Download (bnct) mediada por gb-10

LA ELECTROPORACIÓN AUMENTA EL CONTROL TUMORAL INDUCIDO POR LA
TERAPIA POR CAPTURA NEUTRÓNICA EN BORO (BNCT) MEDIADA POR GB-10 EN EL
MODELO DE CANCER BUCAL EN HAMSTER
§
Garabalino, M.A.1,§Olaiz, N.2,3, Pozzi, E.C.C.1, Thorp, S.1, Curotto, P.1, Itoiz, M.E.1,4, Aromando,
R.4, Portu A.1,2, Saint Martin, G.1, Monti Hughes, A.1, Trivillin, V.A.1,2, Marshall, G.2,3, Schwint,
A.E.1.2
§
Estos autores contribuyeron en igual proporción
1
CNEA; 2CONICET; 3FCEyN, UBA; 4FOUBA
e-mail: garabalino@cnea.gov.ar; nolaiz@dc.uba.ar
Resumen
Introducción y objetivo: BNCT se basa en la reacción de captura entre el 10B localizado
preferencialmente en tumor y los neutrones térmicos, generando partículas letales de corto
alcance que dañan al tumor, preservando el tejido normal. Un aspecto crítico en la eficacia
terapéutica de BNCT es la biodistribución de 10B en tumor y en los tejidos normales que se
desea preservar. Dado que se ha demostrado que la electroporación (EP) puede actuar como
un sistema no específico de administración de agentes antitumorales, el objetivo del presente
trabajo fue evaluar si la EP podría mejorar el targeting de 10B en BNCT mediado por el
compuesto borado GB-10, aumentando la respuesta tumoral en el modelo in vivo de cáncer
bucal en hámster. Asimismo, se evaluó el efecto de la EP post-administración de GB-10 en la
concentración promedio de 10B en tumor, tejido precanceroso y tejido normal. Materiales y
métodos: las bolsas de las mejillas del hámster portadoras de tumores (cancerizadas con
DMBA), fueron expuestas a: 1) GB-10/BNCT sin EP (n=33 tumores) y 2) GB-10/BNCT+EP
temprano (n=46 tumores). Las irradiaciones se llevaron a cabo en la facilidad térmica del
reactor RA-3 en el Centro Atómico Ezeiza con una fluencia de 1,9 x 1012 n/cm2. La respuesta
tumoral y el grado de mucositis se evaluaron a los 7, 14, 21 y 28 días post-irradiación. En
grupos adicionales se realizaron estudios de biodistribución de 10B con 1) GB-10 sin EP (n=20
tumores) y 2) GB-10 + EP temprana (n=13 tumores). Las muestras de tejidos se tomaron 3 hs
post-administración de GB-10 y se procesaron por digestión ácida para medir la concentración
de 10B mediante la técnica de ICP-MS. Resultados: Se observó un aumento significativo de las
remisiones completas de los tumores del protocolo GB-10/BNCT sin EP vs el protocolo GB10/BNCT+EP temprano del 6% al 48%. De igual manera, el control tumoral (remisión completa
+ remisión parcial) del protocolo GB-10/BNCT sin EP vs GB-10/BNCT+EP presentó un
incremento significativo del 48% al 92%. En ambos protocolos la toxicidad (mucositis) en tejido
precanceroso fue reversible y leve. Los estudios de biodistribución mostraron que la
concentración media de 10B en tumor en el caso de GB-10 + EP temprano fue
significativamente mayor que en el caso de GB-10 sin EP. Conclusión: La EP mejora la
eficacia terapéutica de GB-10-BNCT en el modelo in vivo de cáncer bucal sin inducir mucositis
severa en el tejido precanceroso limitante de dosis. Los estudios de biodistribución sugieren
que un aumento en la concentración media de 10B en los tumores inducida por EP temprana
contribuiría al aumento en el control tumoral. Estudios de autorradiografía neutrónica
preliminares y en curso intentan determinar si la EP induce cambios en la microdistribución de
boro en los tumores que podrían explicar el aumento en la eficacia terapéutica de BNCT, tal
como lo describimos previamente en estudios de normalización de vasos sanguíneos
aberrantes en tumores del mismo modelo.
ELECTROPORATION INCREASES TUMOR CONTROL INDUCED BY BORON NEUTRON
CAPTURE THERAPY (BNCT) MEDIATED BY GB-10 IN THE HAMSTER CHEEK POUCH
ORAL CANCER MODEL
§
Garabalino, M.A.1,§Olaiz, N.2,3, Pozzi, E.C.C.1, Thorp, S.1, Curotto, P.1, Itoiz, M.E.1,4, Aromando,
R.4, Portu A.1,2, Saint Martin, G.1, Monti Hughes, A.1, Trivillin, V.A.1,2, Marshall, G.2,3, Schwint,
A.E.1.2
§
These authors contributed equally
1
CNEA; 2CONICET; 3FCEyN, UBA; 4FOUBA
e-mail: garabalino@cnea.gov.ar; nolaiz@dc.uba.ar
Abstract
Introduction and aim: BNCT is based on the capture reaction between 10B localized
preferentially in tumor and thermal neutrons, generating short-range lethal particles that
damage the tumor while preserving healthy tissue. A critical aspect of the therapeutic efficacy
of BNCT is the biodistribution of 10B in tumor and the normal tissues we wish to preserve. Given
that electroporation (EP) can act as a non-specific system to administer anti-tumoral agents, the
aim of the present study was to evaluate if EP could improve the targeting of 10B in BNCT
mediated by the boron compound GB-10, thus increasing tumor response in vivo in the hamster
cheek pouch oral cancer model. In addition, we evaluated the effect of EP post-administration of
GB-10 on the mean boron concentration of 10B in tumor, precancerous tissue and normal tissue.
