Download GUIA TP ORGANICA-BIOLOGICA

Ingeniería Biomédica
Facultad de Ciencias Exactas,
Fisicas y Naturales
Universidad Nacional de Córdoba
DOCENTES
Profesora Adjunta a/c:
Dra. Nancy Alicia SALVATIERRA
Profesor invitado:
Dr. Augusto ARCE
Auxiliares docentes:
Bioq. Mariana Paula CID
Biól. Diego Alberto GUZMAN
1
PROGRAMA ANALÍTICO DE QUÍMICA ORGÁNICA-BIOLÓGICA 2005
1.
Química Orgánica. Principios fundamentales. El carbono y el enlace covalente. Enlace simple de
carbono-carbono. Enlaces covalentes múltiples. Fórmulas estructurales e isomería.
2.
Grupos funcionales. Hidrocarburos alifáticos: alcanos, alquenos y alquinos. Estructura.
Nomenclatura. Hidrocarburos aromáticos. Benceno. Estructura y propiedades.Símbolos del anillo
bencénico. Alcoholes, éteres y epóxidos. Fenoles. Estructuras. Nomenclatura. Propiedades físicas y
químicas. Acidez de alcoholes y fenoles. Compuestos carbonílicos: aldehídos y cetonas. Estructura y
Nomenclatura. Propiedades físicas y químicas. Acidos carboxílicos y sus derivados: ésteres, amidas
cloruros y anhídridos de ácido. Estructura y Nomenclatura. Propiedades físicas y químicas. Compuestos
orgánicos nitrogenados: Aminas, amidas y nitrilos. Estructura y Nomenclatura. Propiedades físicas y
químicas. Basicidad de las aminas. Compuestos heterocíclicos: definición. Generalidades.
Nomenclatura. Compuestos heterocíclicos con nitrógeno, oxígeno y azufre. Anillos de cinco y seis
miembros.
3.
Efectos electrónicos. Reacciones químicas. Reacciones de sustitución, adición y eliminación.
Generalidades. Sustratos, reactivos nucleofílicos y electrofílicos.
4.
Estructura de proteínas.: amino-ácidos constituyentes. Isomería óptica. Clasificación de
aminoácidos constituyentes de proteínas. Proteínas. Estructura primaria, secundaria, terciaria y
cuaternaria. Clasificación. Importancia en la alimentación. Relación entre estructura y función. Ej.
Colágeno, queratinas y hemoglobina. Propiedades físico-químicas de los aminoácidos y proteínas.
Aislamiento, purificación y fraccionamiento de proteínas: precipitación selectiva, cromatografía de
intercambio iónico, electroforesis, filtración por gel y cromatografia de afinidad.
5.
Estructura química de los ácidos nucleicos. Bases púricas y pirimídicas. Nucleósidos y nucleótidos:
nomenclatura. Acido desoxirribonucleico (ADN) : estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria.
Estructura de los ácidos ribonucleicos: mensajero(ARNm), de transferencia(ARNt) y ribosomal (ARNr).
6.
Coenzimas: definición: estructura química y clasificación. Vitaminas hidrosolubles constituyentes de
coenzimas. Coenzimas de oxido-reducción : nicotinamida adenina dinucleótido (NAD), nicotinamida
adenina dinucleótido fosfato (NADP), flavina adenina dinucleótido (FAD), coenzima Q (CoQ) y ácido
lipoico. Coenzimas que transfieren grupos fosfato; que transfieren grupos acilo: Coenzima A (Co A). Que
transfieren grupros glicosilo. Que intervienen en reacciones de decarboxilación: piridoxal fosfato y
biotina. Otras coenzimas.
7.
Enzimas clasificación y nomenclatura. Mecanismo de la actividad enzimática. Cinética. reacciones
monosustrato : el modelo de Michaelis- Menten. determinación de la Km y Vm por el método de
Lineweaver-Burk. Activadores e inhibidores. Tipos de inhibición. Enzimas alostéricas : cinética y
modelos. Reacciones bisustrato : de desplazamiento simple y desplazamiento doble. Isozimas.
Purificación de enzimas: ejemplo.
8.
Oxidaciones biológicas. Enzimas de oxido-reducción: Clasificación y ejemplos. Metabolismo del
superóxido. Glucólisis : reacciones, consumo y generación de ATP a nivel de sustrato. Generación de
NADH. Balance energético. Destinos del piruvato: formación de acetil-CoA, de etanol y de lactato. Ciclo
de Krebs o de los ácidos tricarboxílicos (TCA) : reacciones, formación de coenzimas reducida y ATP a
nivel de sustrato. Acoplamiento de las reacciones. Interacción de los metabolismos de glúcidos , lípidos y
proteinas. rendimiento de ATP en la oxidación total de glucosa. La cadena respiratoria. Componentes.
Ubicación submitocondrial. Fosforilación oxidativa. Niveles de formación de ATP.La hipótesis quimioosmótica .Bioenergética. Inhibidores.
9.
Metabolismo de los glúcidos. Gluconeogénesis : reacciones. Ciclo de Cori: rendimiento de ATP del
lactato. Via de las pentosas-fosfato. Biosíntesis del ácido ascórbico. Degradación intracelular del almidón
y del glucógeno: reacciones. Digestión. Interconversión de hexosas. Biosíntesis del glucógeno, almidón y
celulosa: reacciones. Regulación del metabolismo del glucógeno via AMPc. Biosíntesis de disacáridos.
2
10. Metabolismo de lípidos. Biosíntesis y degradación de los triglicéridos, glicerofosfolípidos y
esfingolípidos. Biosíntesis del colesterol a partir de acetato. Formación de colecalciferol y ácidos biliares
11. Metabolismo de los ácidos grasos, degradación por b -oxidación de ácidos grasos saturados de
cadena par e impar y de ácidos grasos insaturados. Balance energético. a y w-oxidación. Ubicación
subcelular. Biosíntesis: sistema del citosol, reacciones. Sistemas microsomal y mitocondrial.
