Download control preciso de expresion genetica en celulas eucarioticas

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
19
k
2 140 359
kInt. Cl. : C12N 15/00, C12N 15/12
11 Número de publicación:
6
51
ESPAÑA
C12N 15/62, C12N 15/85
C12N 15/90, C12N 5/10
C12N 1/19, C12N 1/15
A01K 67/027
k
TRADUCCION DE REIVINDICACIONES DE SOLICITUD
DE PATENTE EUROPEA
12
T1
kNúmero de solicitud europea: 94920204.8
kFecha de presentación de la solicitud: 14.06.1994
kNúmero de publicación de la solicitud: 0 705 334
kFecha de publicación de la solicitud: 10.04.1996
86
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71 Solicitante/s:
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72 Inventor/es: Bujard, Hermann;
30 Prioridad: 14.06.1993 US 76327
BASF AKTIENGESELLSCHAFT
Carl-Bosch Strasse 38
67056 Ludwigshafen, DE
KNOLL AKTIENGESELLSCHAFT
43 Fecha de la publicación de la mención BOPI:
01.03.2000
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ES 2 140 359 T1
vindicaciones:
k
Gossen, Manfred;
Salfeld, Jochen G. y
Voss, Jeffrey W.
46 Fecha de publicación de la traducción de las rei-
k
k
01.03.2000
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74 Agente: Dávila Baz, Angel
54 Tı́tulo: Control preciso de expresión genética en células eucarióticas mediante promotores que
responden a la tetaciclina.
Venta de fascı́culos: Oficina Española de Patentes y Marcas. C/Panamá, 1 – 28036 Madrid
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destino ADN, en la cual la molécula de ADN comprende:
REIVINDICACIONES
1. Molécula aislada de ADN para integrar
una secuencia de polinucleótidos, que codifica un
transactivador regulable por tetraciclina (tTA),
en un lugar predeterminado en una segunda
molécula de ADN-destino, en el cual el tTA comprende un represor Tet procariótico, ligado de
manera capaz de funcionar con un polipéptido,
que activa directa o indirectamente la transcripción en células eucarióticas, en el cual la
molécula ADN comprende una secuencia de polinucleótidos, que codifica el tTA, flanqueado en los
extremos 5’ y 3’ por secuencias de polinucleótidos
adicionales, con un largo suficiente para la recombinación homóloga entre la molécula de ADN y la
segunda molécula ADN destino en un lugar predeterminado.
2. Molécula de ADN según la reivindicación
1, en el cual las secuencias de polinucleótidos
adicionales que flanquean la secuencia de polinucleótidos que codifican el tTa, provienen de un
gen de interés o un sector regular de este, en el
cual se inserta la molécula de ADN.
3. Molécula de ADN según la reivindicación 2,
en el cual después de la integración de la molécula
de ADN en el gen de interés o en el sector regulador de este, la expresión del tTA es controlada
por elementos reguladores del gen de interés.
4. Molécula de ADN según la reivindicación 1,
en el cual el represor Tet del tTA es un represor
Tet derivado de Tn10.
5. Molécula de ADN según la reivindicación
1, en la cual el polipéptido del tTA que activa de
manera directa o indirecta la transcripción en las
células eucarióticas, provienen de la herpes simplex virus virion protein 16.
6. Molécula de ADN según la reivindicación
1, en la cual el polipéptido del tTA, que activa de
manera directa o indirecta la transcripción en las
células eucarióticas, es seleccionado del grupo que
consiste de polipéptidos de activación de transcripciones ácido, rico en prolina, rico en serina /
treonina y rico en glutamina.
7. Molécula de ADN según la reivindicación
1, en la cual el polipéptido del tTA, que activa de
manera directa o indirecta la transcripción en las
células eucarióticas, es un dominio de interacción,
seleccionado del grupo que consiste de un dominio
leucine-zipper, un dominio helix - loop - helix y
un dominio zink finger.
