Download Tratamiento biológico contra virus de la mancha blanca

1
Fundación Produce Sinaloa, A.C.
Tratamiento biológico
contra virus de la mancha
blanca en camarón
Antonio Luna González1
1 Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo Integral Regional
(CIIDIR), unidad Sinaloa, del Instituto Politécnico Nacional.
2
3
Fundación Produce Sinaloa, A.C.
Índice
INTRODUCCIÓN….........……………………………........7
El camarón estresado es más susceptible a
enfermedades virales……….........................................7
Probióticos, una alternativa contra el virus de la
mancha blanca……………….........................................8
Justificación del proyecto……………………………….9
Objetivos del proyecto………………………………......9
METODOLOGÍA APLICADA…………………………......9
Liofilización de los microorganismos con potencial
probiótico…………….....................................................9
Determinación de la viabilidad y conteo de
unidades formadoras de colonia..................................9
Incorporación de la mezcla probiótica al alimento
balanceado para experimento en granja.....................9
Análisis del sistema inmune de camarones (ensayo
en laboratorio)………..................................................10
Monitoreo del virus de la mancha blanca en
camarones experimentales de granja........................10
Evaluación del alimento con mezcla probiótica en
camarones cultivados….............................................10
RESULTADOS..............................................................11
CONCLUSIONES…………………………………….......16
BIBLIOGRAFÍA……………………………………….......17
4
5
Fundación Produce Sinaloa, A.C.
INTRODUCCIÓN
En el presente folleto encontrará información sobre la estimulación del
sistema inmune2 de camarones blancos portadores del virus del síndrome de la mancha blanca, con bacterias ácido lácticas3 nativas de
Sinaloa adicionadas al alimento de los crustáceos. El estudio se efectuó
en una granja comercial del municipio de Guasave.
El objeto de la investigación fue observar en campo si los microorganismos inmunoestimulan a los camarones, como sucedió en un experimento en laboratorio, donde los camarones tratados con bacterias
ácido lácticas resultaron negativos al virus de la mancha blanca, con
mejor supervivencia y su peso no fue afectado.
En los estanques de la granja donde se realizó el estudio también
se determinó la temperatura, pH, oxígeno disuelto y la salinidad del
agua.
La información que se presenta en este folleto pertenece a los resultados del proyecto Inmunoestimulación de camarones (Litopenaeus
vannamei) infectados con el virus de la mancha blanca en granjas del
municipio de Guasave, Sinaloa, apoyado por Fundación Produce Sinaloa, A. C., durante 2008-2009 a través de su Consejo Consultivo zona
norte.
El camarón estresado es más susceptible a enfermedades virales
La salud de las especies acuáticas está influida por interacciones que
tienen con el medio ambiente y con patógenos.
2 De inmunidad: estado de resistencia, natural o adquirida, que poseen ciertos
individuos o especies frente a determinadas acciones patógenas de microorganismos o sustancias extrañas.
3 Microorganismos que se emplean para prevenir la infección de patógenos.
6
7
Fundación Produce Sinaloa, A.C.
El cultivo de camarón puede degradar el medio ambiente y causar
un significativo estrés en la especie, con lo que se vuelve más susceptible a enfermedades.
En los sistemas de producción de camarón, muchos patógenos4
(como bacterias, hongos y virus) coexisten sin causar un impacto negativo en la producción; sin embargo, algunas infecciones inactivas
pueden desarrollarse en enfermedades agudas si el camarón está estresado, lo que provoca pérdidas significativas en la industria.
Dentro de las enfermedades que afectan al camarón, las virales tienen gran importancia porque pueden provocar mortalidades masivas.
El virus de la mancha blanca (WSSV, por sus siglas en inglés) es en la
actualidad uno de los patógenos más importantes en el cultivo de camarones peneidos en el estado de Sinaloa, en cuanto a mortalidades
se refiere.
Una alterativa contra el virus de la mancha blanca en camarón es el
uso de bacterias benéficas que inmunoestimulen al crustáceo para que
se pueda defender de los patógenos, especialmente cuando las condiciones ambientales le son desfavorables, como los cambios bruscos
de temperatura y salinidad del agua.
Tratamiento biológico contra virus de la mancha blanca en camarón
La finalidad de este proyecto es probar estas cepas en granjas comerciales para determinar si los resultados obtenidos en laboratorio se
repiten en las condiciones reales de cultivo.
