Download Aislamiento e identificación de bacterias

OBJETIVOS
Diagnóstico de
Bacterias fitopatógenas
27 de mayo de 2011
Ing. Agr. María José Montelongo
Algunos
agentes
fitopatógen
os en una
célula
vegetal
• Recordar las características de las
bacterias fitopatógenas
• Recordar la clasificación de las
bacterias
• Reconocer síntomas y signos más
comunes
de
las
enfermedades
bacterianas
• Conocer el proceso de diagnóstico de
una enfermedad bacteriana
Bacterias fitopatógenas
• Procariotas unicelulares
–
–
–
–
Cápsula
Pared celular compleja
Membrana citoplasmática
Citoplasma
– Material genético nuclear y
extranuclear
• Flageladas
• La mayoría Gram• Variabilidad genética
– transformación,
conjugación, transducción
y mutación
Bacterias fitopatógenas
Bacterias fitopatógenas
•Se reproducen por fisión binaria
•Alta tasa de multiplicación
• La mayoría tienen forma de bacilo (1-2μm x <1μm)
• Hay bacterias filamentosas
Streptomyces spp.
causante de la sarna
de la papa:
filamentosa
Agrobacterium,
Erwinia,
Pseudomonas y
Xanthomonas:
bacilos
Bacterias fitopatógenas
Clave de identificación de los géneros de bacterias fitopatógenas
ÍA
R
• Saprófitos facultativos: se
YO
A
multiplican en el huésped,
M
pero pueden sobrevivir en
restos y en el suelo. Algunas se
consideran habitantes del
suelo (Pseudomonas,
Agrobacterium,
Streptomyces).
Nocardia
Curtobacterium
• Parásitos obligados: bacterias
fastidiosas, limitadas al xilema
o floema y Mollicutes
(fitoplasmas y espiroplasmas)
(TRIGIANO, R. et al 2008 Plant pathology, concepts and laboratory exercises)
Bacterias Gram positivas
Bacterias Gram negativas
(TRIGIANO, R. et al 2008 Plant pathology, concepts and laboratory exercises)
(TRIGIANO, R. et al 2008 Plant pathology, concepts and laboratory exercises)
Mollicutes Fitopatógenos
Se aceptaba que numerosas enfermedades de
plantas que producían amarillamientos eran
causadas por virus:
9Sintomatología
9Transmisión por insectos
9Multiplicación en plantas e insecto vector
9El agente causal era filtrable y se transmitía por
injerto
(IFFIVE(IFFIVE-INTA)
En 1902 se publica el primer
informe sobre la aparició
aparición de un
“amarillamiento”
amarillamiento” ó “Yellow
Disease”
Disease” en plantas. Hasta 1967
se les atribuyó
atribuyó origen viral
1902
1967
En 1967 Doi y colaboradores
descubren, en cortes ultrafinos del
floema de plantas con sí
síntomas,
partí
partículas similares a los
micoplasmas animales
(Micoplasma Like Organism)
rganism) y se
los denominó
denominó MLO
(Dr. Luis R. CONCI IFFIVEIFFIVE-INTA)
Mollicutes Fitopatógenos
Clase Mollicutes
• Tamaño pequeño, filtrables por poros de 450nm
• Genoma pequeño
Dominio: Bacteria
• Gram (+)
Phylum: Ternicutes
• Sin de pared celular, solo membrana plasmática
Clase: Mollicutes (Mycoplasmalike organisms (MLO))
• Son los procariotas más pequeños que pueden autoreplicarse
Orden I: Mycoplasmatales
Orden II: Entomoplasmatales
• Parásitos
• Resistentes a penicilina (interfiere con la producción de la pared
celular) pero sensibles a tetraciclina y cloranfenicol (interfieren
con la síntesis de proteínas)
Familia II: Spiroplasmataceae
Género: Spiroplasma
• Los fitopatógenos son transmitidos por insectos que se alimentan
del floema: cicadélidos, delfácidos y psílidos.
Familia (s): aún no definida
Género: Candidatus Phytoplasma
FITOPLASMAS
Pleomórficos
• Los mollicutes fitopatógenos: fitoplasmas y espiroplasmas.
ESPIROPLASMAS
Esterilidad
Morfolología helicoidal, filamentos
ramificados o no, y/o formas de
cocos.
No se han podido cultivar in vitro
Cultivables in vitro
Habitantes del floema y diversos órganos
de insectos
Habitan y se multiplican en insectos
Frecuentes en la superficie en plantas
y flores.
