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Enzimología – Efecto cooperativo
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EFECTO COOPERATIVO
El efecto cooperativo ocurre en enzimas oligoméricas que poseen varios sitios
para la unión de sustrato y es el fenómeno por el cual la unión de un ligando a
una enzima influye sobre la unión de moléculas subsiguientes. Cuando el
ligando afecta la unión de otras moléculas del mismo ligando, el efecto se
conoce como homotrópico. Cuando lo que se ve afectada es la unión de un
ligando de naturaleza diferente (por ejemplo un activador que afecta la unión
del sustrato de una enzima), se está en presencia de un efecto cooperativo
heterotrópico.
En el caso de una enzima, cuando la unión de una molécula de sustrato facilita
la unión de la siguiente molécula de sustrato mediante un aumento en las
afinidades de los sitios vacantes, el fenómeno se denomina “cooperatividad
positiva” o “respuesta homotrópica positiva”. Cuando la unión del sustrato
produzca una disminución de afinidad de los sitios no ocupados, se habla de
cooperatividad negativa.
El fenómeno cooperativo se evidencia a través de una curva de velocidad vs
[S] que no se ajusta a la cinética de Michaelis-Menten (hiperbólica) sino a una
que se trata de una curva sigmoide (Figura 1).
En consecuencia la
representación de Lineweaver-Burk (doble recíproca) no resulta una línea recta
(Figura 2).
Figura 1
Figura 2
2,0
12
Cooperatividad
positiva (no lineal)
Cooperatividad positiva
10
No cooperativa (hipérbola)
1,5
No cooperativa
(lineal)
Cooperatividad negativa
6
1/v
v
8
1,0
Cooperatividad
negativa (no lineal)
4
0,5
2
0
0
200
400
[S]
600
800
0,0
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
1/[S]
Se han propuesto varios modelos para explicar el fenómeno de la
cooperatividad y permitir el análisis de las diferentes situaciones
experimentales en que aparece cooperatividad. Dos de los principales son el
de interacción secuencial y el concertado o de simetría.
Modelo de interacción secuencial: supone cambios secuenciales o
progresivos en las afinidades de los sitios vacantes a medida que los sitos se
van ocupando. Es decir que en una misma molécula de enzima pueden existir
sitios con diferente afinidad. Para el caso simple de un dímero pueden existir
entonces 3 estados: ambos sitios con baja afinidad, un estado con un sitio en
alta y otro en baja afinidad, o ambos sitios con alta afinidad (Figura 3).
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Secuencial
Concertado
Modelo concertado o de simetría: supone que la enzima preexiste como una
mezcla en equilibrio de un oligómero de alta afinidad y un oligómero de baja
afinidad. Los ligandos, incluído el sustrato, actúan desplazando el equilibrio a
favor de uno u otro estado. Durante la transición, la conformación de todas las
subunidades cambia al mismo tiempo. En este caso existen dos poblaciones
diferentes de enzima, una con todos sus sitios con alta afinidad y otra con
todos sus sitios con baja afinidad (Figura 3).
Aunque ambos modelos se ajustan a diferentes situaciones observadas, es el
segundo, el concertado, el modelo más general, en el sentido que explica la
cooperatividad negativa.
La figura 4 muestra de que manera se explican ambos tipos de cooperatividad
(negativa o positiva) en el modelo concertado, para el caso hipotético de una
enzima cooperativa dimérica.
La enzima puede existir en dos estados básicos, una forma T de baja afinidad y
una forma S de alta afinidad. Ambas formas pueden interconvertirse. La unión
del sustrato procede entonces con diferentes constantes de disociación Ks para
la forma T o R, independientemente del número de moléculas de sustrato
unidas. La unión de un ligando, por ejemplo el sustrato, a una forma, desplaza
el equilibrio en el sentido de esa forma. En la figura, la primera molécula de S
puede unirse a la forma T o R. Como tiene más afinidad por la forma R, se una
preferentemente a ésta y desplaza el equilibrio hacia ese lado. Cuanto más
sustrato haya, más enzima habrá en la forma R de mayor afinidad, hay
Figuraheterotrópicos
3
cooperatividad positiva. Los efectos
también se explican mejor
con este modelo. Un activador se unirá mejor (o exclusivamente) a la forma R,
desplazando el equilibrio hacia la forma de más afinidad. Un inhibidor se unirá
preferentemente (o exclusivamente) a la forma T, desplazando el equilibrio
hacia la forma de menos afinidad, dando cooperatividad negativa.
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Figura 4
t
r
Ks
Ks
S
S
t
r
Ks
S
Ks
S
S
Forma T
(baja afinidad)
S
Forma R
(alta afinidad)
El desarrollo matemático de estos modelos lleva a ecuaciones que son
capaces de describir numerosos sistemas experimentales. Sin embargo, en la
práctica se recurre a una ecuación mucho más sencilla desarrollada por Hill.