8. Molécula de ADN según la reivindicación
1, en la cual el polipéptido del tTA, que activa de
manera directa o indirecta la transcripción en las
células eucarióticas, es un dominio de interacción
de una proteı́na de unión TATA.
9. Molécula de ADN según la reivindicación
1, que además comprende una secuencia de polinucleótidos, que codifica un marcador selectivo.
10. Molécula de ADN según la reivindicación
9, en la cual la secuencia de nucleótidos, que codifica un marcador selectivo, es un gen tk o un
gen de resistencia a neomicina.
11. Molécula de ADN aislada para integrar
una secuencia de polinucleótidos, que codifica un
transactivador controlable por tetraciclina (tTA)
y un promotor que responde al tTA en un gen de
interés predeterminado en una segunda molécula
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a. una primera secuencia de polinucleótidos,
que comprende un sector flanqueante 5’ regulador del regulador del gen de interés, ligado de manera capaz de funcionar a:
b. una segunda secuencia de polinucleótidos,
que codifica un tTA, en el cual el tTA
comprende un represor Tet procariótico, ligado de manera capaz de funcionar a un
polipéptido, que activa de manera directa
o indirecta la transcripción en células eucarióticas; y
c. una tercera secuencia de polinucleótidos,
que comprende un promotor que responde
a tTA, ligado de manera capaz de funcionar
a:
d. una cuarta secuencia de polinucleótidos,
que comprende por lo menos una sección de
un sector codificante de un gen de interés;
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en la cual la primera y la cuarta secuencia de polinucleótidos tienen el largo suficiente para una recombinación homóloga entre la molécula de ADN
y el gen de interés en la segunda molécula ADN
destino, de tal manera que la expresión del tTA
se ve regulada por elementos reguladores 5’ del
gen de interés, y la expresión del gen de interés se
ve regulada por el promotor que responde al tTA.
12. Molécula de ADN según la reivindicación
11, que comprende además una quinta secuencia de polinucleótidos, que codifica un marcador
selectivo ligado de manera capaz de funcionar a
una secuencia regulatoria, en el cual la quinta secuencia de polinucleótidos se encuentra situada
entre la segunda y la tercera secuencia de polinucleótidos.
13. Molécula de ADN según la reivindicación
12, en la cual la quinta secuencia del polinucleótido que codifica el marcador selectivo, es un
gen tk o un gen de resistencia a neomicina.
14. Molécula de ADN según la reivindicación
11, que comprende además una quinta secuencia de polinucleótidos, que comprende una señal
de terminación de transcripción, un aislador de
transcripción o un sector de unión de matriz, y
en el la quinta secuencia de polinucleótidos se encuentra entre la segunda y la tercera secuencia de
polinucleótidos.
15. Molécula de ADN según la reivindicación
12, que comprende además una sexta secuencia de
polinucleótidos, que comprende una señal de terminación de transcripción, un aislador de transcripción o un sector de unión de matriz, y en el
cual la sexta secuencia de polinucleótidos se encuentra la quinta y la tercera secuencia de polinucleótidos.
16. Molécula de ADN según la reivindicación
11, en el cual el represor Tet del tTA es un represor Tet derivado de Tn 10.
17. Molécula de ADN según la reivindicación
11, en el cual el polipéptido de tTA que activa de
manera directa o indirecta la transcripción en las
células eucarióticas, es de herpes -simplex virus
virion protein 16.
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18. Molécula de ADN según la reivindicación
11, en la cual el polipéptido de tTA que actia
de manera directa o indirecta la transcripción
en las células eucarióticas, está seleccionado del
grupo que consiste de polipéptidos activadores de
la transcripción ácidos, ricos en prolina, ricos en
serina / treonina y ricos en glutamina.
19. Molécula de ADN según la reivindicación
11, en la cual el polipéptido de tTA que activa de
manera directa o indirecta la transcripción en las
células eucarióticas, es un dominio de interacción,
seleccionado del grupo que consiste de un dominio
leucine-zipper, un dominio helix - loop - helix y
un dominio zink finger.
