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2° Congreso Nacional de Química Médica
Monroy y col.
MODIFICACIÓN DEL ESTADO DE
FOSFORILACIÓN INDUCIDO POR INSULINA EN
EL MÚSCULO ESQUELÉTICO HUMANO.
Monroy Adriana, Carroll CA, Chávez-Velázquez AO, Barrentine A, Abdul-Ghani M, Weintraub S*,
DeFronzo RA and Folli F. Diabetes Division. Medicine Department and *Biochemistry Department.
University of Texas Health Science Center at San Antonio 7703 Floyd Curl Dr., San Antonio,
Texas, USA. Correo: monroy@uthscsa.edu
RESUMEN
El músculo esquelético y el hígado son tejidos que responden activa y rápidamente a la
insulina. En el músculo esta respuesta induce una compleja y especializada red de
fosforilaciones/defosforilaciones de proteínas. En este trabajo, analizamos el estado de
fosforilación de proteínas citoplasmáticas de músculo esquelético humano en estado
basal y después de estimulación con insulina utilizando una nueva tinción en gel
especifica para fosfoproteínas. METODOS. A voluntarios sanos se les realizaron biopsias
musculares a los 0, 30 y 240 min. durante un clamp euglicémico. Aproximadamente, 75
mg. de tejido fueron fraccionados para enriquecerlos en proteínas citoplásmicas. Los
homogenados fueron procesados para electroforesis de dos dimensiones (2-DE) por
duplicado y los geles fueron teñidos con Pro-Q Diamond, para detectar proteínas
fosforiladas, desteñidos y reteñidos con SYPRO Ruby para visualizar todas las proteínas
presentes en el homogenado. Las imágenes fueron analizadas usando el programa
PDQuest 8.0. Los puntos de interés fueron cortados y digeridos in situ con tripsina y
posteriormente analizados mediante HPLC-ESI-MS/MS. Las proteínas fueron
identificadas y los sitios de fosforilación determinados utilizando la base de datos
SwissProt. RESULTADOS. Detectamos aproximadamente 75 proteínas fosforiladas de
un total de 200-300 proteínas visibles. Hemos identificado mas de 25 proteínas que
fueron fosforiladas/defosforiladas después del estimulo con insulina mediante
espectrometría de masas. CONCLUSION. El perfil fosfoproteico obtenido combinando 2DE y teñido múltiple nos permite analizar los cambios in vivo al fosfoproteoma producidos
por la estimulación por insulina en el músculo esquelético humano y nos permitirá
identificar alteraciones especificas relevantes en la resistencia a la insulina y diabetes.
Palabras clave: Diabetes, mitocondria, fosforilación.
INTRODUCCIÓN
En pacientes con diabetes mellitus tipo 2 (DMT2) el músculo, el hígado y el tejido
adiposo son resistentes a la acción de la insulina, y aunque mecanismos compensatorios
inducen una mayor secreción de insulina por parte de las células
pancreáticas, la
respuesta hiperinsulinemica no es suficiente para mantener los niveles sanguíneos de
glucosa dentro de rangos fisiológicos. En nuestro laboratorio estamos interesados en
caracterizar las vías metabólicas que llevan al desarrollo de resistencia a la insulina en el
músculo esquelético. La señalización de la insulina en el músculo esta mediada por una
compleja red de fosforilaciones/defosforilaciones de proteínas, es por ello que en este
trabajo analizamos el estado de fosforilación de proteínas citoplasmáticas de músculo
esquelético humano en estado basal y después de estimulación con insulina utilizando
una nueva tinción en gel específica para fosfoproteínas.
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Monroy y col.
MÉTODOS
A voluntarios sanos se les realizaron biopsias percútaneas del vastus lateralis a
los 0, 30 y 240 min durante un clamp euglicémico con una velocidad de infusión de
insulina de 80 mU/m2/min. Aproximadamente 75 mg. de tejido fueron fraccionados
mediante centrifugación diferencial para enriquecerlos en proteínas citoplásmicas. Las
proteínas citoplásmicas fueron separadas por electroforesis en gel de dos dimensiones
(2-DE) por duplicado, los geles fueron teñidos con Pro-Q Diamond, para detectar
proteínas fosforiladas, desteñidos y reteñidos con SYPRO Ruby para visualizar todas las
proteínas presentes. Las imágenes fueron obtenidas mediante el FX Pro Plus fluorescent
imager (Bio-Rad), y analizadas usando el programa PDQuest 8.0. Los puntos de interés
fueron cortados y digeridos in situ con tripsina y posteriormente analizados mediante
HPLC-ESI-MS/MS. Las proteínas fueron identificadas y los sitios de fosforilación
determinados utilizando la base de datos SwissProt.
RESULTADOS
Las características clínicas de los sujetos se muestran en la siguiente tabla:
Genero (H/M)
Edad
2
IMC (kg/m )
HbA1C (%)
M (mg/kg.min)
Insulin (pg/ml
4/0
45±11
26.7±1.8
5.7±0.05
8.2±1.7
5.57±0.95
Un ejemplo de geles con expresión diferencial de fosfoproteínas después de
estimulación con insulina se muestra a continuación. Los círculos rosas muestra
proteínas con un aumento en la fosforilación después del estimulo con insulina y los
círculos azules una disminución.
240’
Insulin
Basal
Q2-CF
Q1Q2-CF
CF
Detectamos mediante la tinción con ProQ-Diamond aproximadamente 75
proteínas fosforiladas de un total de 200-300 proteínas visibles en Sypro. Del total de
proteínas visibles 13 presentan un incremento en expresión después del estimulo con
insulina y 12 una disminución. Se observa defosforilación en 43 proteínas después del
estimulo con insulina y en 23 un incremento en fosforilación comparadas con el estado
basal. Hemos identificado mas de 25 proteínas que fueron fosforiladas/defosforiladas
después del estimulo con insulina mediante espectrometría de masas.
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CONCLUSIÓN
El perfil fosfoproteico obtenido combinando 2-DE y teñido múltiple nos permite
analizar los cambios in vivo al fosfoproteoma producidos por la estimulación por insulina
en el músculo esquelético humano y nos permitirá identificar alteraciones especificas
relevantes en la resistencia a la insulina y diabetes.
BIBLIOGRAFIA
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