Materials and methods: tumor bearing hamster cheek pouches (cancerized with DMBA) were
treated with: 1) GB-10/BNCT without EP (n=33 tumors) and 2) GB-10/BNCT+EP early (n=46
tumors). Sample irradiations were carried out in the thermal facility of the RA-3 Reactor in the
Centro Atómico Ezeiza with a neutron fluence of 1,9 x 10 12 n/cm2. Tumor response and degree
of mucositis were evaluated 7, 14, 21 and 28 days post-irradiation. In additional groups we
performed biodistribution studies of 10B with 1) GB-10 without EP (n=20 tumors) and 2) GB-10 +
EP early (n=13 tumors). Tissue samples were taken 3 hs post-administration of GB-10 and
processed by acid digestion to measure concentration of 10B by ICP-MS. Results: We observed
a statistically significant increase in complete remission of tumors from protocol GB-10/BNCT
without EP (6%) to protocol GB-10/BNCT+EP early (46%). Likewise, overall tumor control
(complete remission + partial remission) increased significantly from protocol GB-10/BNCT
without EP (48%) to protocol GB-10/BNCT+EP early (92%). For both protocols toxicity
(mucositis) in precancerous tissue was reversible and slight. Biodistribution studies revealed
that mean 10B concentration in tumor in the case of GB-10 + EP early was significantly higher
than in the case of GB-10 without EP. Conclusion: EP increases therapeutic efficacy of GB-10BNCT in vivo in the hamster cheek pouch oral cancer model without inducing severe mucositis
in the dose-limiting precancerous tissue. Biodistribution and preliminary neutron
autoradiography studies suggest that improvement in the uptake and microdistribution of GB-10
in tumor induced by early EP would contribute to enhanced therapeutic efficacy in the hamster
cheek pouch oral cancer model.
LA ELECTROPORACIÓN AUMENTA EL CONTROL TUMORAL INDUCIDO POR LA
TERAPIA POR CAPTURA NEUTRÓNICA EN BORO (BNCT) MEDIADA POR GB-10 EN EL
MODELO DE CANCER BUCAL EN HAMSTER
§
Garabalino, M.A.1,§Olaiz, N.2,3, Pozzi, E.C.C.1, Thorp, S.1, Curotto, P.1, Itoiz, M.E.1,4, Aromando,
R.4, Portu A.1,2, Saint Martin, G.1, Monti Hughes, A.1, Trivillin, V.A.1,2, Marshall, G.2,3, Schwint,
A.E.1.2
§
Estos autores contribuyeron en igual proporción
1
CNEA; 2CONICET; 3FCEyN, UBA; 4FOUBA
e-mail: garabalino@cnea.gov.ar; nolaiz@dc.uba.ar
Introducción y objetivo
La Captura Neutrónica en Boro como terapia para tumores constituye una aplicación de la
tecnología nuclear al área biomédica, cuyo objetivo es dañar selectivamente el tejido
neoplásico, preservando el tejido sano. Las dos componentes de esta terapia binaria son la
administración de compuestos borados que se acumulan preferencialmente en el tumor y la
irradiación externa con neutrones epitérmicos o térmicos. La reacción de captura entre un
neutrón térmico y un átomo de 10B genera una partícula alfa (4He) y un núcleo de 7Li, de alta
transferencia lineal de energía (LET) y corto alcance (5 a 9 µm, del orden del diámetro de una
célula) en el tejido (Locher 1936). De esta manera, la reacción de captura afectará mayormente
a las células tumorales, sin producir daño significativo al tejido sano (Coderre y Morris, 1999).