12. Metabolismo de los aminoácidos. Ciclo de fijación del nitrógeno. Degradación de los aminoácidos:
reacciones de tipo general: desaminación por transaminación, desaminación oxidativa, desaminación no
oxidativa y descarboxilación, ejemplos. Transporte del amoníaco. Ciclo de la urea: reacciones.
Metabolismo del triptofano, fenilalanina, tirosina, histidina y glutamato.
13. Metabolismo de los ácidos nucleicos. La replicación de ADN en procariotas: ADN polimerasas,
reacciones, mecanismo de polimerización, etapas de iniciación, elongación y terminación. La replicación
en eucariotas. Transposones. Biosíntesis del ARN: ARN polimerasa y transcripción. Degradación del
ARN: polinucleótido fosforilasa.
14. Metabolismo de proteínas. Codigo genético: características. Formación de aminoacil-ARNt.
Mecanismo de la síntesis de proteínas: etapas de iniciación, elongación y terminación. Modificaciones
post-traduccionales. Antibióticos inhibidores. Endo y Exopeptidasas. Tipos de mutaciones.
15. Fotosíntesis: ecuación global. Ubicación del proceso en el cloroplasto, pigmentos. Reacción de Hill.
Las reacciones luminosas: fotosistemas I y II. Cadena transportadora de electrones. Formación de ATP y
NADPH. Bioenergética. Mecanismo de formación de ATP. Reacciones enzimáticas: ciclo de Calvin.
Eficiencia de la fotosíntesis.
16. Regulación metabólica. Regulación por modificación de la actividad de la enzima: activación por
precursor e inhibición por producto final. Control de la expresión genética en procariotas. Operón lac y
operón trip: inducción y represión. Control en eucariotas.
17. Ingeniería genética: aplicaciones y obtención del gen: por corte del ADN con endonucleasas de
restricción, por síntesis orgánica y a partir del ARNm. Unión de segmentos de ADN de distinto origen:
método de las colas homopoliméricas. Vectores: plásmidos semisintéticos y derivados del bacteriofago l:
características deseables. Introducción del vector a la celula huesped. Selección del clon con el ADN
recombinante.
18. Vitaminas liposolubles: A, D, E y K. Estructura química y función.
19. Porfirinas. Biosíntesis del Hem. Hemoglobinas A, F y A2. Derivados de la hemoglobina:
oxihemoglobina, carboxihemoglobina, metahemoglobina y carbohemoglobina. Degradadción de la
hemoglobina. Formación de pigmentos biliares.
Programa sintético de Química Orgánica-Biológica
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13.
14.
Química del carbono.
Grupos funcionales. Estructura. Propiedades físicas y químicas.
Efectos electrónicos.
Método de aislamiento y purificación de proteínas.
Estructura química de los ácidos nucléicos.
Estructura química y función de las coenzimas.
Enzimas, mecanismo de acción , cinética y purificación.
Oxidaciones biológicas.
Metabolismo de los glúcidos.
Metabolismo de los lípidos.
Metabolismo de los ácidos grasos
Metabolismo de los aminoácidos.
Metabolismo de los ácidos nucléicos.
Metabolismo de las proteínas
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17.
18.
19.
Fotosíntesis.
Regulación metabólica.
Ingeniería genética.
Vitaminas liposolubles.
Metabolismo de porfirinas.
TRABAJOS PRACTICOS
1. Fotocolorimetría
2. Cinética Enzimática
OBJETIVOS GENERALES DE LA ASIGNATURA
-
Comprender la importancia de la química orgánica y la química biológica en la formación básica del
Ingeniero Biomédico.
Brindar los conocimientos básicos de los métodos químicos a fin de transferir los contenidos a
futuras aplicaciones de esta rama de la Ingeniería.
Adquirir una formación teórica-práctica adecuada para el estudio de los procesos de síntesis y
metabólicos.
Adquirir destreza para el manejo del instrumental y material de laboratorio así también como en el
manejo de la bibliografía.
4
TRABAJO PRACTICO Nº 1
FOTOCOLORIMETRIA
En la primera semana se discutirán los aspectos teóricos y en la segunda
semana se desarrollará la parte experimental. Los alumnos serán evaluados al
finalizar el correspondiente T.P. sobre los aspectos teóricos y de los
fundamentos de las técnicas a aplicar.
OBJETIVOS
- Conocer los fundamentos teóricos y prácticos de la fotocolorimetría.
- Adquirir destreza en el manejo del espectrofotómetro y materiales de laboratorio.
- Comprender la importancia en el uso de técnicas auxiliares para la resolución de los problemas
planteados.
INTRODUCCION
El efecto de la interacción de la radiación electromagnética con la materia es uno de los medios
más poderosos para obtener informaciones sobre su estructura microscópica, la cual depende
fundamentalmente del conocimiento de la mecánica cuántica. Sin embargo, también permite el uso de
está herramienta en trabajos que involucran el análisis y la identificación de sustancias. En este T.P.
utilizaremos la técnica denominada, FOTOCOLORIMETRIA, que mide la absorción de radiación
electromagnética, ultravioleta y visible, de numerosas especies químicas inorgánicas y orgánicas para su
análisis cuali y cuantitativo.
En estudios cuantitativos que involucran la absorción de radiación, es necesario contar con una
medida experimental que pueda cuantificar la cantidad de radiación electromagnética absorbida por una
muestra. Esta cantidad se conoce como potencia radiante, es decir, la cantidad de energía característica
de la radiación por unidad de tiempo. La unidad de potencia es el Watt. Experimentalmente, nos
referimos como intensidad de la radiación. Sin embargo, estos conceptos no son iguales, la Intensidad
de radiación, I, se define como el cociente entre la potencia radiante y el ángulo sólido de incidencia.