Ecuación de Hill
Hill consideró un sistema para la unión de n moléculas de S a una enzima en
un paso:
E + n S ↔ ESn
(1)
y dedujo la siguiente ecuación
[S]
v
= ´
Vmax K S + [S]n
n
(2)
donde:
n= número de sitios de unión al sustrato por molécula de enzima
K’S = constante de disociación global
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La constante K’S en la ecuación anterior no es igual a la concentración de
sustrato que produce una velocidad semimáxima, excepto cuando n=1, en cuyo
caso esta ecuación se reduce a la ecuación de Michaelis-Menten.
Cuando
v = 0,5 Vmax
(3)
0,5 K ´s + [S]0 , 5 = [S]0 , 5
(4)
K ´s = [S]0,5
(5)
[S]0,5 = n K ´s
(6)
n
n
n
De esta manera, la ecuación (2) puede escribirse:
v
Vmax
=
[S]n
[S]0n,5 + [S]n
(7)
En esta ecuación entonces, S0,5 define la concentración de sustrato que da una
velocidad semimáxima, y corresponde al punto de inflexión de la curva
sigmoidea.
En la cooperatividad positiva, n será mayor que 1, y menor que 1 si es
negativa.
La ecuación de Hill puede convertirse en una recta útil para el cálculo de
parámetros aplicando logaritmo a la ecuación (7)
La forma de esta ecuación es:
⎞⎟ = n log[S] − n log[S] (8)
log⎛⎜ v
0,5
(
V
v
)
−
⎠
⎝
Así la representación de v/ Vmax-v frente al log [S] es una recta con pendiente
n. Cuando log v/( Vmax -v)= 0, v/( Vmax -v)= 1 y la posición correspondiente
sobre el eje log [S] nos dará el log [S] 0,5 . K’ puede calcularse a partir de la
ecuación (6).
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Figura 5
2
n=2
n=4
log (v/Vmax-v)
1
n=1
0
n = 0,5
log [S] = 2 ⇒ [S]0,5 = 100
-1
-2
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
log [S]
Si la cooperatividad no es muy alta, la ecuación de velocidad no se reducirá a
la ecuación de Hill. Sin embargo, las curvas de velocidad pueden expresarse
en términos de la ecuación de Hill, aunque n ya no será igual al número de
sitios. En este caso n será nap (aparente) o nH (de Hill). Por ejemplo si la
cooperatividad es tal que las especies mayoritarias son ES4 y ES3 (enzima con
4 o 3 moléculas de S unido) se puede lograr que la velocidad ajuste a la
ecuación de Hill usando un n no entero (por ejemplo 3,6). Esto quiere decir que
la enzima actúa como si tuviera un número de sitios igual a 3,6 con una
cooperatividad muy fuerte aunque el número real de sitios es por lo menos 4,
pero podría haber más.
Una de las dificultades en el empleo del gráfico de Hill es que es necesario
conocer la velocidad máxima para emplearlo. No existe una manera obvia de
calcularla ya que los métodos usuales de gráficos lineales darán curvas. Si
observamos atentamente la ecuación de Hill veremos que estos gráficos darían
rectas si en lugar de [S] empleáramos [S]n, sin embargo ya que n es el valor
que estamos buscando el empleo de estos gráficos es impracticable
Una manera de proceder es usar cualquiera de los gráficos lineales para una
estimación gruesa de la Vmax empleando sólo las concentraciones más altas de
sustrato. Luego usar este valor aproximado para hacer el gráfico de Hill. Este
gráfico nos dará un valor aproximado de n. A continuación usar este valor para
representar el gráfico doble recíproco pero usando [S]n en lugar de [S]. Este
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gráfico debería ajustar mejor a una recta. Con el valor de Vmax obtenido de
este gráfico, regraficar Hill.
Indice de cooperatividad
La forma de la curva de v vs [S] puede expresarse en función de la relación
entre dos concentraciones de sustrato necesarias para que la velocidad sea
dos fracciones cualesquiera de Vmax por ejemplo 0,9 Vmax y 0,1 Vma. Esta
relación depende de n como se ve a continuación.
[S]
v
= ´
Vmax K S + [S]n
n
(2)
cuando v = 0,9 Vmax
[S]0n,9
n
K ´S + [S]0 ,9
(9)
[S]0n,1
0,1 = ´
n
K S + [S]0 ,1
(10)
0,9 =
cuando v = 0,1
Despejando las concentraciones de sustrato y dividiéndolas
[S]0,9
[S]0,1
= n 81
(11)
A este cociente se lo denomina Rs, o índice de cooperatividad. Si la enzima es
no cooperativa (n = 1), este índice será de 81. Valores mayores a 81 indican
cooperatividad negativa y valores menores cooperatividad positiva. En el
ejemplo anterior, a un n = 0,5 le corresponde un Rs de 6561, mientras que
para un n = 4 el Rs es de 3. Una ventaja clara de este parámetro como medida
de cooperatividad es que de valores de importancia para medir la relevancia de
una enzima en una vía metabólica, dado que da una idea de la respuesta de la
misma a cambios en el nivel de sustrato (o efector).