Los ensayos clínicos de BNCT para el tratamiento de glioblastoma multiforme y melanoma, y
más recientemente, cáncer de cabeza y cuello y metástasis hepáticas ya realizados y/o en
curso en EE.UU., Comunidad Europea, Finlandia, Argentina, Japón y Taiwan, han demostrado
una potencial ventaja terapéutica para esta técnica (por ejemplo González et al., 2004; Zonta et
al., 2006; Kankaanranta et al., 2011, 2012; Wang et al., 2011). Sin embargo, nuevos
experimentos resultan necesarios para contribuir a mejorar la eficacia terapéutica de BNCT así
como reducir la toxicidad en tejidos limitantes de dosis. Nuestros primeros esfuerzos estuvieron
dirigidos a explorar lo que era en ese momento una nueva aplicación potencial de BNCT: el
tratamiento del cáncer de cabeza y cuello. A pesar de que se han logrado modestas mejorías
mediante la combinación de cirugía y radio y quimioterapia, la sobrevida a 5 años del 52% no
ha mejorado significativamente (Kato et al., 2009; Kankaanranta et al., 2012). Asimismo, con
frecuencia, las cirugías son mutilantes. Un objetivo importante de una nueva terapia para esta
patología sería la preservación de la estructura y función de las estructuras anatómicas. Dentro
de este marco, propusimos y validamos el modelo experimental de cáncer bucal en la bolsa de
la mejilla del hámster para estudios de BNCT, demostrando la incorporación a tumor de los
compuestos borados borofenilalanina (BPA), decahidrodecaborato de sodio (GB-10) y
mercaptoundecahidro-closo-dodecaborato de sodio (BSH), todos portadores de boro aceptados
para su uso en la clínica (ej. Kreimann et al., 2001a; Heber et al., 2004; Garabalino et al., 2013;
Garabalino et al., 2014). Este modelo, ampliamente aceptado como modelo de cáncer bucal
(Salley, 1954; Shklar et al., 1979; Vairaktaris et al., 2008; Chen y Lee, 2010), tiene la ventaja
que los tumores se inducen por un proceso que imita la carcinogénesis espontánea en la
mucosa oral humana. Esta forma de inducción tumoral da lugar a la formación de tejido
precanceroso alrededor de los tumores. La posibilidad de contar con tejido precanceroso para
los estudios de BNCT es muy valiosa dada su relevancia clínica. El tejido precanceroso es
potencialmente limitante de la dosis que se puede administrar al tumor y puede originar
recurrencias locoregionales que son causa frecuente del fracaso terapéutico (Braakhuis et al.,
2003; Kankaanranta et al., 2007). Demostramos por primera vez la eficacia de BNCT mediado
por BPA, GB-10 y (BPA + GB-10) para el tratamiento del cáncer bucal en el modelo de
hámster, sin radiotoxicidad en el tejido normal (Kreimann et al., 2001b; Trivillin et al., 2006). Los
estudios con BPA-BNCT fueron precursores de los primeros ensayos clínicos de BNCT para el
tratamiento de tumores de cabeza y cuello en Japón (Kato et al., 2004) y más recientemente en
Finlandia (Kankaanranta et al., 2007; Kankaanranta et al., 2012). Si bien estos estudios
arrojaron resultados alentadores en términos de control tumoral, estudios posteriores en los
cuales se ensayaron nuevas estrategias de aplicación de BNCT, contribuyeron a optimizar el
control tumoral y a reducir la mucositis que se desarrolla en el tejido precanceroso y que limita
la dosis que se puede administrar a tumor (ej. Molinari et al., 2011, 2012, 2014; Monti Hughes
et al., 2015).
Múltiples estudios han demostrado que la biodistribución de los compuestos borados en
tumor en cuanto a la concentración absoluta y relativa de 10B, su retención, homogeneidad de
targeting y microdistribución, condicionan la eficacia terapéutica de BNCT (ej. Hopewell et al.,
2011). Resulta de particular interés optimizar la biodistribución de compuestos borados
autorizados para su uso en humanos ya que esto acortará la brecha entre la investigación y la
potencial aplicación clínica.
Dentro de este marco, el propósito del presente estudio fue estudiar la factibilidad de mejorar
el targeting de boro en tumores del modelo de cáncer bucal en hámster mediante la técnica de
electroporación y de éste modo evaluar la eficacia terapéutica de BNCT+EP in vivo. La
electropermeabilización / electroporación y en particular la electroquimioterapia (ECT Electrochemotherapy) aprobada en la comunidad europea (2006) para el tratamiento de
tumores cutáneos y subcutáneos ha demostrado ser un excelente facilitador en la
biodistribución en tumor de un agente antitumoral. El tratamiento consiste en la administración
del agente antitumoral por vía endovenosa seguida de la EP. La misma se lleva a cabo
mediante la aplicación de pulsos de frecuencia e intensidad apropiada al tejido biológico a
través de electrodos que actúan como una interfaz específica. El voltaje y la corriente aplicada
al tumor dependen del tipo y las características eléctricas del tejido biológico, tales como
conductividad eléctrica y permeabilidad (Domanico et al., 2015). La EP induce la apertura de
poros en las células tumorales permitiendo el ingreso del fármaco. Este procedimiento
incrementa la potencia del agente dentro del tumor unas 1000 veces (Mir et al, 2006; Marty et
al., 2006; Mir et al, 2006; Cemazar et al, 2008, Tellado et al, 2014; Olaiz et al, 2014; Maglietti et
al, 2013). En la actualidad la ECT se utiliza para el tratamiento de melanomas, sarcomas, y
otros tipos de cáncer de piel y tumores malignos subcutáneos. Con respecto a cánceres de
cabeza y el cuello, este procedimiento está indicado en tumores primarios avanzados que no
son candidatos para la terapia estándar, metástasis cutáneas, recurrencias locales y
metástasis y tumores secundarios de la región anterior de la cavidad oral (lengua, los labios y
el paladar) (Domanico et al., 2015).