Cuando el área iluminada, el ángulo sólido y el volumen de la especie absorbente son pequeños, tal
como es el caso de las medidas con fines analíticos, la potencia de la radiación puede ser tomada como
la intensidad.
Cuando un haz de radiación monocromática, con intensidad I0, incide sobre una cubeta que
contiene una solución, el efecto más significativo es la absorción de parte de la radiación por el medio
que está analizando. Sin embargo, parte de la radiación incidente puede ser reflejada, dependiendo de la
especie absorbente o de las diferencias del índice de refracción del medio (inclusive por las paredes de
la cubeta), ó dispersada, en el caso de que el medio no sea transparente y homogéneo. En
consecuencia, la intensidad del haz que es medida después de atravesar la muestra (intensidad
transmitida, It) será menor que la intensidad inicial, I0.
5
Ir
λ
Ia
λ
It
I0
Fig. 1. Fenómenos involucrados cuando un haz de radiación monocromático incide sobre una cubeta
con una solución que absorbe en la longitud de onda incidente (λ).
Io = Intensidad del haz incidente,
Ir = Intensidad del haz reflejado, resultado de las diferencias del índice de refracción entre la especie
absorbente y el ambiente,
Ia = Intensidad del haz absorbido por el medio,
It = Intensidad del haz transmitido.
La mayor parte de los procedimientos que involucran absorción de luz, son realizados con
soluciones homogéneas y transparentes, de tal modo que la intensidad de la radiación dispersada, Id,
puede ser considerada despreciable. De esta forma, puede considerarse que la intensidad de la
radiación incidente parte es absorbida por la solución y parte es transmitida. La ecuación que resume
esto es
I0 = Ia + It
La intensidad incidente (Io) y transmitida (It) pueden ser medidas directamente. Por lo tanto, la
parte absorbida (Ia) puede ser determinada como la diferencia entre Io e It.
Algunas técnicas analíticas, tales como la turbidimetria y la nefelometria, utilizan la propiedad
que presentan determinadas soluciones no homogéneas de dispersar la luz al determinar en
aplicaciones analíticas la intensidad del haz dispersado. En este curso, no se discutirán los elementos
relacionados con la dispersión de luz, sólo aquellos relacionados a las soluciones homogéneas.
LEYES DE LA ABSORCION
Las primeras investigaciones sobre la relación existente entre las intensidades de radiación
incidente y las intensidades de radiación transmitida, se destacan los experimentos de Pierre Bouguer
(1729) y de Johann Heindrich Lambert (1760) que enunciaron que
”La intensidad de luz (monocromática) transmitida por un cuerpo homogéneo es proporcional a la
intensidad de luz incidente”.
It = K . I0
6
La intensidad de luz transmitida disminuye exponencialmente con el aumento del espesor de la
capa del cuerpo homogéneo. Donde
It = I0 . 10-ab
a = absortividad
b = espesor de la capa o paso óptico
En 1852, August Beer estudió la influencia de la concentración de soluciones coloridas sobre la
transmisión de luz, arribando a la siguiente conclusión: el valor de A para una determinada sustancia es
proporcional a su concentración, es decir:
A=a.c
donde, c es la concentración y a es la absortividad (constante independiente de la concentración que
expresa
la
probabilidad
de
absorción
a
una
longitud
de
onda
determinada).
Combinando ambas ecuaciones se obtiene la ley básica de la espectrofotometria, la Ley Lambert y Beer
It = I0 . 10-acb
Reordenando, se obtiene la relación It/Io que se denomina transmitancia y se representa por el
símbolo T. Así:
It = 10-acb
I0
Se observa en la ecuación que la relación entre T y c no es lineal, lo que tiende a dificultar su
comparación. Sin embargo, si aplicando logaritmo a cada miembro de la ecuación, se obtiene
log10 I0 = - log10 T = log10 10-acb = a . b. c
It
La relación log10 (Io/It) se denomina Absorbancia. Por lo tanto
A= a.b.c
Como a (absortividad) y b (paso óptico, 1 cm) son constantes, entonces A es directamente
proporciorcional a c, por lo tanto, en la práctica, es posible determinar la concentración de una especie
en solución a través de la medida de su absorbancia.
Si la concentración c estuviera expresada en moles por litro y el espesor de la especie
absorbente o el paso óptico de la cubeta, b, en centímetros, la absortividad se denomina absortividad
molar o coeficiente de extinción molar (ε).
De este modo
7
A= ε.b.c
La absortividad molar, ε, depende de la sustancia, de la longitud de onda utilizada, de la
temperatura y del solvente. Si analizamos la ecuación, se observa que cuanto mayor es el valor de ε,
mayor será el nivel de absorción observado y, por lo tanto, más sensible el método espectrofotométrico.
Ésta es la razón por la cual, idealmente, se busca trabajar con una radiación correspondiente al máximo
de absorción de la especie a ser determinada.
ESPECTRO DE ABSORCIÓN
En un análisis espectrofotométrico, es necesario conocer el espectro de absorción de la muestra
que se quiere determinar. Esto es, a qué longitud de onda de la radiación incidente causará la absorción
máxima de la especie a ser determinada y así obtener la mejor sensibilidad en su cuantificación. El
espectro de absorción es la representación gráfica de la probabilidad de absorción en función de la
longitud de onda. El espectro de absorción se determina midiendo la absorbancia a distintas longitudes
de onda para establecer la frecuencia de máxima absorción. Fig. 2.
0,7
0,6
0,5
Α
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
200
300
400
500
600
700
800
λ (nm )
Fig. 2. Espectro de absorción de p-nitrofenil fosfato en agua
CURVA DE CALIBRACION
En la práctica, para conocer la concentración de una solución problema se debe construir una
curva de calibración (gráfico que expresa la relación entre absorbancia y la concentración) de la especie
de interés. Cuya función es determinar gráficamente la concentración de la solución a cuantificar y
verificar si se cumple la ley de Lambert y Beer. Fig. 3.
