Download identificacin de la enterotoxina lt en cepas de e

IDENTIFICACIÓN DEL GEN Lt EN CEPA DE E. coli AISLADAS DE
DIFERENTES AMBIENTES
Laura E. MARTÍNEZ GÓMEZ1, Ma. Lilia CEDILLO RAMÍREZ2, Constantino GIL
JUÁREZ2, Elsa I. CASTAÑEDA ROLDÁN2 y Edith CHÁVEZ BRAVO23.
1
Escuela de Biología de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla 2Centro
de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas, BUAP. 3Posgrado en Ciencias
Ambientales, BUAP. Edificio 76 complejo de Ciencias 3er. Piso C.U. C.P. 72570
Tel. y Fax 2332010 Ext. 12 echb_02@yahoo.com.mx.
Palabras clave: ETEC, Factores de virulencia, LT y ST.
RESUMEN
Escherichia coli Enterotoxigenica (ETEC) es uno de los principales
patógenos en humanos y en animales causando diarreicas deshidrataciones.
ETEC causa la diarrea del viajero, en su proceso de patogenecidad produce
adhesinas intestinales y enterotoxinas la termolábil (LT) y la enterotoxina
termoestable (ST) ésta última contiene múltiplos residuos de cisteína que le
confiere estabilidad. Ambas toxinas pueden manifestarse o solo una de ellas
para causar daño en las células epiteliales. En el presente trabajo se trata de
Identificar el gen Lt y St de cepas E. coli aisladas de diferentes ambientes,
utilizando mediante la técnica de PCR, de las 156 cepas utilizadas el 55.76%
presentó por lo menos uno de los dos genes, de las cuales el 8.97% pertenecen
para el gen Lt, un 44.23% para ST y un 2.56% para ambas toxinas. Nuestros
resultados proponen que se le debe dar mayor importancia a la búsqueda de
genes que codifican factores de virulencia ya que ellos pueden proliferar o
expresarse dentro de un nuevo hospedero o fuera de ellos. Además apoyamos
lo reportado por Cortes (2000) donde propone que la proporción en la que se
encuentra ETEC es alta en el ambiente, provocando su capacidad para colonizar
diferentes espacios y proliferarse, esto debe llamar la atención para estudiar los
niveles de saneamiento, así como sus mecanismos de patogenicidad que las
cepas producen para causar daño.
INTRODUCCIÓN
Las enfermedades que causan el rompimiento de la salud en la sociedad
como las enfermedades diarreicas representan un problema de salud pública
y causa importantes niveles de morbilidad y mortalidad infantil en muchos
países en desarrollo. Su transmisión y frecuencia está relacionada con el bajo
nivel de saneamiento y del desarrollo económico; así como la desnutrición y
las malas condiciones sanitarias de la gente que vive con pocos recursos
(Carneiro et al. 1996; Fagundes, 1996).
1
Existen diferente agentes etiológicos causantes de las enfermedades
diarreicas como: bacterias, virus, protozoarios y helmitos. Escherichia coli, es
uno de los agentes causantes desde 1920 (Vu N. et al 2005), ésta
enterobacteria puede presentarse por periodos cortos en el medio ambiente, sin
embargo, para su transmisión se requiere de nuevos individuos hospederos para
su persistencia a largo plazo (Savageau, 1983), así que estos microorganismos
pueden tener un hábitat primario (hospedero) y un hábitat secundario (ambiente
externo) enfrentándose a hábitats con características muy diferentes por
ejemplo: temperaturas constantes vs variables, anaerobiosis vs aerobiosis, alta y
baja disponibilidad de nutrientes, competencia extera-e-intra especifica, entre
otras. Savageau (1983) propone que la respuesta a estos diferentes ambientes
se debe a la evolución de un sistema de regulación dual, así como a la
participación de la selección natural que puede favorecer genotipos específicos
en diferentes hábitat, considerada ésta como una alternativa evolutiva (Whittam,
1988).