En estudios previos realizados por nuestro grupo de trabajo pudimos establecer las
condiciones óptimas de EP in vivo en el modelo de cáncer bucal en hámster (Garabalino M &
Olaiz N, et al., AATN 2014). Un análisis retrospectivo de las condiciones de EP indicó que los
ensayos se realizaron en un rango de conductividad comprendido entre 0,0055-0,055 S/cm. El
análisis detallado de los datos de respuesta tumoral y la conductividad tumoral durante la EP
nos permitió calcular un índice de EP efectiva (IEPE), con el cual pudimos determinar la
corriente denominada “Límite” (en [A]), necesaria en cada pulso para que la EP sea efectiva
para un volumen tumoral establecido. Dado que la relación entre la corriente límite I y el
volumen tumoral indica si la corriente aplicada al tumor fue suficiente o no para lograr una EP
efectiva, pudimos evaluar si era necesario volver a aplicar el tratamiento.
Dado que se ha demostrado que la electroporación (EP) puede actuar como un sistema no
específico de administración de agentes antitumorales, el objetivo del presente trabajo fue
evaluar mediante estudios de biodistribución de GB-10 y medición de boro en tejidos por ICPMS y estudios preliminares de autorradiografía neutrónica si la EP aplicada en diferentes
etapas post-administración de GB-10 podría aumentar la concentración y microdistribución de
10
B en tumor y de ésta manera mejorar la eficacia terapéutica de BNCT mediada por GB-10 en
el modelo in vivo de carcinoma de células escamosas en la bolsa de la mejilla del hámster.
Materiales y métodos
Se indujeron tumores exofíticos (Carcinoma de Células Escamosas) en las bolsas
derechas de las mejillas de hamsters Sirios mediante cancerización con una solución de
dimetilbenzantraceno (DMBA) 1,5% en aceite mineral, topicando dos veces por semana
durante 12 semanas (Pozzi et al., 2009). Este proceso de carcinogénesis provoca el desarrollo
de tumores rodeados de tejido precanceroso. Las bolsas izquierdas no fueron topicadas.
Las soluciones de GB-10 (Decahidrodecaborato de sodio), se elaboraron mediante una
dilución 1/10 con agua MiliQ de una solución concentrada de GB-10 (100 mg 10B/ml), el mismo
día que los estudios de EP/ Biodistribución ó EP/BNCT. El compuesto borado fue administrado
por vía intravenosa (iv) a una dosis de 50 mg 10B/Kg, bajo sedación con ketamina/xilacina.
Las Electroporaciones se realizaron utilizando un electroporador (BTX ECM 830 Harvard
Apparatus) según la secuencia de pulsos típica para ECT (1000 v/cm, 8 pulsos de 100 µs). La
corriente eléctrica fue medida mediante una sonda de 1 ohm y un osciloscopio digital
(InfiniiVision DSO-X 2012A-SGM, Agilent Technologies, USA) sobre la base de estudios
previos.
Utilizando el compuesto borado GB-10 y variando el momento de aplicación de la EP
con respecto a la administración de dicho compuesto, se evaluaron los siguientes protocolos y
controles para los estudios de biodistribución:
(P1B) Protocolo GB-10/EP tardía: GB-10, 50 mg
hs) – sacrificio y toma de muestras (t=3 hs)
10
B/Kg intravenoso (iv) (t=0 min) – EP (t=2:50
(P2B) Protocolo GB-10/EP temprana: GB-10, 50 mg
sacrificio y toma de muestras (t=3 hs)
10
B/Kg iv (t=0 min) - EP (t=10 min) –
(P3B) Control GB-10 sin EP: GB-10, 50 mg 10B/Kg iv (t=0 min) – sacrificio y toma de muestras
(t=3 hs)
Las muestras de sangre, tumor, tejido normal y tejido precanceroso se tomaron 3 hs
post-administración de GB-10 y se procesaron por digestión ácida con sulfonítrica 1:1
(H2SO4/HNO3) para medir la concentración de 10B mediante la técnica de ICP-MS.
La técnica de autorradiografía neutrónica cualitativa se empleó para estudiar la
microdistribución de B-10 en las diferentes estructuras tisulares, tanto en tumor como en tejido
precanceroso. Esta metodología consiste en la irradiación de cortes histológicos (obtenidos a
partir de estudios de biodistribución), en contacto con detectores de trazas nucleares. Las
partículas emitidas en la reacción de captura impresionan el material, revelando la distribución
de B-10 en la muestra (Portu y col., 2015). Las irradiaciones de las muestras se llevaron a cabo
en la facilidad biomédica del reactor RA-3 (Ezeiza), con una fluencia de 10 13 n.cm-2. Luego, las
muestras se colorearon con hematoxilina-eosina y se fotografiaron en el microscopio Olympus
DP70 (1.25x). El daño generado en los detectores se amplificó mediante un ataque químico
con solución alcohólica de KOH, durante 4 min. Las muestras se re-exploraron, obteniendo las
imágenes autorradiográficas correspondientes.