8
1,2
1,0
Absorbancia
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
20
40
60
80
100
120
C (mg/ml)
Fig. 3 - Curva de calibración para una solución de albúmina sérica bovina en λ = 700 nm y un paso
óptico de 1 cm.
En general se grafica absorbancia en función de la concentración pero, hay instrumentos que
sólo miden %T. En este caso, deben transformarse las lecturas de %T en valores de A.
Alternativamente, puede trazarse el gráfico de %T en función de la concentración en papel
semilogarítmico. De otro modo, resultaría dificil utilizando un número limitado de puntos obtenidos
experimentalmente, comprobar gráficamente si la lectura sigue o no la ley de Lambert y Beer.
9
GUIA DE ESTUDIO
1.
2.
3.
4.
5.
7.
8.
Qué relación existe entre velocidad de una radiación electromagnética, la longitud de onda, la
frecuencia y la energía de la misma.
Defina luz blanca y luz monocromática. Tipos de monocromadores
¿Qué efecto produce la absorción de la luz por una molécula?
¿Existe alguna restricción con respecto a la longitud de onda de la luz que una sustancia puede
absorber? J.S.R.
Definición de espectro de absorción ¿Cuál es la utilidad?
¿Qué es la fotocolorimetría o espectrofotometría? Cuál es su uso.
Analizar la siguiente figura de un espectrofotómetro.
b
d
c
a
e
a = fuente de luz, b = monocromador, c = cubeta para contener la muestra, d = detector de intensidad
lumínica y e = sistema de registro.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
Concepto de ley de Lambert y Beer.
Definición de absorbancia y transmitancia.
¿Cómo se preparan y qué utilidad tienen los tubos blanco, testigo y problema?
¿Cómo construye y qué utilidad tiene una curva de calibración?
¿Cómo elige la longitud de onda de trabajo?
¿Cuál es el fundamento químico del método de Biuret para cuantificar proteínas?
10
PROBLEMAS
1-
Los siguientes son los resultados de la cuantificación de SO H en una misma muestra realizado
4 2
por un método "A" por cuatro analistas diferentes:
a- 50,00 % P/P, densidad= 1,3952 g/ml
b- 70,00 % P/V
c- 7,00 M
d- 7,10 mM
De acuerdo al enunciado anterior diga:
a-¿Cómo procede para comparar los resultados anteriores?
b-¿Que puede decir acerca de la precisión del método empleado en la cuantificación?
DATOS: PM SO H = 98,08
4
2
2- Se desea investigar los efectos de flunitrazepam (benzodiazepina hipnótica) sobre el
comportamiento de ratas en situación de "stress". Para ello cuenta con dos lotes de cinco ratas de
300 g cada una. El lote Nº1 (experimental) es inyectado con una solución de flunitrazepam 67µM en
cloruro de sodio 0,8775 % P/V (solución fisiológica).
a) ¿Cómo procede para preparar 100 ml de dicha solución ?
b) ¿Cuál es la utilidad del segundo lote de ratas? ¿Con qué inyecta esas ratas? ¿Cómo
prepara esa solución?
c) Si la dosis de flunitrazepam cuyo efecto se desea investigar es 70 µg/kg de peso
corporal, ¿qué volumen debe inyectar a cada animal?.
DATOS: flunitrazepam = droga sólida , PM flunitrazepam = 313,3 PA CI = 35,5 PA Na = 23
3.
Una solución de proteínas de concentración desconocida, se diluye 5 veces con agua destilada. A
partir de esta dilución, se vuelve a diluir 3 veces con agua destilada. Esta última dilución dio por
método Biuret una absorbancia de 0,12 (testigo de concentración = 4 mg/ml, dio 0,25 de
absorbancia).¿Cuál es la concentración de la solución original de proteínas? R = 28,8 mg/ml.
4- Una solución de proteínas de concentración desconocida, dio por método de Biuret una A = 0,09
(testigo de concentración 4mg/ml dio A = 0,25 ).De dicha solución se desea tomar 100 µg. ¿Qué
volumen de dicha solución se debe pipetear? R = 69 ul.
5- Interprete el significado de las curvas de calibración para cuantificación de proteínas por método de
Biuret, que se muestran en la Fig.3. ¿Cuál de ellas corresponde a un esquema de trabajo correcto?
Fig. Curvas de Calibración
Absorbancia
1
2
3
6-
Concentración (mg/ml)
Los datos de la Tabla 1 corresponden a absorbancias de una solución de flunitrazepam 25 µM
en etanol 3% v/v y en buffer Tris-HCl 50 mM, pH 7,4 medidos a diferentes longitudes de onda:
λ
210
220
230
240
250
260
270
280
290
A
0.2
0.604
0.468
0.428
0.446
0.407
0.320
0.286
.272
11
300
310
320
330
340
350
360
370
.278
.276
.250
.190
.120
.070
.040
.020
a) Grafique el espectro de absorción y coloque el título correspondiente.
b)¿ Qué longitud de onda elegiría para realizar una curva de calibración, a partir de los datos del
espectro?
c)¿ Cómo se preparó el tubo blanco?
d)¿ Es necesario descontar el blanco cada vez que se cambia la longitud de onda? Si-No. J.S.R.
7-
El siguiente es un protocolo de trabajo para la cuantificación de ADN en base a su contenido de
deoxirribosa empleando el reactivo de difenilamina.