E. coli al igual que otras bacterias han generado cierto tipo de
mecanismos biológicos que conducen a un fenotipo de resistencia que les
permite sobrevivir (Dever y Dermody, 1991). Estos mecanismos pueden ser:
producción de enzimas, cambios de permeabilidad, modificación de las
proteínas de unión, mutaciones ribosómicas y cromosómicas, eliminación de
requerimientos de timina, entre otros (Dever y Dermody, 1991; Bush, 1997;
Miller, 1998). Las bacterias también han generado ciertos factores de
virulencia para causar daño al hospedero, ya que promueven la colonización y
facilitan la sobrevivencia de las bacterias infectantes, destacando su adherencia
mediada por pilis o fimbrias, la presencia de enterotoxinas, las adhesinas no
fimbriales y las cápsulas (Mims,C.N et al. 1995).
En la actualidad se han identificado seis tipos o cepas de E. coli
diarreogenicas:
enterotoxigenica
(ETEC),
enteroinvasiva
(EIEC),
enterohemorragica (EHEC), enteroagregativa, (EAEC) y enteropatogénica
(EPEC) cada una de estas se diferencia por la presencia de sus factores de
virulencia y por el tipo de diarrea que causan (Franzolin et al. 2005).
En este trabajo se elige como agente de estudio a ETEC debido a que
causa la diarrea del viajero, en su mecanismo de patogenecidad produce
factores de colonización, expresión de adhesinas intestinales y la producción de
enterotoxinas como: la termolábil (LT) cuyo mecanismo es semejante a la
enterotoxina de Virbrio cholerae, también produce la enterotoxina termoestable
(ST) que contiene múltiples residuos de cisteína que le confiere estabilidad,
además produce hipersecreción de electrolitos y agua a la luz intestinal que se
manifiesta en forma de diarrea acuosa (Shaheen et al. 2004). Ambas toxinas
pueden manifestarse o solo una de ellas para causar daño en las células
epiteliales y suelen ser portadas por plásmidos (Tauschek et al. 2002).
2
ETEC coloniza la superficie del intestino delgado por medio de fimbrias
llamadas factores de colonización (CFAs), también presenta una fimbria
denominada "Longus" (Gómez et al. 2000); de 22kDa que presenta homología
con la región N-terminal de la estructura de los pili tipo IV clase b que
incluye a TCP (pilus corregulado con la toxina colérica) de Vibrio cholerae
(Girón et al. 1994).
En México se ha aislado E. coli como agente etiológico de diarrea.
Cravioto y colaboradores (1985) reportan que en la localidad rural de Morelos, a
ETEC como el principal agente productor de diarrea, con un 33.5% y el 8.1%
para EPEC. En 1994 Valdespino y colaboradores encontraron que ETEC es
endémica en nuestro medio y que causa la diarrea del turista en todo el mundo.
Cortes y colaboradores (2000) realizaron un estudio sobre el brote de diarreas
causadas por el desbordamiento del canal de aguas negras en el valle de
Chalco México, ellos encontraron que el 76.6% de los brotes fueron causados
por E. coli y el grupo patógeno predominante de E.coli fue ETEC con un 62.2%
de los casos, por lo que sugieren que ETEC es un agente importante que causa
diarrea en zonas con condiciones sanitarias precarias y en el ámbito mundial es
el grupo mayor aislado.
Schultsz y colaboradores en 1994 realizaron la detección de ETEC en
muestras de heces fecales por medio de pruebas de DNA con oligos no
radioactivos por PCR, obteniendo que de 50 muestras médicas de niños, tres
muestras (6%) hibridaron con las pruebas para LT de 696pb, dos (4%)
hibridaron para las pruebas de ST de 186pb.