Para evaluar la eficacia terapéutica de GB-10- BNCT con o sin EP in vivo se usaron los
siguientes protocolos y controles:
(P1I) Protocolo BNCT GB-10/ EP tardía: GB-10, 50 mg
(t=2:50 hs) - irradiación (t=3 hs)
10
(P2I) Protocolo BNCT GB-10/EP temprana: GB-10, 50 mg
irradiación (t=3 hs)
B/Kg intravenoso (iv) (t=0 min) – EP
10
B/Kg iv (t=0 min) - EP (t=10 min) -
(P3I) Control Solo EP: EP (t=0 min)
(P4I) Control BNCT GB-10 sin EP: GB-10, 50 mg 10B/Kg iv (t=0 min) - irradiación (t=3 hs)
(P5I) Control Solo Haz: irradiación sin administración del compuesto borado (Molinari et al.,
2012)
(P6I) Control EP tardía+ Irradiación: EP (t=0 min) – Irradiación (t=10 min)
(P7I) Control EP temprana+ Irradiación: EP (t=0 min) – Irradiación (t=2:50 hs)
Las irradiaciones se realizaron en la facilidad térmica del Reactor RA-3 (Centro Atómico
Ezeiza) con una fluencia de 1,9 x 10 12 n/cm2 en todos los casos, utilizando un blindaje de
carbonato de litio (enriquecido al 95% en 6Li) que permitió proteger el cuerpo del animal
mientras se exponía la bolsa evertida de la mejilla del hamster al haz de irradiación con
neutrones (Pozzi et al., 2009).
Se estudió la respuesta al tratamiento evaluando los signos clínicos de los animales, el
volumen tumoral y la mucositis en el tejido precanceroso a los 7, 14, 21 y 28 días postirradiación. Asimismo, se encuentran en curso los estudios histológicos para evaluar respuesta
tumoral y potencial toxicidad en tejido precanceroso y normal.
La escala semi-cuantitativa utilizada en la evaluación de la severidad de mucositis en el
tejido precanceroso alrededor del tumor es una adaptación de la clasificación de la
Organización Mundial de la Salud (OMS) para mucositis bucal en humanos (Monti Hughes et
al., 2011). La escala se clasifica en: Grado 0, apariencia normal, sin erosión ni vasodilatación;
Grado 1, eritema y/o edema y/o vasodilatación, sin evidencia de erosión mucosa; Grado 2,
eritema y/o edema severo, vasodilatación y/o erosión superficial; Grado 3, eritema y/o edema
severo, vasodilatación y formación de úlceras <2 mm en diámetro; Grado 4, eritema y/o edema
severo, vasodilatación, formación de úlceras ≥2 mm y <4 mm en diámetro y/o áreas de
necrosis <4 mm en diámetro; Grado 5, eritema y/o edema severo, vasodilatación, formación de
úlceras de ≥4 mm y/o áreas de necrosis ≥4 mm en diámetro.
Podemos agrupar a los Grados 0-2 como mucositis leve, Grado 3 mucositis moderada y
Grado 4-5 mucositis severa. La asignación del grado de mucositis de las bolsas se basó en la
característica macroscópica más severa observada en la bolsa durante los 28 días de
seguimiento, la cual denominamos Mucositis Máxima.
Los estudios experimentales en animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía
para el cuidado y uso de animales de laboratorio, publicado por National Institutes of Health
(NIH Publication, 1996).
Los datos obtenidos fueron analizados con el Test exacto de Fisher ó Test t no apareado
y graficados con QtiPlot.
Resultados
La Tabla 1 muestra los valores de [10B] en ppm para sangre, tumor, bolsa normal y tejido
precanceroso y las relaciones de concentración de boro tumor/sangre (T/S) y tumor/bolsa
normal (T/BN) para los tres protocolos ensayados (P1B, P2B y P3B). No se notó una diferencia
estadísticamente significativa en la captación de 10B tumoral entre el protocolo EP Tardía +GB10 (P1B) y el control solo GB-10 (P3B) (P=0,3872 -Test t no apareado). En cambio, se observó
un aumento estadísticamente significativo (P<0,0001 -Test t no apareado) en los valores de
concentración de 10B tumorales entre el protocolo EP Temprana +GB-10 (P2B) vs el control
solo GB-10 (P3B). De la misma manera, las relaciones T/S y T/BN del protocolo P2B (1,3 y 2,3
respectivamente) se incrementaron significativamente (P<0,0001, en ambos casos) respecto
del protocolo sin EP –P3B (T/S=0,5 y T/BN= 0,7), sugiriendo que la EP Temprana mejora la
incorporación absoluta y relativa del compuesto borado al tumor.