Blanco
NaCl
Testigo
Problema
1ml
ADN 100µg/ml
en Nacl 1M
1 ml
ADN [ ] desc en
NaCl 1M
difenilamina
2ml
Volumen final
a) Complete los espacios en blanco.
b)¿ Por qué coloca NaCl 1M y no agua destilada en el blanco?
c)¿ Cómo realizaría una curva de calibración si sólo cuenta con una solución de ADN de 100
µg/ml?
d)¿ Qué precauciones debe tener al elegir las concentraciones de los testigos?
e)¿ Cómo corregiría este protocolo en los casos en que: 1-la absorbancia del problema sea >>
0,3 y 2- la absorbancia del problema sea << 0,1 ?
f)¿ Por qué deben tener todos los tubos igual volumen final?
El siguiente gráfico representa espectros de absorción de diferentes sustancias (1,2,3) ¿Cuál de
las longitudes de onda indicadas elegiría para luego trabajar con un fotocolorímetro y cuál para
trabajar con un espectrofotómetro?
Absorbancia
8-
1
2
3
4 0 0
4 5 0
5 0 0
5 5 0
6 0 0
L o n g itu d d e o n d a ( n m )
12
6 5 0
7 0 0
9-
Calcular la absorbancia que corresponde a cada uno de los siguientes valores de transmitancia:
a) 0% b) 0,2% c) 0,8% d) 1,52% e) 2.
10-
Calcule el coeficiente de extinción molar del p-nitrofenol si A = 0,2 y la concentración es 11,428
nmoles/1, = 410 nm y b = 1 cm. R = 17.500
11-
Se cuantificó una solución de tirosina por absorción al UV. Esta solución dio A = 0,16; calcule la
concentración nM de tirosina considerando que dicha solución había sido diluida primero 3 veces
y luego 2 veces más. ε = 1.400 l.mol-1 . cm-1 , λ = 274 nm. R = 6,85.10-5 nM.
12-
Una solución de una sustancia de PM 600. a una concentración de 40 µg/ml tiene A = 0,3 a 540
nm, medida en una cubeta de 1 cm de paso óptico. Calcule el coeficiente de extinción molar. R =
4.500.
13-
Una solución contiene dos flavonoides : flavonoide 1 (F1) y flavonoide 2 (F2). Se quiere
cuantificar ambos sin una purificación previa. Analizando la Fig. 6 se observa que entre 220 nm y
420 nm sus espectros se superponen, por lo tanto la cuantificación de cualquiera de ellos
interfiere con la del otro. A longitudes de onda superiores a 420 nm sólo absorbe F1. Calcule la
concentración molar de F1 y F2 en ésa solución sabiendo que:
F1
F2
A
200
300
400
500
600
Testigo de F1
Testigo de F2
c1 = 15 µM
c2 = 15 µM
A350 = 0,105
A350 = 0,195
A450 = 0,293
A450 = 0,3
λ (nm)
Solución problema (mezcla de F1/F2)
cF1 = ? , cF2 = ?
A350 = 0,25
A450= 0,3
R = concentración de F1= 1,54.10-5 M y concentración de F2= 1,09.10-5 M.
13
EJERCITACION ADICIONAL
1. Calcule el número de moles, micromoles y milimoles que hay en 2g de Na(OH) (PM=40).
2. ¿Qué cantidad de glucosa (PM=180)tiene que pesar para preparar una solución 0,05 M ?
R = 1,8 g.
3.¿Qué volumen de una solución 10 nM se puede preparar con 1 g de glucosa(PM=180)
R = 555,55 ml.
4. Si tiene 3 litros de una solución de Na(OH) 0,5 M, ¿Cuántos moles y que concentración molar poseen
los siguientes volúmenes: a) 50ml. b) 0,25ml. c) 1 litro
R = a)0.025 moles, 0.5 M. b) 1.25 x 10-4 moles, 0.5 M. c) 0.5 moles, 0.5 M
5. ¿Qué molaridad tiene una solución que contiene 60 gr de NA(OH) (PM=40) por litro?
R = 1.5 M.
6.¿ Qué cantidad de NA(OH) (PM=40) estan contenidos en 3 litros de una solución 2.5 M ?
R = 300gr.
7.¿ Cuál es la normalidad de una solución 6 M de PO4H3 ?
R =18 N.
8.¿ Cuál es la molaridad de una solución 6 N de PO4H3 ?
R = 2 M.
9. Una solución de ácido sulfúrico al 98% P/P, cuya densidad es 1.8 g/cm3, ¿ qué molaridad tiene ?
R = 18 M.
10.¿Cuál será la normalidad de una solución de ácido clorhídrico (PM=36.5) al 37% P/P cuya densidad
es 1.19 g/cm3
R = 12 N
11.¿Cómo procedería para preparar 2 litros de una solución de ClK 10 mM a partir de una solución 3 M ?
R = tomar 6.67 ml (3 M). colocarlos en un matraz de 2 litros enrasar con agua destilada.
12.Se quieren preparar 6 litros de una solución 0.25 N de ácido sulfúrico a partir de: una solución 63%
P/P (densidad=1.7 g/cm3 ). ¿Qué volumen debe tomar?
R = 68.61 ml.
14
TRABAJO PRACTICO Nº 2
SOLUCIONES Y FOTOCOLORIMETRIA
PARTE PRÁCTICA
Objetivo
Cuantificar albúmina sérica humana por método de Biuret (Gornall, A.G et al., 1949, J. Biol.
Chem., 177-766).
Obtención del Biuret
Cuando se calienta la urea a una temperatura de unos 180°C, se descompone transformándose en un
++
producto llamado "Biuret", el cual en presencia de Cu , en solución alcalina, forma un complejo de color
violeta. La reacción tiene lugar como sigue
Esta reacción coloreada la dan:
a) sustancias que contengan dos grupos -CONH2 ; -CH2NH2;
-C(NH)(NH2); o -CSNH2, unidos, sea directamente entre sí, o a través de un átomo de carbono o
nitrógeno; y
b) estructuras peptídicas que contengan como mínimo dos
enlaces peptídicos.