Identificación por PCR, amplificación del
rRNA RFLP y/o análisis secuencial del
DNA
Identificación por serología y PCR
Filodia
Organismo vivo
autoreplicante más
pequeño que se
conoce.
Vasos floemáticos
donde se observan
fitoplasmas
S. citri
(IFFIVE(IFFIVE-INTA)
(IFFIVE(IFFIVE-INTA)
Deformación y
disminución del
tamaño foliar
(IFFIVE(IFFIVE-INTA)
Longitud anormal de
entrenudos
(IFFIVE(IFFIVE-INTA)
Virescencia
Proliferación de yemas axilares
(escoba de bruja)
(IFFIVE(IFFIVE-INTA)
Amarillamientos y “dieback”
(IFFIVE(IFFIVE-INTA)
Vinca
(IFFIVE(IFFIVE-INTA)
Duraznero
(IFFIVE(IFFIVE-INTA)
Xylella fastidiosa
• Gram-negativa
• Limitada al xilema
• Transmitida por cicadélidos
• Más de 150 especies hospederas
• En viña: Enfermedad de Pierce
• En citrus: Clorosis Variegada de los
Citrus (CVC)
(IFFIVE(IFFIVE-INTA)
HUANGLONGBING (“Citrus greening”)
•
•
•
•
•
•
Candidatus Liberibacter spp.
Gram negativa
Limitada al floema
No cultivable in vitro
Transmitida por psílidos
Capaz de multiplicarse en los
vectores
DIAGNÓSTICO
Pasos a seguir:
1) Observación del problema
2) Formular una hipótesis que explique lo
observado
3) Probar la hipótesis
4) Aceptar o revisar la hipótesis
Síntomas de enfermedades
bacterianas
Síntomas de enfermedades
bacterianas
• Manchas foliares
• Manchas en frutos
• Cancros
• Marchitez
• Hiperplasia
• Podredumbre
• Costras
• Necrosis
Síntomas de enfermedades
bacterianas
Agallas o tumores
Agallas o tumores
Psudomonas savastanoi
pv.savastanoi
Agrobacterium tumesfasciens
Síntomas de enfermedades
bacterianas
Lesiones en frutos
Síntomas de enfermedades
bacterianas
Lesiones en frutos
Xanthomonas
axonopodis
pv. citri
Xanthomonas arboricola pv. pruni
Síntomas de enfermedades
bacterianas
Lesiones en frutos
Pseudomonas
syringae pv. papulans
Síntomas de enfermedades
bacterianas
Lesiones en frutos
Xanthomonas campestris pv. vesicatoria
Xanthomonas campestris pv. cucurbitae
Síntomas de enfermedades
bacterianas
Costras
Síntomas de enfermedades
bacterianas
Podredumbres blandas
Síntomas de enfermedades
bacterianas
Podredumbres blandas
Síntomas de enfermedades
bacterianas
Síntomas de enfermedades
bacterianas
Podredumbres blandas
Síntomas de enfermedades
bacterianas
Afecciones vasculares
Marchitez
Síntomas de enfermedades
bacterianas
Manchas foliares
Síntomas de enfermedades
bacterianas
Manchas angulares,
acuosas
Síntomas de enfermedades
bacterianas
Síntomas de enfermedades
bacterianas
Manchas foliares
Cribado
Pantoea stewartii
Síntomas de enfermedades
bacterianas
Síntomas de enfermedades
bacterianas
Defoliación
Cancros
PASOS DEL DIAGNOSTICO
Observación
del problema
Planteo
de
hipótesis
Prueba de
hipótesis
Aceptación o replanteo de hipótesis
Diagnóstico de enfermedades
bacterianas
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•
•
•
•
Observación de síntomas y signos
Aislamiento en medios de cultivo
Prueba de hipersensibilidad en no huésped
Pruebas de patogenicidad
Prueba de Gram
Características culturales
Pruebas bioquímicas y fisiológicas
Pruebas serológicos (ELISA)
Técnicas moleculares
La bibliografía indica que
podría ser una bacteria!!
Signo de bacterias
Técnicas para ver el signo de
bacterias
Zooglea: Aspecto mucilaginoso,
constituido de masa bacteriana y
restos del vegetal.