EP Tardía+
BNCT /GB-10
(P1B)
EP Temprana+
BNCT /GB-10
(P2B)
Control
Solo GB-10
(P3B)
Sangre
Tumor
Bolsa Normal
Tej. Precanceroso
22,0
10,4  4,6
6,2
12,3
(n=2)
(n=8)
(n=2)
(n=2)
16,8  5,1
18,5  6,5
7,7  0,8
9,3  0,9
(n=3)
(n=13)
(n=3)
(n=3)
16,2  3,7
9,2  2,6
12,4  1,0
12,5  1,5
(n=4)
(n=20)
(n=4)
(n=4)
T/S
0,4  0,2
(n=8)
1,3  0,4
(n=13)
0,5  0,2
(n=20)
T/BN
0,8  0,3
(n=8)
2,3  0,4
(n=13)
0,7  0,2 (n=20)
Tabla 1. Concentración de boro (media ± D.S.) (ppm) en sangre y tejidos y relaciones de Tumor/Sangre (T/S) y Tumor/Bolsa Normal (T/BN)
para los protocolos con EP+GB-10 (P1B y P2B) y el control solo GB-10 (P3B). (n= número de tumores o número de hamsters)
Los resultados obtenidos en los ensayos de EP/BNCT del control solo EP - Protocolo 4I
(Fig. 1), BNCT GB-10/EP tardía - protocolo 1I y BNCT GB-10/ EP temprana protocolo 2I (Fig.2)
fueron graficados según estudios previos donde se establecieron las condiciones óptimas de
EP in vivo en el modelo de cáncer bucal en hámster (Garabalino M & Olaiz N, et al., AATN
2014). En estos gráficos se representa la respuesta tumoral normalizada en función de la
conductividad tumoral medida en unidad Siemens (S). En el caso de la Fig.1 se observó una
amplia distribución de la cantidad total de tumores tratados solo con EP, tanto en el área con
respuesta (CR) como en el área de sin respuesta (SR) en el rango de conductividad tumoral
ensayado. En cambio, en la Fig.2 se distinguió una distribución de la cantidad de tumores
tratados con la combinación BNCT GB-10/EP en la zona CR más elevada que la zona SR. En
particular, 23 de 25 tumores del protocolo 2I se distribuyeron en el área de CR, verificando que
éste protocolo posee el mayor potencial terapéutico para BNCT.
Fig. 1. Respuesta tumoral en función de la conductividad tumoral del protocolo 4I - control Solo EP. Los círculos varían su tamaño mostrando
el logaritmo del volumen tumoral. Dentro de los mismos se informa: el grado de mucositis (arriba) y el número de protocolo (centro). CR: con
respuesta; SR: sin respuesta
Fig. 2. Respuesta tumoral en función de la conductividad tumoral del protocolo 1I BNCT GB-10 /EP tardía (rosa) y del protocolo 2I BNCT GB10 / EP temprana (azul). Los círculos varían su tamaño mostrando el logaritmo del volumen tumoral. Dentro de los mismos se informa: el grado
de mucositis (arriba), el número de protocolo (centro) y el compuesto borado (abajo). CR: con respuesta; SR: sin respuesta
La Tabla 2 y Tabla 3 muestran los resultados obtenidos de control tumoral de la
combinación EP+BNCT utilizando el compuesto borado GB-10, en general y discriminado por
volumen tumoral inicial, respectivamente. Se observó un aumento significativo (Test exacto de
Fisher) en las remisiones parciales (RP) y completas (RC) de los tumores de los protocolos P1I
y P2I respecto de los protocolos P3I y P5I (p < 0,009 en todos los casos). Los resultados del
control tumoral (CT=RP+RC) del protocolo P1I vs el protocolo P4I no fueron significativos (p=
0,1708). En cambio, al comparar los resultados del protocolo P2I vs los protocolos P3I, P4I,
P5I y P7I se observó un incremento altamente significativo del CT (p< 0,0001 para todos los
casos). En particular, como se muestra en la Tabla 3, en el caso de los tumores chicos
(volumen <10mm3) las RC del P4I vs P2I aumentaron significativamente de 7% a 65% (p=
0,0003). La Figura 3 muestra un ejemplo representativo de respuesta 28 días post-tratamiento
con Protocolo EP temprano/BNCT GB-10 (P2I).
EP
Tardía+
BNCT /GB-10
(P1I)
EP
Temprana+
BNCT /GB-10
(P2I)
Control
Solo EP
(P3I)
Control
BNCT/GB-10
(P4I)
Control
Solo Haz
(P5I)
Control EP
Tardía +
Irradiación
(P6I)
Control EP
Temprana
+Irradiación
(P7I)
RP
39%
46%
26%
42%
18%
33%
39%
RC
30%
46%
8%
6%
0%
17%
6%
SR
30%
8%
66%
52%
82%
50%
55%
CT
69%
92%
33%
48%
18%
50%
45%
n
23
46
38
33
50
12
18
Tabla 2. Tabla de porcentajes de Respuesta Tumoral de distintos protocolos de EP combinada con BNCT/GB-10 y protocolos control, RP:
Remisión Parcial; RC: Remisión Completa; SR: Sin Respuesta; CT: Control Tumoral (CT: RP+RC); n: número de tumores.