Justificación del proyecto
El presente trabajo de investigación tiene como fin el mejoramiento del
cultivo de camarón blanco en Sinaloa.
Como se mencionó anteriormente, el problema de las enfermedades virales en los cultivos, especialmente la mancha blanca, provoca
pérdidas que pueden motivar desde la disminución de la superficie cultivada hasta el cierre de granjas: según autoridades de Guasave, en el
municipio existen 3 mil hectáreas de estanquería de camarón abandonadas, de las que se desconoce cuántas fueron cerradas por motivos
de infecciónes virales.
En el aspecto social, el cultivo de camarón representa una alternativa de empleo a pescadores ribereños sinaloenses que han resultado
golpeados por la baja en la pesca del crustáceo.
Objetivos del proyecto
1. Estimular el sistema inmune de camarones portadores del virus del
síndrome de la mancha blanca con bacterias ácido lácticas adicionadas
al alimento de los crustáceos.
2. Mejorar la producción de granjas camaroneras de Guasave con
problemas de virus de mancha blanca.
Probióticos5, una alternativa contra el virus de la mancha blanca
En acuicultura, el término probiótico se define como un suplemento
microbiano formado por un cultivo simple o mixto de microorganismos seleccionados que son adicionados en los sistemas de producción, con el propósito de reducir o eliminar la incidencia de comunidades microbianas dañinas.
En los camarones peneidos se han probado probióticos en cultivos
larvarios, juveniles y adultos: los resultados han sido un mejor crecimiento, supervivencia y capacidad inmune.
Sin embargo, los probióticos comerciales que se utilizan actualmente en Sinaloa son caros y poco efectivos porque fueron aislados
y probados en otros países, con condiciones ambientales diferentes a
las nuestras. Para garantizar la eficacia de probióticos en el estado es
necesario aislar microorganismos de la región.
En el Centro Interdisciplinario de Investigación para el Desarrollo
Integral Regional (CIIDIR), unidad Sinaloa, se aislaron y probaron (en el
alimento) cinco cepas6 de bacterias ácido lácticas (LTA2, LTA6, LTA8,
LTA10 y LT6) en camarones blancos (Litopenaeus vannamei) cultivados en laboratorio e infectados con el virus de la mancha blanca.
Las bacterias inmunoestimularon a los camarones, el resultado fue
cero camarones positivos al virus de la mancha blanca, mejor supervivencia y su peso no fue afectado.
METODOLOGÍA APLICADA
Liofilización7 de los microorganismos con potencial probiótico. Las
bacterias ácido lácticas (mezcla probiótica) se cultivaron en el medio
Man, Rogosa & Sharp con los nutrientes sacarosa (como fuente de carbono), proteínas y minerales para su buen crecimiento, posteriormente
se secaron en frío para obtener un polvo con bacterias vivas.
Determinación de la viabilidad y conteo de unidades formadoras
de colonia. Para conocer si las bacterias liofilizadas se mantenían vivas,
inmediatamente después de la liofilización, y cada 15 días (por al menos tres meses), se determinó la viabilidad de los microorganismos.
Incorporación de la mezcla probiótica al alimento balanceado para
experimento en granja. La preparación del alimento (Purina) con bacterias liofilizadas consistió en agregar 2 millones de células bacterianas
(400 mil de cada una de las cinco cepas) por gramo de alimento.
El alimento con bacterias activas liofilizadas se preparó cada día
en campo, al momento de la alimentación; se efectuó una suspensión
bacteriana en “Dry Oil” (‘producto que sirve como ligante y atractante
4 Microorganismos causantes de enfermedades.
5 Microorganismos con efecto benéfico para la salud porque regulan la flora
intestinal y potencian el sistema inmunológico.
6 Grupo de organismos dentro de una especie o variedad.
7 Operación que permite conservar, en este caso en bacterias todas sus propiedades mediante congelación. A través de la congelación los microorganismos
pierden humedad y se transforman en polvos ultraligeros.
8
9
Fundación Produce Sinaloa, A.C.
para agregar bacterias o antibióticos al alimento‘). La mezcla se colocó
en una lona de plástico (en el suelo), se agregaron las bacterias por aspersión y se agitó para homogeneizar. El alimento se secó al sol por 15
minutos, sin dejar de revolver para que el secado fuera homogéneo.