Fundamento del método
Esta reacción también es producida, naturalmente, por los
con el Cu++ un complejo de color violeta que puede
fotocolorimétrica, lo cual constituye el fundamento de la
enlaces peptídicos de las proteínas para dar
ser cuantificado a través de una técnica
técnica de Biuret para la determinación de
proteínas en suero u otros líquidos biológicos.
Sensibilidad del Método desarrollado por Gornall y col. permite cuantificar soluciones que contengan
entre 1 y 10 mg de proteínas por mililitros.
15
Materiales
-
Solución de albúmina sérica humana de concentración desconocida.
Solución de albúmina sérica bovina de concentración 5 mg/ml en agua destilada.
-
Agua destilada.
Reactivo de Biuret: Disolver 1,5 g de sulfato de cobre (CuSO4.5H2O) y 6 g de tartrato de sodio y
potasio tetrahidratado en 500ml de agua destilada. Agitando constantemente, añadir 300 ml de Na
-
(OH) al 10%. Diluir hasta 1 litro con agua destilada y guardar en frasco de plástico.
Tubos de ensayo, gradillas, pipetas de 1, 2, 5 y 10 ml.
IMPORTANTE!!! PAPEL MILIMETRADO.
Método
Colocar en un tubo, el tubo blanco, 1 ml de agua destilada. Preparar por dilución los tubos
testigos colocando distintos vol. de solución testigo de albúmina y agua destilada de acuerdo a lo
resuelto por cada grupo de trabajo. Finalmente colocar 1 ml de la solución de concentración desconocida
en el tubo problema. Agregar a cada uno de los tubos 4 ml de reactivo de Biuret, agitar y dejar en reposo
a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Leer en el espectrofotómetro el tubo blanco descontando la absorbancia de los reactivos que
acompañan a la reacción y llevando la A = 0 en el espectrofotómetro (λ de lectura = 550 nm).
Posteriormente, leer los tubos testigos y el tubo problema y construir la correspondiente curva de
calibración.
En el siguiente paso se deberá calcular GRÁFICAMENTE la concentración de la solución
problema.
RESULTADOS
Tubo
Absorbancia
[Proteinas] (mg/ml)
T1
T2
T3
P
DISCUSIÓN
Oportunamente se discutirán los resultados obtenidos entre los diferentes grupos de trabajo de cada
Comisión coordinados por el Jefe de T. P.
16
BIBLIOGRAFIA
1-
Guía de Trabajos Prácticos Química Biológica, Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias
Exactas, Físicas y Naturales, UNC.
23-
Andrade JC, Custodio R, Kobuta L, Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química).
Problemas de Química. J.M. Esteban y J.M. Cavanillas. Ed. Alhambra. 4a. 1976. España.
45-
Cálculos en Bioquímica. I.J.Segel. Ed. Acribia. Saragoza. España. 1972.
Métodos instrumentales de análisis. H.H. Willard,.L.Merritt Jr., y J.A.Dean. Ed. CECSA. México.
1974.
6-
Análisis Instrumental. D.A. Skoog y D.M. West. Ed.Interamericana. México. 1975.
17
TRABAJO PRACTICO Nº 3
CINETICA ENZIMATICA
En la primera semana se discutirán los aspectos teóricos y en la segunda
semana se desarrollará la parte experimental. Los alumnos serán evaluados al
finalizar el correspondiente T.P. sobre los aspectos teóricos y de los
fundamentos de las técnicas a aplicar.
OBJETIVOS
•
•
Conocer el mecanismo por el cual transcurren las reacciones catalizadas por enzimas.
Comprender como influyen el tiempo de incubación, la concentración de enzima, la concentración de
sustrato, temperatura, pH, y la presencia de inhibidores sobre la velocidad inicial y la concentración
de producto formado en reacciones catalizadas por enzimas Michaelianas. - Interpretar el significado
•
de las constantes cinéticas Km y Vm.
Valorar la importancia del trabajo prolijo y ordenado para la obtención de resultados confiables.
INTRODUCCION
Las enzimas son catalizadores biológicos de naturaleza proteica. Una determinada enzima (E) se combina
con un determinado sustrato (S) formando un complejo enzima-sustrato (E-S) el cual se descompone para dar el
producto (P) y enzima libre (E):
E+S
ES
E+P
Las reacciones enzimáticas se caracterizan porque aunque aumente la concentración de sustrato la
velocidad no aumenta linealmente, aparece un efecto de saturación. La saturación a que todos los centraos activos
están ocupados. La velocidad depende de la cantidad de enzima como sustrato suficiente. En la cinética de
Michaelis-Menten se considera sólo la velocidad inicial de las reaciones para cada concentración de sustrato cuando
se construya una gráfica, evitando el error introducido por el deterioro de la enzima. Como en un primer momento
no hay producto no se considera la reacción inversa.
V=
d[P] = d{S]
dt
dt
v
[E] = cte
18
[S]
La velocidad depende de una constante de velocidad K y de su inversa
E + S K1 ES K2 E + P
K-2
K-1
El paso limitante en la velocidad es K2, por lo tanto la expresión de la velocidad será
v = K2 . [S]
Donde K2 también recibe el nombre de Kcat. La concentración de la enzima será mucho menor que la de
sustrato porque no se consume. Las enzimas que siguen esta cinética se dice que siguen la cinética de MichaelisMenten. Al aumentar la concentración de enzima la gráfica es igual pero por arriba.
La mayoría de las reacciones biológicas transcurren lentamente si no son catalizadas; las enzimas hacen que el
equilibrio de esas reacciones sea alcanzado rápidamente. Varios factores como a) el tiempo de incubación; b)
concentración de enzima; c) concentración de sustrato; d) pH y e) temperatura del medio influyen en el transcurso
de la reacción.
a) Tiempo de incubación: en la Fig. 1 se observa la variación de las concentraciones de complejo enzima-sustrato
(E-S), de sustrato [S] y de producto ([P]), en función del tiempo. La velocidad inicial (Vo) corresponde a la
velocidad medida dentro de un lapso de tiempo lo suficientemente corto como para que la cantidad de sustrato
consumido se despreciable respecto la cantidad de sutrato inicial (en la práctica menos del 5% del total). La
velocidad se expresa como la cantidad de produto formado por unidad de tiempo (por ej. µmoles/min).