EP
Tardía+
BNCT /GB-10
(P1I)
EP
Temprana+
BNCT /GB-10
(P2I)
Control
Solo EP
(P3I)
Control
BNCT/GB-10
(P4I)
Control
Solo Haz
(P5I)
Control EP
Tardía +
Irradiación
(P6I)
Control EP
Temprana
+Irradiación
(P7I)
C
M+G
C
M+G
C
M+G
C
M+G
C
M+G
C
M+G
C
M+G
RP
33%
45%
23%
75%
18%
33%
33%
50%
18%
17%
0%
67%
25%
67%
RC
50%
9%
65%
20%
18%
0%
7%
6%
0%
0%
33%
0%
8%
0%
SR
17%
46%
12%
5%
64%
67%
60%
44%
82%
83%
67%
33%
67%
33%
CT
83%
54%
88%
95%
36%
33%
40%
56%
18%
17%
33%
67%
33%
67%
n
12
11
26
20
17
21
15
18
38
12
6
6
12
6
Tabla 3. Tabla de porcentajes de Respuesta Tumoral de distintos protocolos de EP combinada con BNCT/GB-10 y protocolos control,
discriminada por el volumen tumoral inicial RP: Remisión Parcial; RC: Remisión Completa; SR: Sin Respuesta; CT: Control Tumoral (CT:
RP+RC); n: número de tumores; C: tumores chicos (volumen <10mm3); M+G: tumores medianos y grandes (volumen >10mm3).
Tumor 3
(67.11 mm3)
Tumor 3
(6.69 mm3)
Tumor 2
(27.52 mm3)
Tumor 2
(0.16 mm3)
Tejido
precanceroso
(G1)
Tumor 1
3
(15.84 mm )
Tejido
precanceroso
(G0)
a
b
Fig.3. Representación macroscópica de la bolsa de la mejilla del hámster cancerizada con DMBA. (a) Pre-tratamiento, con tumores (T1, T2 y
T3) rodeados de tejido precanceroso de grado 1. (b) 28 días post Protocolo EP temprano/BNCT GB-10 (P2I), exhibiendo RC del T1 y RP de
los T2 y T3 rodeados de tejido precanceroso de grado 0.
Los resultados de respuesta tumoral de los protocolos de EP combinada con BNCT/GB10 (Protocolos 1I y 2I) estuvieron asociados a una Mucositis Máxima de leve a moderada
(grado  3) en el tejido precanceroso entre los 7 y 14 días post irradiación. Solo en el control
de EP Temprana+ Irradiación (P7I) se alcanzó en un animal una mucositis máxima severa
(grado 4) que luego se resolvió a grado leve (grado 1). En todos los casos la mucositis a los 28
días post irradiación se resolvió a grado leve (grado  2) (Tabla 3).
Protocolo
(P1I) EP Tardía +
BNCT /GB-10
(P2I) EP Temprana
+BNCT /GB-10
(P3I) Control
Solo EP
(P4I) Control
BNCT/GB-10
(P5I) Control
Solo Haz
(P6I) Control EP
Tardía+ Irradiación
(P7I) Control EP
Temprana+Irradiación
n
Mucositis Máxima
post irradiación
Mucositis 28 días
post irradiación
G0-G2
G3
G4-G5
G0-G2
G3
5
100%
---
9
89%
5
G4-G5
---
100%
---
---
11%
---
100%
---
---
100%
---
---
100%
---
---
4
100%
---
---
100%
---
---
6
100%
---
---
100%
---
---
3
100%
---
---
100%
---
---
3
67%
---
33%
100%
---
---
Tabla 3. Tabla de porcentajes de Mucositis Máxima post irradiación (entre 7 y 14 días) y Mucositis 28 días post irradiación de distintos
protocolos de EP combinada con BNCT/GB-10 y protocolos control. G0-G2: Grado de Mucositis entre 0 y 2 - Leve; G3: Grado de Mucositis 3Moderada; G4-G5: Grado de Mucositis entre 4 y 5 – Severa; n: número de hamsters. Entre paréntesis figuran los números de protocolo.
Los estudios de autorradiografía neutrónica que se realizaron son preliminares. Sin embargo,
como se ilustra en la Fig. 4, un primer análisis de la microdistribución del compuesto permite
inferir una captación similar de los tumores provenientes el protocolo GB-10 + EP tardío en
relación al protocolo GB-10 sin EP, estudiado previamente (Portu et al., 2015). La distribución
de boro en tumor fue homogénea, con un leve aumento en la captación del estroma respecto
del parénquima. Por el contrario, el tumor del protocolo GB-10 + EP temprano presenta una
mayor captación global en comparación con los otros protocolos. Además, las regiones
correspondientes al parénquima tumoral presentan niveles de gris mayores que las de estroma
en la imagen autorradiográfica, indicando una acumulación preferencial del compuesto en las
regiones de parénquima tumoral, tal como se reportó previamente en animales infundidos con
BPA, un compuesto de acumulación selectiva en tumor (Portu et al., 2015. En relación al
tejido precanceroso, ambos protocolos de EP presentan distribuciones similares. El tejido
conectivo acumula una cantidad de boro considerablemente mayor que el músculo y el epitelio,
que presentan distribuciones comparables. Parte del trabajo futuro consiste en confirmar estas
tendencias en un mayor número de casos y cuantificar la concentración de boro en las
diferentes estructuras tisulares.
Figura 4. Imágenes histológicas (panel superior) y autorradiográficas (panel inferior) de tumor de la bolsa de la mejilla del hámster de un animal
infundido con GB-10 y de tumor y tejido precanceroso proveniente de los protocolos GB-10 + EP tardío y temprano.