También se utilizaron bacterias muertas por calor (a 70 OC) bajo las
mismas concentraciones y condiciones mencionadas en el párrafo anterior, para agregarlas al alimento.
Análisis del sistema inmune de camarones (ensayo en laboratorio). Este experimento duró seis días; se realizó en tinas con 80 litros
de agua de mar filtrada. En cada tina se colocaron 10 camarones de 6
a 8 gramos cada uno.
Se utilizaron tres tratamientos por triplicado: 1) camarones alimentados con Camaronina más Dry Oil; 2) Camaronina más Dry Oil más
mezcla probiótica liofilizada (bacterias vivas); y 3) Camaronina más Dry
Oil más mezcla probiótica secada a 70 OC (bacterias muertas).
Monitoreo del virus de la mancha blanca en camarones experimentales de granja. Para seleccionar la granja de trabajo se analizaron 40
organismos en cuatro estanques (ver Cuadro 3) mediante la técnica de
Reacción en Cadena de la Polimerasa8 (PCR, por sus siglas en inglés),
que consiste en la amplificación de un segmento específico del genoma del virus de la mancha blanca.
Evaluación del alimento con mezcla probiótica en camarones cultivados. El experimento duró aproximadamente 30 días; se realizó en
los cuatro estanques evaluados.
Antes de empezar el estudio se efectuó un monitoreo del virus de
la mancha blanca en camarones, con el objeto de observar si los crustáceos estaban infectados. También se pesaron 30 camarones de cada
estanque por muestreo, capturados al azar (a partir del inicio del experimento) en diferentes zonas de los estanques.
En los estanques 12 y 13 se probó el alimento con la mezcla probiótica, mientras que en el 14 y 15 se empleó el alimento sin la mezcla
probiótica.
Durante la investigación se respetó el manejo tradicional de la granja y la manera de alimentación de los crustáceos. En los estanques
también se determinó la temperatura, pH, oxígeno disuelto y la salinidad del agua al inicio del experimento y cada 10 días.
8 La polimerasa es una enzima que participa en el proceso de duplicación del
material genético, y que en la técnica de PCR se le emplea para aumentar el
número de copias del virus que se estudia y así facilitar su detección.
10
Tratamiento biológico contra virus de la mancha blanca en camarón
Figura 1. Liofilización de bacterias ácido lácticas.
RESULTADOS
Liofilización de las cepas de bacterias ácido lácticas para la prueba de
viabilidad. La liofilización de las cepas de bacterias ácido lácticas (ver
Figura 1) fue un éxito porque después de 22 días de haber sido liofilizadas se tenía un número aceptable de células viables (vivas): por ejemplo, en la cepa LTA2, a temperatura ambiente, en el día uno se contaba
con aproximadamente 13 mil millones de células viables, mientras que
en el día 22 se poseían aproximadamente 5 mil millones de células
viables; esto significa que el productor puede tener células viables en
número suficiente para añadir al alimento (ver Cuadros 1 y 2).
Cuadro 1. Liofilización de bacterias ácido lácticas en el día 1.
Cepa
Unidades formadoras de colonia por gramo en
temperatura ambiente
LTA2
13 mil millones
LTA6
17 mil millones
LTA8
37 mil millones
LTA10
2 mil millones
LT6
Mil millones
11
Fundación Produce Sinaloa, A.C.
Tratamiento biológico contra virus de la mancha blanca en camarón
inmunoestimulaban a los camarones tratados, de la misma forma que
lo hacen las bacterias vivas (liofilizadas). En el ensayo también se incluyó un tratamiento con bacterias vivas para comparar los resultados de
Control I (Camaronina más Dry Oil).
Figura 2. Sembrado de cepas liofilizadas después de las diluciones seriadas decimales.
Células por mililitro (X 100,000)
300
b
b
250
200
a
150
100
50
0
I
Cuadro 2. Prueba de viabilidad después del liofilizado en el día 22.
