gen 10 del fago T7
Inducer
lac pro
T7 RNA Pol
T7 RNA Pol
Protein of
Interest
T7 RNA Pol
g10 pro
gene of interest
Promotor λ pL
• 28-32°C
temp permisiva
– Fenotipo wt para el represor
NO hay expresión del gen controlado por represor cI
• 42°C
temp restrictiva
– Fenotipo mutante para el repressor
HAY expresión del gen controlado por represor cI
Regulación por el promotor
L
p
A) 30°C
active cI protein
mRNA
pcI
cI
oL
pL
target gene
Regulación por el promotor
B) 42°C
active cI protein
mRNA
pcI
cI - ts
oL
pL
target gene
L
p
Desventajas de vectores con
promotores λ pL
- la temp induce también genes de heat shock
(proteasas)
- desnaturalización térmica de la proteína expresada
Para aumentar la expresión de la
proteína
1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
Promotor & terminador transcripcional
Estabilidad de mRNA
Secuencia de Shine Dalgarno
Localización celular (secretada)
Estabilidad de la proteína
Organismo húesped
Número de copias del gen clonado
Para aumentar la traducción
• Un promotor fuerte producirá mucho mRNA
• Será necesaria una efectiva traducción para
obtener mucha proteína
• DNA
RNA
Proteína
Para aumentar la traducción
• En procariotas
– La señal de traducción es RBS: Ribosome
Binding Site
– Secuencia de Shine-Dalgarno
– 6-8 nt
– Localizada a corta distancia (~10nt) upstream
del codón de iniciación de la traducción AUG
Shine Dalgarno
• Secuencia complementaria a región en 16S rRNA de la
subunidad pequeña del ribosoma
mRNA
5’
UAAGGAGG
AUUCCUCC
3’
AUG
16S rRNA 5’
small ribosomal subunit
3’
Evitar estructura secundaria
Región del codón de iniciación
AUG en extremo 5’ del mRNA
no debe ser complementaria a sí
misma
podría bloquear el movimiento del
ribosoma y evitar la traducción
Uso de codones
• Utilización de codones
– varios codones para cada aminoácido
– algunos codones usados poco frecuentemente
– bajas cantidades de los correspodientes tRNAs
• Organismos diferentes pueden usar
diferentes codones a diferentes frecuencias
Codon Usage in E. coli & humans
Estrategias para optimizar el uso de
codones
• Sintetizar químicamente un nuevo gen
– Alterar la secuencia del gen de interés
– Elegir codones que sean los más usados en el
organismo húesped
• Expresar en un húesped diferente
– Elegir húesped con el mismo uso de codones
• Usar una célula húesped modificada
– Sobreexprese tRNAs de baja abundancia
Vector de expresión pKK233-2
selectable marker
tac promoter
RBS
unique REase sites
Txn terminators
not shown:
ori of replication