Técnicas para ver el signo de
bacterias
Test de flujo: para tallos
Aislamiento
Microcorrida: para hojas
Diagnóstico de enfermedades
bacterianas
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Observación de síntomas y signos
Aislamiento en medios de cultivo
Prueba de hipersensibilidad en no huésped
Pruebas de patogenicidad
Prueba de Gram
Características culturales
Pruebas bioquímicas y fisiológicas
Pruebas serológicos (ELISA)
Técnicas moleculares
Aislamiento
Podemos utilizar el
material observado
en la microcorrida
o test de flujo
Aislamiento
Aislamiento
Indirecto
Cultivo trampa
Diagnóstico de enfermedades
bacterianas
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Diagnóstico de enfermedades
bacterianas
Observación de síntomas y signos
Aislamiento en medios de cultivo
Prueba de hipersensibilidad en no huésped
Pruebas de patogenicidad
Prueba de Gram
Características culturales
Pruebas bioquímicas y fisiológicas
Pruebas serológicos (ELISA)
Técnicas moleculares
Hipersensibilidad en no
huésped
1.
Se realiza una inoculación masiva en el mesófilo
de una hoja de una planta NO HUESPED
2.
Se observa la ocurrencia (o no) de reacción de
hipersensibilidad
Hipersensibilidad en no
huésped
La aparición de una reacción de hipersensibilidad
indica que la bacteria inoculada es patógena.
Prueba de patogenicidad
Prueba de patogenicidad
Inoculación mediante aspersión
Prueba de patogenicidad
• Patógenos vasculares:
inoculación al tallo
– axila - pinchar a través
de gota
– inyección al tallo
Características
Taxonomía
taxonómicas
– Morfológicas,
– Culturales (forma, bordes,
color de las colonias)
– Fisiológicas
– Bioquímicas
– Patológicas (capacidad
para atacar a
determinado huésped)
Inoculación mediante infiltración
Diagnóstico de enfermedades
bacterianas
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•
Observación de síntomas y signos
Aislamiento en medios de cultivo
Prueba de hipersensibilidad en no huésped
Pruebas de patogenicidad
Prueba de Gram
Características culturales
Pruebas bioquímicas y fisiológicas
Pruebas serológicos (ELISA)
Técnicas moleculares
Morfología de colonia en
medio sólido
Forma
Elevación
Borde
Morfología de colonia en
medio sólido
Pared celular
Prueba de gram indirecta
GRAM (+)
Principales géneros de
Bacterias fitopatógenas
Coloración de la colonia
en medio YDC
Crema
GRAM (+)
– Clavibacter
– Curtobacterium
– Streptomyces
GRAM (-)
Amarilla
GRAM (-)
– Erwinia
– Pseudomonas
– Xanthomonas
– Xylella
– Agrobacterium
Pseudomonas
Agrobacterium
Burkholderia
Ralstonia
Erwinia
Xanthomonas
Erwinia
Características
fisiológicas
Reacción de o/f
Reacción de oxidación/fermentación o de Hugh & Leifson
La mayoría de las bacterias fitopatógenas tienen
metabolismo oxidativo
Características
fisiológicas
Producción de pigmentos fluorescentes
• Metabolismo
oxidativo
– Pseudomonas
– Xanthomonas
– Xylella
– Agrobacterium
– Clavibacter
• Metabolismo
fermentativo
– Erwinia
Diagnóstico de enfermedades
bacterianas
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Observación de síntomas y signos
Aislamiento en medios de cultivo
Prueba de hipersensibilidad en no huésped
Pruebas de patogenicidad
Prueba de Gram
Características culturales
Pruebas bioquímicas y fisiológicas
Pruebas serológicos (ELISA)
Técnicas moleculares
Pseudomonas fluorescens se caracteriza por producir
pigmentos fluorescentes (izq)
Otras Técnicas
• Serología: ELISA
Otras Técnicas
• Técnicas moleculares
– PCR
– PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism)
– Real time PCR
– Secuenciación
Técnicas moleculares
PCR
PCR-RFLP
Técnicas moleculares
Secuenciación
Bibliografía consultada
• AGRIOS, G. 2005. Plant pathology. 5nd. ed. London,
Elsevier Academic Press. 922 p.
• KADO, C. 2010.Plant bacteriology. Minessota, APS
Press. 336 p.
• TRIGIANO, R.; WINDHAM, M.; WINDHAM, A. 2008.
Plant pathology, concepts and laboratory
exercises. 2nd. ed. Florida, RC Press. 558 p.
Técnicas moleculares
Real time PCR
Diagnóstico de enfermedades
bacterianas