II
III
Tratamientos
Cepa
Unidades formadoras de colonia por
gramo en temperatura ambiente
Unidades formadoras de colonia por
gramo en temperatura ambiente
LTA2
5 x 109
5 mil millones
I (Camaronina® más Dry Oil); II (Camaronina® más Dry Oil más bacterias ácido lácticas
vivas); III (Camaronina® más Dry Oil más bacterias ácido lácticas muertas). Superíndices
distintos indican diferencias significativas (P<0.05). Barras de error = promedio ± error
estándar.
LTA6
2.32 x 10
232 millones
Figura 3. Promedio de hemocitos en cada tratamiento al final del experimento.
9
40 mil millones
LTA8
4.36 x 10
LTA10
1.92 x 109
Mil 900 millones
LT6
5.38 x 108
536 millones
10
Conteo para determinar la viabilidad de las cepas. Los resultados
(ver Figura 2, Cuadros 1 y 2) muestran el número de células viables en
el día 1 y 22 del análisis.
Aunque la disminución de la viabilidad es notoria en el día 22, se
presentó un número aceptable de células viables como para mantenerlas a temperatura ambiente en la granja y diariamente adicionarlas al
alimento de los camarones.
La preparación del alimento (Purina) con bacterias liofilizadas consistió en agregar 2 millones de células bacterianas (400 mil de cada una
de las cinco cepas) por gramo de alimento. Es importante mencionar
que la cantidad de alimento que se proporciona diariamente la determina el productor, dependiendo de la biomasa de camarón que posea en
el estanque; generalmente la ración se otorga a diario, partida en dos:
una mitad en la mañana y la otra en la tarde.
Análisis del sistema inmune de camarones. Se realizó un ensayo
de seis días en el laboratorio para ver si las bacterias muertas por calor
12
Cuadro 3. Granjas camaroneras encuestadas en Guasave, Sinaloa.
Nombre de la granja
Encargado o persona responsable
S. S. S. Agapito Leal Cota
Sergio Ramón Contreras
Finca Doña Luisa
Rosario Peñuelas
Productos Pesqueros del Évora
Gonzalo Leal
Acuícola El Cuate Machado
Adolfo Ramírez Gutiérrez
Los resultados mostraron que el Control I presentó una concentración de 15 millones de hemocitos9, mientras que los tratamientos con
bacterias vivas y muertas manifestaron 25 millones de hemocitos (ver
Figura 3).
Como las bacterias vivas o muertas adicionadas al alimento inmunoestimulan al camarón, se decidió trabajar en la granja con bacterias
muertas por calor a 70 OC, por su facilidad de manejo y por la rapidez
con la que se prepara el alimento.
9 Células del sistema inmune del camarón.
13
Fundación Produce Sinaloa, A.C.
1
2
3
4
(+)
(-)
M
10,000
1,000
570
600
200
Donde: Carriles 1-4 “Pools” (‘toma de tejido de camarones para posteriormente mezclarlos y determinar la presencia de mancha blanca’) de 10 camarones de un estanque. Carril
6, control positivo. Carril 7, control negativo. Carril 8 (M), marcador de peso molecular.
Producto esperado = 570 pares de bases.
2
3
4
570
(+)
(-)
10,000
1,000
Cuadro 4. Parámetros fisicoquímicos determinados en los estanques
experimentales.
M
600
Parámetro
fisicoquímico
Estanque 12
Estanque 13
Estanque 14
Estanque 15
200
Salinidad (en gramos por
litro de agua)
De 46.8 a
57.2
De 47.67 a
51.67
De 47.4 a
52.6
De 44.43 a
54.23
Oxígeno disuelto (en miligramos por litro de agua)
De 3.81 a
9.01
De 5.12 a
7.12
De 4.56 a
7.16
De 4.18 a 7.18
Temperatura (en OC)
De 28.88 a
31.28
De 28.86 a
30.26
De 28.9 a
31.3
De 29.17 a
31.37
pH
De 7.77 a
7.89
De 7.71 a
7.83
De 7.53 a
7.93
De 7.47 a 8.27
Donde: Carriles 1-4 Pools de 10 camarones de un estanque. Carril 6, control positivo.
Carril 7, control negativo. Carril 8 (M), marcador de peso molecular. Producto esperado
= 570 pares de bases.
Figura 5. Análisis del virus de la mancha blanca en la granja Productos Pesqueros del Évora.
Granjas camaroneras encuestadas. Para seleccionar la granja de
trabajo se encuestaron cuatro granjas camaroneras de Guasave (ver
Cuadro 3) que habían presentado problemas con el virus de la mancha
blanca.