[ P]
Fig.1.
[ S]
[E]
[ES]
Variación de la concentración de las
especies químicas que participan en una
reacción catalizada por enzimas, en
función del tiempo. [E]: concentración de
enzima; [S]: concentración de sustrato;
[ES]: concentración de complejo enzimasustrato; [P]: concentración de producto.
b) Concentración de la enzima:
Fig 2.
Vo
19
Variación de la Velocidad inicial
en función de la concentración de
enzima. Se elige un rango de
concentración de enzima tal que la
velocidad
inicial
( V o)
sea
directamente proporcional a la
concentración de la enzima
c) Efecto de la concentración de sustrato
Vo
1
(a)
Vmax
Vmax
1
2
Vmax
1
KM
[ S]
Figs.3
(b)
Vo
1
[ S]
Variación de la velocidad inicial en función de la concentración de sustrato. Si aumenta la
concentración de S, mientras permanecen constantes las demas condiciones, V0 crece hasta un valor
máximo. la velocidad crece hasta que la enzima es saturada por el S y se alcanza la velocidad máxima
(Vm). En la Fig. 3a se observa la Vo en función de la concentración de S; la Fig.3b muestra el gráfico de
Lineweaver-Burk o de dobles recíprocas.
A partir de estos gráficos se puede determinar las constantes cinéticas que caracterizan a una enzima: Km
(constante de Michaelis) y Vm (velocidad máxima), para un sustrato y condiciones determinadas.
KM: el valor de KM corresponde a la concentración de sustrato necesaria para alcanzar una velocidad igual a la mitad
de la Vmax
Vmax: es la velocidad que se alcanza cuando la enzima está saturada con sustrato (a altas concentraciones de
sustrato).
d) Efecto de la temperatura de incubación:
.
.
% Actividad
máxima
20
Fig.4. Dentro de ciertos límites, la velocidad de
reacción aumenta con la temperatura. En general la
velocidad se duplica cada incremento de unos 10°C y
viceversa. Existe una temperatura óptima, por encima
de esta la velocidad decrece rápidamente por
desnaturalización de la enzima. La temperatura de
máxima actividad no corresponde necesariamente
con la temperatura de máxima estabilidad
Temperatura
e) Efecto del pH del medio de incubación: cambios moderados en del pH afectan el estado iónico de la enzima y
con frecuencia también del sustrato. En general , la actividad óptima se encuentra entre pH 5 y pH 9 como la
tripsina. ver Fig.5., sin embargo algunas enzimas como la pepsina Fig.6 tiene su óptimo a valores de pH bastante
alejados de dichos límites. A valores extremos de pH se produce desnaturalización de la enzima.
Actividad
Actividad
6
8
10
2
pH
Fig.5 Tripsina
4
6
pH
Fig. 6. Pepsina
TEMAS PARA REPASAR:
• Soluciones amortiguadoras,
•
•
pH,
fotocolorimetría.
TRAER: calculadora y papel milimetrado.
GUÍA DE ESTUDIO:
1. Catalizadores.
2. Concepto de ley de acción de masas.
3. Enzimas. Características. Sitio activo de una enzima: características. Cofactor. Coenzima. Holoenzima.
4. Clasificación de enzimas.
5. Ubicación de las enzimas en la celula.
6. Mecanismo de acción de las enzimas.
7. ¿Alteran las enzimas el equilibrio de la reacción?
8. ¿A que se llama sustrato y producto?.
9. ¿Cómo se mide la concentración de una enzima?.
10. ¿Qué es la actividad específica de una enzima y en qué unidades se expresa?.
11. Factores que influyen en una reación catalizada por enzimas.
12. Función de Michaelis Menten. Representación gráfica.
13. Velocidad inicial. Velocidad máxima. Unidades.
21
14. ¿Porqué se debe trabajar a velocidad inicial?
15. Km. Unidades. ¿Cómo se determina?
16. Ecuación de Lineweaver-Burk. Representación gráfica.
17. Inhibición reversible e irreversible, concepto. Inhibidores competitivos y no competitivos, concepto. ¿Cómo se
diferencian? ¿cómo son las curvas de las directas e inversas de la velocidad en función de la concentración de
sustrato?.
22
PROBLEMAS
1. Explique el siguiente gráfico
V0
tiempo
2.
a. Grafique velocidad en función de concentración de sustrato
b. Grafique la inversa de velocidad en función de la inversa de la concentración de
sustrato.Identifique en cada una de estas curvas Km y Vm.
3.
¿Qué relación existe entre Km y la afinidad de una enzima por un determinado sustrato?
4.
¿Cuándo la concentración de sustrato es igual a Km, Como es la velocidad inicial?
5
¿Qué relación exíste entre Km y sustrato cuando la reacción catalizada por enzima alcanza el
80% de la Vm?
6.
Para medir la actividad catalítica de la fosfatasa ácida de higado de rata, la preparación
enzimática fue obtenida homogenizando 0.5 g de hígado en 10 ml de buffer. Se incubaron 0.2 ml
de la preparación enzimática a pH 5 Y 37ºC en presencia de Ca durante 6' , en un volumen de
0.4 ml, el cual fue diluido a 4 ml para detener la reacción. Calcule los µmoles de producto
formado por min. y por mg de tejido, sabiendo que la absorbamcia fue 0.2, ε: 17500 M-1 cm-1.
7.