20. Molécula de ADN según la reivindicación
11, en la cual el polipéptido del tTA que activa de
manera directa o indirecta la transcripción en las
células eucarióticas es un dominio de interacción
de la proteı́na de unión TATA.
21. Molécula de ADN según la reivindicación
11, en la cual el promotor que responde al tTA de
la tercera secuencia de nucleótidos comprende un
promotor mı́nimo, ligado de manera capaz de funcionar a por lo menos una secuencia de operador
tet.
22. Molécula de ADN según la reivindicación
21, en la cual el promotor mı́nimo se deriva de un
cytomegalovirus immediate early gene promoter
o un herpes simples virus thymidine kinase gene
promoter.
23. Molécula de ADN según la reivindicación
11, en el cual el gen de interés es un gen humano.
24. Molécula de ADN según la reivindicación
23, en la cual el gen humano codifica un producto
de genes seleccionado del grupo que consiste de
deaminasa adenosina, factor VIII, factor IX, distrofina, β-globina, receptor LDL, CFTR, insulina, eritropoyetina, factores anti-angiogenésicos,
hormonas de crecimiento, glucocerebrosidasa, β
-glucouronidasa, α 1 -antitripsina, fenilalanin hidroxilasa, tirosina hidroxilasa, ornitina transcarbamilasa, arginosuccinato sintetasa, UDP-glucoronisil transferasa, apoA1, MDR1, MRP, TNF,
receptor TNF soluble, una interleucina, una interferona, una citoquina, un factor de crecimiento
y un gen supresor de tumores.
25. Célula hospedante eucariótica, que comprende la molécula de ADN según la reivindicación 1, en la cual la molécula de ADN está integrada en un lugar predeterminado en una segunda
molécula ADN destino en la célula hospedante.
26. Célula hospedante de la reivindicación 25,
que comprende además un gen de interés ligado
de manera capaz de funcionar a un promotor de
transcripción que responde al tTA.
27. Célula hospedante de la reivindicación 26,
en la cual el promotor que responde al tTA comprende un promotor mı́nimo ligado de manera capaz de funcionar a por lo menos una secuencia de
operador tet.
28. Célula hospedante de la reivindicación 27,
en la cual el promotor mı́nimo se deriva de un
citomegalovirus immediate early gene promoter
o un herpes simplex virus thymidine kinase gene
promoter.
29. Célula hospedante de la reivindicación 25,
que es una célula de mamı́fero.
30. Célula hospedante de la reivindicación 29,
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que es una célula humana.
31. Célula hospedante de la reivindicación 29,
que es una célula matriz embrional.
32. Célula hospedante de la reivindicación 25,
que es una célula de levadura o de hongo.
33. Célula hospedante de la reivindicación 25,
en el cual la célula es una célula de insecto y la segunda célula destino ADN es el gen de un insecto
o un gen de baculovirus.
34. Un método para inhibir la transcripción
del gen de interés ligado de manera capaz de
funcionar al promotor que responde al tTA en
la célula hospedante de la reivindicación 26, que
comprende poner la célula en contacto con tetraciclina o un análogo de la tetraciclina.
35. Una célula hospedante que comprende el
ácido nucleico de la reivindicación 11, en la cual el
ácido nucleico está integrado en el gen de interés
predeterminado en la segunda molécula destino
de ADN en la célula hospedante.
36. La céula hospedante de la reivindicación
35, que es una célula de mamı́fero.
37. La célula hospedante de la reivindicación
36, que es una célula humana.
38. La célula hospedante de la reivindicación
36, que es una célula matriz embrional.
39. La célula de la reivindicación 35, que es
una célula de levadura o una célula de hongos.
40. Célula hospedante de la reivindicación 35,
en la cual la célula es una célula de insecto y el
gen de interés es un gen de insecto o un gen de
baculovirus.