En el 2002 Tauschek y colaboradores, realizaron un estudio para la
identificación de la enterotoxina LT en cepas E. coli, teniendo como resultado
que de 24 cepas, 11 producieron LT únicamente, 4 presentaron únicamente ST,
9 cepas
presentaron ambas toxinas LT y ST. En cambio Shaheen y
colaboradores (2004), realizaron un estudio de 915 muestras de niños con
diarrea en Egipto, en el cual encontraron que el tipo de toxina mas común
presentado fue ST (61.3%), seguida por LT (26.4%) y con ambas toxinas
(LT/ST) con un 12.2%. Franzolin y colaboradores (2005) realizaron un estudio
similar, donde encontraron de 175 muestras el 7.5% fueron para ETEC de las
cuales 5 resultaron positivas para la prueba de LT, 3 para ST y 1 en la que
ambas toxinas se presentaron.
Vu Nguyen en el 2005 reportaron un estudio de la detección y
caracterización de E. coli diarrogenica de varias categorías en niños de Vietnam,
en el cual obtuvieron un total de 587 muestras de niños con diarrea, 13 dieron
positivo para ETEC (2.2%) y de un total de 249 muestras de niños saludables,
solo 1 dio positivo para ETEC (0.4%), de las cuales 7 presentaron LT, 3 con ST
y 4 cepas presentaron ambas toxinas.
3
Debido a una incidencia alta de aislamientos de E. coli de diferentes
ambientes y al pato tipo presente (ETEC), es importante conocer la prevalencia
de sus factores de virulencia ayudando de esta manera a encaminar nuevas
estrategias para combatir y mejorar el control sanitario por lo que se plantea
como objetivo en este trabajo la Identificación de las enterotoxinas de ETEC.
MATERIAL Y MÉTODOS.
Se utilizó un total de 156 cepas de E. coli aisladas de agua (28),
alimentos (18), aire (27), muestras clínicas de niños (34) y de adultos (49). Se
utilizó la cepa E9034/A control (+) y la E9034/P como (-) para la identificación
del gen Lt, utilizando la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), la amplificación se realizó en una mezcla total de 25 μl (Buffer 10x,
Mg2Cl, Taq Polimerasa, DNTP’s, 1 μl de cada oligonucleotido y 5 μl de DNA
problema). La mezcla fue sometida a un termociclador previamente programado
a 37 ciclos, el producto amplificado fue visualizado en un transiluminador de UV,
después de realizar una electroforesis en geles de agarosa al 1%. Los
resultados se compararon con la presencia del gen St anteriormente buscado.
RESULTADOS
Del total de cepas el 8.97% presento una amplificación de 696pb para el
gen Lt, el grupo con mayor porcentaje fue el de muestras clínicas de adultos con
un 24.48% (12/49), seguidas de las muestras de alimentos con 5.55% (1/18), las
muestras de aire presentaron el 3.7% (1/27), mientras que las muestras de agua
y muestras clínicas de niños no presentaron amplificación de la enterotoxina LT
(Fig. 1).
40
35
N
C
o
e
.
p
a
d
s
e
30
25
20
LT
15
24.48%
10
5
3.7%
0
0%
Sin LT
5.55%
0%
aire
agua
alimentos
clinicas
ninos
clinicas
adultos
Figura 1.- Comparacion de la enterotoxina LT en cepas E. coli
4
Con respecto a la amplificación del gen que expresa ST se encontró que
el 44.23% presento una banda de 186pb, el grupo que registro mayor porcentaje
fue el de aire con un 70.37%(19/27), seguidas por el grupo de muestras clínicas
de niños con 64.7% (22/34), el grupo de agua presento 64.28% (18/28) y el de
alimentos el 55.5%(10/18), las cepas de muestras clínicas de adultos no
presento amplificación dicha toxina (Fig. 2).
50
45
40
N
C
o
e
.
p
a
d
s
e
35
30
25
70.37%
64.7%
64.28%
20
ST
Sin ST
15
55.5%
10
5
0
aire
0%
agua
alimentos
clinicas
ninos
clinicas
adultos
Figura 2.- Comparacion de la enterotoxina ST en cepas E. coli
Comparando la presencia de ambas toxinas encontramos que el 2.56%
del total de cepas presenta tanto el gen de LT y de ST, de las cuales del número
total de cepas clínicas 3(8.82%) presentan ambas toxinas, en el grupo de las
cepas de agua solo 1(3.57%) tuvo ambas y con respecto los grupos de aire,
alimentos y clínicas de adultos solo presentaron un gen que codifica a una u otra
toxina, sin que estén juntas. En la figura 3 se observa una mayor expresión de
St que de Lt para todos los grupos excepto en el grupo de clínicas de adultos,
las cuales presentaron una mayor expresión de LT.