Se incubaron 200 µl de una preparación enzimática (0,3 mg proteínas/ml) en presencia de 0,5 ml
del sustrato correspondiente y de 0,5 ml de buffer pH 5, durante 15 min. a una temperatura
constante de 37ºC. La reacción se detuvo por dilución del incubado hasta un volumen final de 10
ml con NaOH 0,1 M. La absorbancia de esta solución fue 0,215. Calcular los µmoles de producto
formado por min. y por mg de proteínas. Solución testigo 2 µM → Abs. 0,15.
8.
La trehalasa cataliza la hidrólisis de la trehalosa, en determinadas condiciones (pH 7, 30ºC).
Una muestra de trehalasa presenta un valor de Vm de 1.5 umol de glucosa formada por minuto
por mg de proteína. ¿Cuál sera el valor de Vm para la misma preparación enzimática pero en
presencia de de 5 mmoles de trehalosa 6-fosfato el cual es un inhibidor competitivo con Ki=
2mmol/ml?
9
A partir de los siguientes datos de una reacción enzimática, determinar a) tipo de inhibición b)
KM del sustrato.
Concentración de S (mM)
VELOCIDAD
(µg de producto formado/hora)
Sin inhibidor
Con inhibidor 6 mM
2
3
4
10
15
139
179
213
313
370
23
88
121
149
257
313
TRABAJO PRACTICO Nº 4
CINETICA ENZIMATICA
PARTE PRÁCTICA
Objetivo
Determinar los parámetros cinéticos, KM y Vmax, de la fosfatasa ácida de hígado de rata.
Fundamento de la reacción
La enzima fosfatasa ácida de hígado cataliza la siguiente reacción
p-nitrofenil-fosfato +
H2O
p-nitrofenol
+
PO43-
El sustrato p-nitrofenil-fosfato disódico es una sustancia artificial que tiene la propiedad de ser hidrolizado
por la fosfatasa ácida del hígado y de otros tejidos, por ello puede ser usado para estudiar dichas
enzimas. La reacción es medida siguiendo la cantidad de producto formado, el p-nitrofenöxido de sodio,
que en un medio alcalino desarrolla un color amarillo, el cual se puede cuantificar mediante la técnica de
la fotocolorimetría a 410 nm (Coeficiente de extinción molar: 17500) (ref. Methods Enzimology ed.
Colowick-Kaplan vol. XXXI).
Materiales
Sustrato: p-nitrofenil-fosfato, 25 mM. PM 371,12.
Buffer: acido acético- acetato de sodio 0,1 M, pH 5.
Enzima: homogeneizado de hígado a una concentración final de 1mg/ml.
Activador: Cl2Ca 11 mM.
Preparación de la enzima
Homogeneizar (en homogeneizador de vidrio con émbolo de teflón) 0,25 g de hígado en 15 ml de agua
destilada. Dejar en baño de hielo durante 10 min. En esas condiciones hipo-osmóticas, se rompen los
lisosomas que contienen la enzima, quedando soluble.
Llevar la suspensión a 30 ml con buffer acético-acetato de sodio 0,2 M y pH 5 y una concentración de 1
mg de proteína por ml.
24
Método
Colocar en cada tubo todos los componentes menos la enzima. La reacción comienza con el
agregado de la enzima y la incubación a 37°C. Mezclar rápidamente y continuar la incubación durante 10
min. La reacción se detiene por el agregado de 5 ml de NaOH 0.1 M. El álcali, por un lado inactiva a la
enzima y por otro da el medio alcalino necesario para que el producto (p-nitrofenol) desarrolle color. Es
importante hacer en cada caso un tiempo de cero de incubación, este tubo contiene lo mismo que los
tubos problema pero con la enzima agregada después del NaOH. Este tubo se usa como blanco para
leer en el espectrofotómetro.
Preparación del sistema de incubación
Tubo
sustrato (µl)
Cl2Ca (µl)
Buffer (µl)
enzima (µl)
1
50 (2,5 mM)
100
250
100
2
100 (5 mM)
100
200
100
3
150 (7,5 mM)
100
150
100
4
200 (10 mM)
100
100
100
5
250 (12,5 mM)
100
50
100
blanco
100
100
200
100
Incubar a 37°C durante 10 min. Luego agregar a cada tubo 5 ml de NaOH 0.1 M. RECORDAR: En el
tubo blanco la enzima se añade despues del alcali. Leer cada tubo en el espectrofotómetro a 410 nm y
calcular los µmoles de P formado.
Análisis de datos
a) Calcular las inversas de la concentración de sustrato indicadas en la tabla;
b) Calcular las inversas de µmoles de producto formado en cada tubo;
c) graficar 1/Vo en función de 1/[S].
d) Determinar los valores de Km y Vm.
RESULTADOS
Curva de Concentración de Sustrato
Tubo No
µmoles de P
Absorbancia
1
2
3
4
5
25
µmoles de P/min
Tubo No
1/V
1/[S]
1
2
3
4
5
GRÁFICO
DISCUSIÓN
Oportunamente se discutirán los resultados obtenidos entre los diferentes grupos de trabajo de cada
Comisión coordinados por el Jefe de T. P.
26
BIBLIOGRAFÍA
. Lehninger A.L, Bioquímica. Ed. Omega, Barcelona 1984.
. Stryer L. Bioquímica, Ed. Reverté, España 1976.
. Harper H.A, Manual de química fisiológica. Ed. El manual moderno 1980
. Neilands J.B., Stumpf P.K., Principios de enzimología. Ed Aguilar. 1967.
. Morris J., Fisicoquímica para biólogos.
. Bezkorovainy, A, Rafelson M.E. Concise Biochemistry. Ed. Marcel Dekker, New York, 1996.
. Horton R.H, Moran L.A., Ochs R.S., Rawn J.D., Scrimgeour K.G. Pentice Hall, Hispanoamericana, SA.
Mexico, 1995.
27