Discusión
En estudios previos realizados con el compuesto borado BPA (p-Borofenilalanina) los
protocolos combinados de EP con BNCT-BPA mostraron mucositis severa (grado 4 y 5) que
impidió evaluar la respuesta tumoral (Garabalino M & Olaiz N, et al., AATN 2014). El
tratamiento con BPA-BNCT per se induce mayor grado de mucositis en tejido precanceroso
que el tratamiento con GB-10-BNCT, probablemente por la diferencia en la microlocalización de
BPA y GB-10 (Trivillin et al., 2006). El alto índice de mucositis severa observado en los
protocolos BPA-BNCT+EP podría deberse a este efecto asociado a la generación de especies
reactivas de oxígeno (ROS) originadas por el tratamiento BPA-BNCT combinado con EP (Monti
Hughes et al., 2015). En el caso de la aplicación de EP, las membranas celulares
permanecerían permeables varios minutos después del cese del suministro del campo eléctrico
externo, posiblemente debido a la alteración generada por la EP a los lípidos de membrana
(Miklavcic et al., 2014). De esta manera se facilitaría la liberación de las especies ROS de las
células, de las cuales se conoce que su producción es la etapa inicial de la mucositis (Monti
Hughes et al., 2015).
Dado que para obtener una respuesta óptima con la técnica de ECT, la misma debe ser
aplicada cuando el agente quimioterapéutico está presente en una concentración apropiada en
los tejidos, nosotros ensayamos dos momentos diferentes de aplicación de EP (Temprano y
Tardío). En la literatura, muchos autores han demostrado que en patologías de cáncer de
cabeza y cuello la ventana de tiempo para realizar la ECT es 8-28 minutos después la
administración intravenosa de bleomicina (Mevio N et al., 2012). De acuerdo con estos
hallazgos, nuestros mejores resultados tanto de biodsitribución de 10B en el tumor como de
control tumoral con BNCT-EP se obtuvieron con el protocolo de EP temprana (10 min post
administración de GB-10). Por otro lado, una característica importante de la ETC es el efecto
denominado "vascular lock ", que se describe como la capacidad de la técnica de EP para
inducir cambios vasculares provocando la disminución del flujo sanguíneo en el área de
tratamiento. El fenómeno se produce debido a la presencia de la vasculatura desorganizada e
inmadura típica de los vasos tumorales y al efecto reflejo de vasoconstricción mediado por el
sistema simpático que aparece después de la ETC. Esto provoca menor lavado del compuesto
administrado, el cual se mantiene un tiempo más prolongado en las áreas electroporadas. De
este modo, el tratamiento puede ser más eficaz debido a la persistencia más larga del fármaco
en la zona de tumor.
En la literatura, se ha informado que la eficacia de la ECT es dependiente solamente del
tamaño tumoral y no de la histología de la lesión (Mevio N. et al., 2012). Nuestros resultados
coincidirían con los de la literatura, ya que el control tumoral más significativo a nivel de
Remisiones Completas (RC) se obtuvo con los tumores denominados pequeños (volumen  10
mm3) tanto con el protocolo de EP tardía o EP temprana versus el Control BNCT/GB-10.
Aunque en trabajos previos de biodistribución con el compuesto GB-10 no se observó
una captación selectiva del tumor versus el tejido normal, el daño selectivo a tumor de BNCT
mediado por GB-10 sería el resultado del daño selectivo a los vasos tumorales aberrantes
(Heber et al., 2004, Trivillin et al., 2006). Dentro de las estructuras celulares en el tumor, se
demostró con la técnica de autorradiografía neutrónica (Portu et al., 2015) que en los
protocolos con GB-10 sin EP, la relación de concentraciones entre el estroma y el parénquima
tumoral (E/P) es 1.5. De acuerdo a éstos resultados y a los obtenidos en el presente estudio
podríamos suponer que dicha relación podría variar en el caso de BNCT mediada por GB-10 in
vivo combinada con EP, favoreciendo la eficacia terapéutica de BNCT. Los estudios
preliminares de autorradiografía neutrónica realizados sugieren que cambios en la
microdistribución de boro en tumor con el protocolo de EP temprana podrían estar asociados a
un aumento en la respuesta tumoral con BNCT mediado por el compuesto borado GB-10.
Conclusión
Según los resultados obtenidos en éste trabajo el protocolo con mayor potencial
terapéutico asociado a un grado de mucositis leve y que amerita estudios complementarios es
el protocolo 2I (EP Temprana + BNCT/GB-10).
Los resultados de éste estudio evidenciaron que BNCT mediada por GB-10 in vivo
combinada con EP podría ser una herramienta para mejorar la eficacia terapéutica de BNCT,
sin mostrar mucositis severa en el tejido limitante de dosis (tejido precanceroso).
Agradecimientos
Los autores agradecen al Dr. Lucas Colombo por inspirar este trabajo y por poner en
contacto a los grupos intervinientes en el mismo como así también al Dr. Claudio Devida y su
grupo colaborador del Centro Atómico Ezeiza (CAE) por las mediciones en el equipo de ICPMS.
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