41. Un método para inhibir la transcripción
del gen eucariótico de interés en la célula hospedante de la reivindicación 35, que comprende
poner la célula en contacto con tetraciclina o un
análogo de la tetraciclina.
42. Un animal no humano transgénico que
tiene un gen transgénico que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un transactivador controlable por tetraciclina (tTA), en
el cual el tTA comprende un represor Tet procariótico, ligado de manera capaz de funcionar a
un polipéptido, que activa de manera directa o
indirecta la transcripción en células eucarióticas.
43. El animal de la reivindicación 42, en el
cual el represor Tet del tTA es un represor Tet
derivado de Tn10.
44. El animal de la reivindicación 42, en el
cual el polipéptido del tTA que activa de manera
directa o indirecta la transcripción en células eucarióticas, es de herpes simplex virus virion protein 16.
45. El animal de la reivindicación 42, en el
cual el polipéptido del tTA que activa de manera directa o indirecta la transcripción en células
eucarióticas, es seleccionado de un grupo consistente de polipéptidos de activación de transcripción ácidos, ricos en prolina, ricos en serina / treonina y ricos en glutamina.
46. El animal de la reivindicación 42, en el
cual el polipéptido del tTA que activa de manera
directa o indirecta la transcripción en células eucarióticas es un dominio de interacción seleccionado del grupo consistente de un dominio leucine
zipper, un dominio helix -loop - helix y un dominio zinc finger.
47. El animal de la reivindicación 42, en el
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cual el polipéptido del tTA que activa de manera
directa o indirecta la transcripción en células eucarióticas es un dominio de interacción de una
proteı́na de una proteı́na de unión TATA.
48. El animal de la reivindicación 42, que
además tiene un segundo transgen que comprende
un gen de interés ligado de manera capaz de funcionar a un promotor que responde a tTA.
49. El animal de la reivindicación 42, que es
un ratón.
50. El animal de la reivindicación 42, que es
seleccionado de un grupo que consiste de una
vaca, una cabra, una oveja y un cerdo.
51. Un método para inhibir la transcripción
del segundo transgen en el animal transgénico de
la reivindicación 48, que comprende la administración de tetraciclina o un análogo de tetraciclina
al animal.
52. Un animal transgénico no humano, con un
transgen que comprende una secuencia de polinucleótidos codifica un transactivador controlable con tetraciclina (tTA), en el cual el tTA comprende un represor procariótico Tet ligado de manera capaz de funcionar a un polipéptido que activa de manera directa o indirecta la transcripción
en células eucarióticas, en las cuales el transgen
está integrado por recombinación homóloga en un
lugar predeterminado dentro de un cromosoma
dentro de células del animal.
53. El animal de la reivindicación 52, que
tiene además un segundo transgen que comprende
un gen de interés ligado de manera capaz de funcionar a un promotor que responde a tTA.
54. Un método para inhibir la transcripción
del segundo transgen en el animal de la reivindicación 53, que comprende administrar tetraciclina
o un análogo de tetraciclina al animal.
55. Un animal transgénico con un transgen
que comprende una secuencia de polinucleótidos
que codifica un transactivador controlable mediante tetraciclina (tTA) y un promotor que responde al tTA, en el cual el transgen está integrado
por recombinación homóloga en un lugar predeterminado dentro de un gen de interés dentro de
las células del animal de tal manera que la expresión del tTA está controlada por elementos de
regulación 5’ del gen de interés y la expresión del
gen de interés está controlada por el promotor que
responde al tTA.
56. Un método para inhibir la transcripción
del gen de interés en el animal de la reivindicación
55, que comprende administrar tetraciclina o un
análogo de tetraciclina al animal.
