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Técnicas de Monitorización de la Infección por el VIH Carolina Gutiérrez Montero 22 de noviembre de 2010 Introducción 1‐Carga Viral 2‐Resistencias a los fármacos antirretrovirales 3‐Determinación del subtipo viral 4‐Determinación del Tropismo Viral 5‐Caracterización del HLA‐B*5701 OBJETIVO Qué datos nos aportan cada una de estas técnicas en la infección por el VIH 1‐ Carga Viral • La Carga Viral (CV) mide las copias de ARN plasmático, expresándose en copias/ml o log. • Se considera la técnica principal de monitorización junto con el recuento de CD4+ “Marca el tratamiento ARV” 1‐ Carga Viral • El límite de detección varía entre 50‐20 copias (según metodología): ‐ Branched DNA bDNA (hibridación) ‐ COBAS Amplicor (amplificación) ‐ k‐PCR (PCR a Tiempo Real) 1‐ Carga Viral Branched‐DNA: Ensayo cuantitativo basado en la amplificación de la señal de los ácidos nucleicos mediante la hibridación sucesiva de sondas de DNA. 1‐ Carga Viral • ¿Cuándo se pide una determinación de CV? ‐ Control rutinario en el seguimiento del paciente ‐ Sospecha de fallo virológico ‐ Sospecha de fallo en el tratamiento ARV 2‐ Estudios de Resistencias ¿Porqué son importantes las resistencias a los fármacos ARV? Porque condicionan la respuesta terapéutica NEJM 340 (21), p.1620 2‐ Estudios de Resistencias ‐ Pacientes naïve con infección reciente o crónica ‐ Fracaso terapéutico antes del cambio de tratamiento ‐ Profilaxis post‐exposición (si se conoce el caso índice) ‐ Gestación (mismos criterios que para pacientes naïve y pre‐tratados) 2‐ Estudios de Resistencias CONCEPTOS IMPORTANTES RESISTENCIAS PRIMARIAS RESISTENCIAS SECUNDARIAS MUTACIONES PRIMARIAS MUTACIONES SECUNDARIAS MUTACIONES CRUZADAS BARRERA GENÉTICA 2‐ Estudios de Resistencias MÉTODOS GENOTÍPICOS Y MÉTODOS FENOTÍPICOS 2‐ Estudios de Resistencias . IAS‐USA panel updated 2009 . Geno2Pheno 3‐ Subtipo Viral Epidemiología Molecular es la ciencia que permite estudiar los factores genéticos y virales que influyen en la infección y propagación del virus en una población También se encarga de identificar cepas de VIH de distintos subtipos, ya que la gran heterogeneidad genética del virus es la causa de que existan tantas variantes del mismo *Tipos, grupos, subtipos, formas circulantes recombinantes 4‐ Tropismo Viral 4‐ Tropismo Viral •Método fenotípico: Trofile® ESTA •Método genotípico: Secuenciación de la región V3 de la envuelta viral Test de tropismo TrofileTM Vector luc genoma VIH gag gag luc luc pol pol Vector expresión env paciente env env Transfección Infección CD4 CCR5 Tras el test se añaden inhibidores de la entrada para confirmar tropismo CD4 CXCR4 Demostración de virus R5 Virus Virus Se genera luz Uso de CCR5 Virus R5 CCR5 Virus No se genera luz No hay uso de CXCR4 CXCR4 No es un virus X4 Demostración de virus duales Virus Virus Se genera luz en ambas líneas celulares, CCR5 y CXCR4 Virus Se trata de un virus dualVirus CCR5 CXCR4 3‐ Tropismo Viral 1 3 2 4‐ Tropismo Viral •Método genotípico ¾ ‐ Extracción de ácidos nucleicos ¾ ‐ Amplificación de la región v3 de la envuelta viral ¾ ‐ Secuenciación de la región v3 ¾ ‐ Interpretación basada en algoritmos bioinformáticos (geno2pheno, PSSM) 5‐ Caracterización del HLA B*5701 •Importancia: reaccciones de hipersensibilidad a Abacavir Se recomienda hacer test antes de pautar tratamiento con ABC EL HLA es una molécula invariable (“morimos con la que nacemos”) HLA (Antígenos Leucocitarios Humanos) Nomenclatura de los alelos de HLA HLA-B* 57 01 Gen Familia (genérico) Alelo Nomenclatura Indica HLA-B Locus HLA HLA-B*57 Grupo de alelos que codifican un antígeno HLA-B*5701 Alelo HLA específico TIPIFICACIÓN DEL HLA Técnicas: Fenotipado mediante Ab: citometría o serología α1 α2 α3 TM Cyt Genotipado: biología molecular 2 5' 3 4 3' GRACIAS