Determinación de la presencia del virus de la mancha blanca para
la selección de la granja de trabajo. Se efectuó un análisis de virus de
la mancha blanca en dos granjas (La Esperanza y Productos Pesqueros
del Évora); ambas resultaron positivas (ver Figuras 4 y 5). Sin embargo,
debido a la falta de personal que administrara diariamente el alimento
con bacterias en estos estanques, se decidió trabajar en la granja El
Futuro.
14
Evaluación del alimento con probióticos en camarones cultivados
Granja El Futuro. Esta granja contaba con cuatro estanques de una
hectárea, con camarones de 4 gramos positivos a virus de la mancha
blanca, por lo que no fue necesario analizarlos para la detección del
patógeno.
El experimento se realizó a partir del 29 de mayo de 2009, en los
cuatro estanques: dos en los que se proporcionó alimento tratado con
bacterias ácido lácticas, y dos con alimento sin microorganismos. El
estudio terminó el 29 de junio de 2009.
Durante la investigación también se determinaron los parámetros fisicoquímicos temperatura, salinidad, oxígeno disuelto y pH en los cuatro estanques, en tres ocasiones, a lo largo del mes del experimento.
Parámetros fisicoquímicos
El Cuadro 4 muestra los resultados de los parámetros fisicoquímicos
determinados en los cuatro estanques de cultivo experimental. Los
valores promedio de temperatura, oxígeno disuelto y pH no variaron
demasiado en los cuatro estanques; los valores de salinidad en los estanques 13, 14 y 15 fueron muy similares (50 gramos por litro, en
promedio), sin embargo, en el 12 el valor llegó hasta los 57 gramos
por litro.
Figura 4. Análisis del virus de la mancha blanca en la granja comercial La Esperanza.
1
Tratamiento biológico contra virus de la mancha blanca en camarón
Análisis del virus de la mancha blanca
A los 15 días de iniciado el experimento en la granja El Futuro se realizó
un análisis del virus de la mancha blanca en camarones de los cuatro
estanques de estudio (ver Cuadro 5). En los estanques 12 y 13 tratados
con bacterias los resultados mostraron que cinco de los ocho pools
(pool= 10 camarones) fueron positivos para el patógeno, mientras que
los estanques 14 y 15 (Control I), siete de los ocho pools fueron positivos al virus.
15
Fundación Produce Sinaloa, A.C.
Cuadro 5. Análisis del virus de la mancha blanca en cuatro estanques
de la granja El Futuro.
Pool
Estanque 12
Estanque 13
Estanque 14
Estanque 15
1
+
+
-
+
2
+
-
+
+
3
-
+
+
+
4
-
+
+
+
Donde: (+)= Camarones positivos a virus de la mancha blanca, (-)= Camarones negativos a virus de la mancha blanca. Pool= 10 camarones.
Producción de los estanques
La producción de camarón aumentó 5% en los estanques tratados con
bacterias, esto en comparación con los estanques en los que no se
emplearon microorganismos: en los estanques 12 y 13 (tratados con
bacterias) la producción fue de 715 y 661 kilogramos por hectárea, respectivamente; mientras que en los estanques 14 y 15 (sin tratamiento)
la producción fue de 671 y 359 kilogramos por hectárea, respectivamente. Estos valores se traducen en un aumento de mil 250 pesos por
hectárea, a favor del empleo de bacterias ácido lácticas.
CONCLUSIONES
1. Se constató que las bacterias ácido lácticas adicionadas al alimento
estimulan el sistema inmune de camarones cultivados.
2. Se necesitan 2 millones de bacterias adicionadas al alimento para
provocar un aumento significativo en el número de hemocitos en camarones cultivados.
3. La producción de camarón aumentó 5% en los estanques tratados
con bacterias respecto a la producción que presentaron los estanques
en los que no se emplearon estos microorganismos. Esta diferencia
representa un aumento de mil 250 pesos por hectárea en la ganancia
del productor.
4. Es necesario agregar las bacterias en el alimento comercial desde
la planta procesadora de alimento debido a que es poco práctico hacerlo en la granja, previo a la alimentación de los camarones.
