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III PRODUCCIÓN IN VITRO Y TRANSFERENCIA DE EMBRIONES EN BOVINOS Concepción AHUKA AGUIRRE, Felipe MONTIEL PALACIOS*, Ponciano PÉREZ HERNÁNDEZ y Jaime GALLEGOS-SÁNCHEZ *Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Veracruzana, Veracruz, Méx. fmontiel@uv.mx La biotecnología abarca las aplicaciones tecnológicas en las que interviene la biología reproductiva, y aquéllas que involucran la manipulación o utilización del material genético de organismos vivos para usos específicos (FAO, 2000). La biotecnología de la reproducción ha tenido un papel decisivo en la ganadería bovina en los últimos 60 años (Thibier, 2005). Sus principales objetivos son aumentar la producción, la eficiencia reproductiva y acelerar la mejora genética (Madan, 2002). La inseminación artificial y la criopreservación de semen son las biotecnologías usadas de manera extensiva, aunque otras como la sincronización de estros para realizar inseminación artificial a tiempo fijo, la ovulación múltiple, la transferencia de embriones y la producción in vitro de embriones también están disponibles, y pueden contribuir de manera importante a mejorar la eficiencia reproductiva y las tasas de gestación (Madan, 2005). No obstante las ventajas que ofrecen las diferentes biotecnologías de la reproducción disponibles y los resultados satisfactorios obtenidos principalmente en Norteamérica y Europa, su aplicación en los sistemas de producción de pequeños productores en países en desarrollo se ve limitada por los siguientes factores (Madan, 2003): la ausencia de una base de datos completa y confiable del ganado que impide la implementación de diferentes programas de manejo; la falta de científicos y técnicos entrenados para desarrollar y aplicar las tecnologías, tanto a nivel gubernamental como privado; la ausencia de contacto entre la industria, las universidades y las instituciones que impide la implementación de las tecnologías nuevas en productos comercializables; la incapacidad de los productores de acceder a estas tecnologías a un precio razonable; y principalmente, la poca inversión en biotecnología animal. Producción in vitro de embriones bovinos La producción in vitro (PIV) de embriones permite acelerar el mejoramiento genético en el ganado, producir embriones a gran escala para uso comercial o científico, aprovechar hembras de alto valor genético con problemas de infertilidad, rescatar material genético valioso después del sacrificio de hembras debido a control de enfermedades, desecho u otras razones, y producir animales transgénicos (Hasler, 2003; Camargo et al., 2006; Pfeifer et al., 2008). La técnica de PIV de embriones se desarrolló en Europa en la década de 1990; actualmente ha adquirido gran importancia en Japón y en Brasil, en donde se produce casi la mitad de los embriones transferidos PIV a nivel mundial (Thibier, 2005). La PIV permite aprovechar gran número de los ovocitos inmaduros de hembras bovinas, tanto los contenidos en los ovarios de hembras vivas que de otra forma 38 sufrirían atresia, como los recuperados de ovarios obtenidos en rastros, para obtener embriones (Hasler, 1998; Herradón et al., 2007). Los primeros trabajos sobre PIV de embriones sólo incluían el paso de la fertilización llevada a cabo in vitro. Ésta se realizaba usando ovocitos maduros recuperados por medio de laparotomía o laparoscopía de hembras sometidas a tratamiento para inducir ovulación múltiple (Greve et al., 1984; Lambert et al., 1986), y espermatozoides capacitados en el oviducto o útero de vacas en estro o en el útero de conejas (Hanada y Nagase, 1981). Posteriormente se utilizaron ovocitos madurados in vitro, y espermatozoides capacitados in vitro (Goto et al., 1989). El nacimiento del primer becerro vivo en el mundo resultado de fertilización in vitro ocurrió en 1981 (Brackett et al., 1982), y a partir de 1990 se reportaron nacimientos regulares de becerros PIV (Gordon y Lu, 1990). Inicialmente, los medios de cultivo eran muy complejos y suplementados con suero. Posteriormente se generaron medios más definidos que permitieron estudiar cada componente en función del efecto que genera sobre el desarrollo embrionario, su sobrevivencia a la descongelación, la tasa de gestación post-transferencia y el porcentaje de crías viables (Mucci et al., 2006). Las mejoras en los sistemas de cultivo permitieron realizar in vitro los demás pasos de la secuencia de producción de embriones de manera exitosa: la maduración de ovocitos colectados in vivo, la fertilización, y el cultivo de cigotos y embriones hasta la etapa de mórula o blastocisto, que es la etapa apta para la transferencia del embrión (Gordon y Lu, 1990; Thibier, 2005). El proceso de PIV de embriones se divide en diferentes etapas cronológicas: a) colección y selección de ovocitos, b) maduración in vitro de ovocitos, c) fertilización in vitro de ovocitos maduros, y d) cultivo in vitro de embriones hasta la etapa de blastocisto. Estos pasos comprenden una compleja serie de procesos fisiológicos, muchos aún desconocidos, que condicionan cada