5
25
22
19
18
20
N
C
o
e
.
p
a
d
s
e
15
10
12
LT
10
5
LT&ST
1
0
aire
0
1
0
agua
1
3
0
alimentos
0
clinicas
de ninos
0
ST
0
clinicas
de
adultos
Figura 3.- Comparacion de las enterotoxinas LT, LT&ST y ST de E. coli
Del total de cepas de E. coli aisladas de diferentes ambientes el 55.76%
presento por lo menos uno de los dos factores de virulencia, de las cuales el
44.23% pertenece a la amplificación d el gen St, el 8.97% presento la
amplificación para el gen LT y el 2.56% pertenece a cepas de E. coli que tienen
ambos genes (ST y LT), el resto de las cepas (44.23%) no presentaron ninguno
de estos genes, no se descarta la posibilidad que tengan otros factores de
virulencia que no se buscaron aquí (Fig. 4).
8.97%
LT
44.23%
Ninguno
ST
44.23%
2.56%
2.56%
LT/ST
LT&ST
Figura 4.- Comparacion de la presencia de factores de virulencia en E.coli.
6
DISCUSIÓN
De las 156 cepas aisladas, LT se registro en un 8.97%, siendo el grupo
de clínicas el que presento mayor incidencia y ST en un 44.23%, siendo el
grupo de clínicas de niños el de mayor incidencia, concordamos con los datos
de Shaheen (2004), donde reportan que el factor de virulencia con mayor
incidencia para ETEC es ST, seguida por LT y posteriormente con ambas
(LT/ST), sin embargo la presencia de al menos uno de los factores de virulencia
de ETEC, favorece la manifestación de cuadros diarreicos, tal como lo menciona
Franzolin (2005).
Los datos obtenidos son similares a los resultados de Vu N. (2005) debido
a que las enfermedades diarreicas están más relacionadas con pacientes
infantiles, ya que el grupo de cepas de E. coli de niños, fue el de mayor
incidencia en la expresión de ST, siendo el foco de infección para estas cepas
los alimentos principalmente. Sin embargo Shultsz (1994), menciona haber
obtenido una mayor expresión de LT en muestras clínicas de niños, reforzando
la idea de que los niños son los más vulnerables a ETEC.
Del total de las cepas de E. coli aisladas, el 55.76% presento por lo
menos un factor de virulencia para ETEC el resto de las cepas no se les
descarta la posibilidad de encontrar otros factores de virulencia del mismo
patotipo como: factores de colonización o la fimbria de tipo IV denominada
Longus; o el hallazgo de otros factores de virulencia de otras cepas patógenas.
El alto registro de ETEC en el presente estudio muestra la importancia, de
ETEC como agente etiológico de la diarrea en niños y en viajeros, originando
brotes en poblaciones en vías de desarrollo como lo es nuestro país.
Se encontró el gen que amplifica la enterotoxina LT solo en muestras de
aire, alimentos y clínicas de adultos y el gen ST en todos los grupos, lo que
lleva a concluir que se registro la presencia de por lo menos un factor de
virulencia de ETEC en las diferentes sitios del ambiente.
Existen aun estudios que se dedican a la tipificación serologíca de las
bacterias, por lo que nosotros sugerimos la búsqueda de más factores de
virulencia en el medio ambiente ya que la presencia de ellos nos darían
posiblemente una respuesta a las vías de infección del ser humano, así
como la búsqueda de un fármaco que evite su resistencia.
7
AGRADECIMIENTOS
Se agradece al Laboratorio de Micoplasmas y al laboratorio de
Patogenicidad Microbiana del Centro de Investigaciones de Ciencias
Microbiologicas del Instituto de Ciencias de la Universidad Autónoma de Puebla.
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