5. Para generar una mejor protección e incrementar la producción de
camarón se recomienda dar el alimento con bacterias desde el principio del ciclo de cultivo (a partir de camarones de 0.5 gramos de peso).
16
Tratamiento biológico contra virus de la mancha blanca en camarón
BIBLIOGRAFÍA
Bradford, M. M. 1976. “A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of
protein–dye binding”, Anal. Biochem. 72:248–54.
Campa-Córdova, A. I.; N. Y. Hernández-Saavedra; R. de Philippis;
and F. Ascencio. 2002. “Generation of superoxide anion and SOD activity in haemocytes and muscle of American white shrimp (Litopenaeus
vannamei) as a response to glucan and sulphated polysaccharide”, Fish
& Shellfish Immunol. 12:353-366.
Downs, C.; J. E. Fauth; and C. M. Woodley. 2001. “Assessing the
health of grass shrimp (Palaeomonetes pugio) exposed to natural and
anthropogenic stressors: a molecular biomarker system”, Mar. Biotechnol. 3:380-397.
Gatesoupe, F. J. 1997. “Siderophor production and probiotic effect
of Vibrio sp. associated with turbo larvae, Scophthalmus maximus”,
Aquatic Living Resources. 10:239-246.
Gullian, M.; F. Thompson; and J. Rodríguez. 2004. “Selection of probiotic bacteria and study of their immunostimulatory effect in Penaeus
vannamei”, Aquaculture. 233:1-4.
Hutchinson, T. H. and M. J. Manning. 1996.” Seasonal trends in
serum lysozyme activity and total protein concentration in dab (Limanda limanda L.) sampled from Lyme Bay, U.K.”. Fish & Shellfish Immunol. 6:473-482.
Jiqiu, L.; T. Beiping; M. Kangsen; A. Qinghui; Z. Wenbing; X. Wei; L.
Zhiguo; and M. Hongming. 2006. “Comparative study between probiotic bacterium Arthrobacter XE-7 and chloramphenicol on protection of
Penaeus chinensis post-larvae from pathogenic vibrios”, Aquaculture.
253:140-147.
Kimura, T.; K. Yamano; H. Nakano; K. Momoyama; M. Hiraoka; and
K. Inouye. 1996. “Detection of penaeid rod-shaped DNA virus (PRDV)
by PCR”, Fish Pathol. 31:93–98.
Matsuda, M.; T. Yamori; M. Naitoh; and k. Okutani. 2003. “Structural
revision of sulfated polysaccharide B-1 isolated from a marine Pseudomonas species and its cytotoxic activity against human cancer cell
lines”, Mar Biotechnol. 5:13-19.
Peinado-Guevara, L. I. and M. López-Meyer. 2006. “Detailed monitoring of white spot syndrome virus (WSSV) in shrimp commercial ponds
in Sinaloa, Mexico by nested PCR”, Aquaculture. 251:33–45.
Rengpipat, S.; W. Phianphak; S. Piyatiratitivorakul; and P. Menasveta. 1998. “Effects of a probiotic bacterium on black tiger shrimp Penaeus monodon survival and growth”, Aquaculture. 167:301–313.
Rengpipat, S.; S. Rukpratanporn; S. Piyatiratitivorakul; and P. Menasaveta. 2000. “Immunity enhancement on black tiger shrimp (Penaeus monodon) by a probiont bacterium (Bacillus S11)”, Aquaculture.
191:271–288.
17
Fundación Produce Sinaloa, A.C.
Vargas-Albores, F.; M. A. Guzmán-Murillo; and J. L. Ochoa. 1993.
“An anticoagulant solution for haemolymph collection and prophenoloxidase studies of Penaeid shrimp (Penaeus californiensis)”, Comp.
Biochem. Physiol. A 106:299–303.
Verschuere, L.; G. Rombaut.; P. Sorgeloos; and W. Verstraete. 2000.
“Probiotic bacteria as biological agents in aquaculture”, Microbiology
and Molecular Biology Reviews. 64:655-671.
Ziaei-Nejad, S.; M. H. Rezaei; G. A. Takami; D. L. Lovett; A. R. Mirvaghefi; and M. Shakouri. 2006. “The effect of Bacillus spp. bacteria
used as probiotics on digestive enzyme activity, survival and growth
in the Indian white shrimp Fenneropenaeus indicus”, Aquaculture.
252:516-524.
18
19