57. Un proceso para producir y aislar un producto genético codificado por el gen de interés,
ligado de manera capaz de funcionar al promotor
de transcripción que responde al tTA en la célula
de la reivindicación 26, que comprende:
a. cultivar células en un medio de cultura en
presencia de tetraciclina o un análogo de tetraciclina;
b. reducir la concentración de tetraciclina o
del análogo de tetraciclina para estimular
la transcripción del gen de interés;
c. además cultivar las células hasta que estas
produzcan la cantidad deseada del producto
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genético codificado por el gen de interés;
d. aislar el producto genético de las células cosechadas o del medio de cultivo.
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58. El proceso de la reivindicación 57, en el
cual las células son células de mamı́fero.
59. El proceso de la reivindicación 57, en el
cual las células son células de levadura o de hongos.
60. Un método para producir el aninmal transgénico no humano de la reivindicación 42, que
comprende:
a. introducir la molécula de ADN que codifica
el tTA en un óvulo fertilizado;
b. implantar el óvulo fertilizado en una madre
acogente seudoembarazada; y
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c. permitir al óvulo fertilizado desarrollarse en
el animal transgénico no humano produciendo ası́ el animal transgénico no humano.
61. Un método para producir una célula hospedante con una molécula de ADN que codifica
un transactivador controlable mediante tetraciclina (tTA) integrada en un lugar predeterminado
en una segunda molécula destino ADN dentro de
la célula, que comprende:
a. introducir la molécula de ADN de la reivindicación 1 en una población de células
bajo condiciones apropiadas para la recombinación homóloga entre el ADN que codifica el tTA y la segunda molécula destino
ADN, y
b. seleccionar una célula en la cual el ADN
que codifica el tTA se ha integrado en un
lugar predeterminado dentro de la segunda
molécula ADN destino.
62. Un método para producir un animal transgénico no humano con un transgen que codifica
un transactivador controlable mediante tetraciclina (tTA) integrado en un lugar predeterminado
dentro del ADN cromosomático de las células del
animal, y que comprende:
a. introducir la molécula de ADN de la reivindicación 1 en una población de células
matrices embrionarias bajo condiciones adecuadas para la recombinación homóloga entre el ADN que codifica el tTA y ADN cromosómico dentro de la célula; y
b. seleccionar una célula embrional matriz en
la cual el ADN que codifica el tTA se ha integrado en un lugar predeterminado dentro
de la ADN cromosómicas de la célula;
c. implantar la célula embrional matriz en un
blastocito;
d. implantar el blastocito en una madre acogente seudoembarazada; y
e. permitir al blastocito desarrollarse en un
animal transgénico no humano, produciendo ası́ el animal transgénico no humano.
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63. Un método para producir un animal transgénico no humano con un transgen que codifica
un transactivador controlable mediante tetraciclina (tTA) y un promotor que responde al tTA
integrado en un lugar predeterminado dentro del
gen de interés en las células del animal, que comprende:
a. introducir la molécula de ADN de la reivindicación 11 en una población de células
embrionales matrices bajo condiciones adecuadas para la recombinación homóloga entre el ADN que codifica el tTA y el gen de
interés en la célula;
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b. seleccionar una célula embrional matriz en
la cual el ADN que codifica el tTA se ha integrado en un lugar predeterminado dentro
del gen de interés en la célula;
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c. implantar la célula embriónica matriz en un
blastocito;
d. implantar el blastocito en una madre acogente seudoembarazada; y
e. permitir al blastocito desarrollarse en un
animal transgénico no humano, produciendo ası́ un animal transgénico no humano.
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NOTA INFORMATIVA: Conforme a la reserva
del art. 167.2 del Convenio de Patentes Europeas (CPE) y a la Disposición Transitoria del RD
2424/1986, de 10 de octubre, relativo a la aplicación
del Convenio de Patente Europea, las patentes europeas que designen a España y solicitadas antes del
7-10-1992, no producirán ningún efecto en España
en la medida en que confieran protección a productos quı́micos y farmacéuticos como tales.
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Esta información no prejuzga que la patente esté o
no incluı́da en la mencionada reserva.
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