uno el éxito o el fracaso del siguiente (Mucci et al., 2006; Herradón et al., 2007). Colección y selección de ovocitos Los ovocitos bovinos se obtienen de dos maneras: la primera es a partir de ovarios de hembras sacrificadas en rastro, a los que se les aspiran los folículos con diámetro de 3 a 6 mm. La segunda es a partir de hembras vivas mediante la aspiración transvaginal guiada por ultrasonido (OPU) de los folículos ováricos (Madan, 2005; Herradón et al., 2007). La mayor parte de los ovocitos obtenidos tras la aspiración folicular sufre atresia. Por ello es necesario evaluar su calidad antes de usarlos para maduración in vitro, pues sólo algunos tienen la capacidad de ser fecundados y soportar el desarrollo embrionario (Herradón et al., 2007). La selección del ovocito se basa en su diámetro, el aspecto de su citoplasma y las células del cúmulo que lo rodean. El diámetro del ovocito condiciona su capacidad 39 para madurar (Fair et al., 1995). Un diámetro inferior a 110 μm indica que está en fase de crecimiento y no ha adquirido la capacidad para madurar (Herradón et al., 2007). Por otro lado, los ovocitos con citoplasma oscuro muestran acumulación de lípidos y tienen buen potencial para el desarrollo, contrario a los que tienen el citoplasma pálido. Cuando el citoplasma es negro los ovocitos están viejos y tienen muy bajo potencial para el desarrollo (Nagano et al., 1999, 2006). Por su parte, los ovocitos rodeados por un cúmulo compacto formado por varias capas de células tienen mayores porcentajes de maduración, fecundación y desarrollo hasta blastocistos, que los que carecen de cúmulo o están rodeados solamente por la corona radiada (Momozawa y Fukuda, 1995). La adecuada selección de los ovocitos para su maduración in vitro es crucial para el éxito de la fertilización in vitro y el desarrollo embrionario subsecuente (De los Reyes et al., 1999). De las características morfológicas del ovocito a madurar dependerá que reinicie la meiosis y la maduración citoplasmática (Wassarman, 1994). Maduración de ovocitos La maduración in vivo del ovocito empieza 20 h después del pico preovulatorio de gonadotropinas (Hyttel et al., 1997), que da inicio a una serie de procesos bioquímicos en la célula que llevan a cambios morfológicos y funcionales (Downs, 1993). Durante la maduración el ovocito reinicia la meiosis detenida en la etapa de dictiateno de la primera profase meiótica, para alcanzar el estado de metafase de la segunda división meiótica o metafase II, estado en el que es ovulado (Wassarman, 1994). Cuando los ovocitos son removidos del folículo experimentan maduración espontánea, por lo que la maduración in vitro implica no sólo el reinicio de la meiosis, sino que el ovocito adquiera competencia para ser fecundado y para desarrollarse (De los Reyes et al., 1999). La maduración in vitro constituye una etapa decisiva en el proceso de PIV de embriones. Cuando la maduración se produce en condiciones desfavorables se bloquean la meiosis y la fecundación, pero cuando sólo presenta pequeñas fallas sus efectos se manifiestan hasta la división, la formación del blastocisto o después de la implantación (Herradón et al., 2007). El cultivo de ovocitos y de embriones en condiciones inapropiadas induce cambios en el genoma embrionario (Niemann y Wrenzycki, 2000) y en la expresión génica (Rinaudo y Schultz, 2004). Los ovocitos bovinos madurados in vitro o in vivo tienen similares tasas de maduración (Greve et al., 1987; Thibault et al., 1987). Aproximadamente 90% de los ovocitos inmaduros madurados in vitro alcanzan la etapa de metafase II y expulsan el primer cuerpo polar 16 a 24 h después de iniciada la maduración. De éstos, aproximadamente 80% es fertilizado y comienza a dividirse, al menos hasta la etapa de 2 a 4 células (Farin et al., 2001; Mucci et al., 2006). Sin embargo, la competencia para el desarrollo es menor en ovocitos madurados in vitro que in vivo (Sirard y Blondin, 1996; Dieleman et al., 2002). Esto puede deberse a la menor competencia para el desarrollo de ovocitos colectados de folículos pequeños (2 a 6 mm de diámetro) (Blondin y Sirard, 1995), o al desconocimiento de las condiciones de maduración y fertilización in vitro apropiadas para el desarrollo del embrión (De los Reyes et al., 1999; Pfeifer et al., 2008). 40 Fertilización de ovocitos y cultivo embrionario La fertilización se realiza una vez que los ovocitos han sido madurados. Los ovocitos maduros se incuban junto con espermatozoides capacitados in vitro (Yanagimachi, 1994). Una vez que los ovocitos han sido fertilizados se procede al cultivo embrionario. Aunque usualmente se han utilizado medios adicionados con suero, se ha demostrado que el suero aumenta el riesgo de introducir patógenos al medio y es uno de los principales factores responsables de la presentación del síndrome de exceso de volumen fetal y de la baja resistencia a la criopreservación de los embriones obtenidos (Farin et al., 2001). Por esta razón se ha buscado substituir el suero en el medio de cultivo por macromoléculas sintéticas, al igual que obtener un medio que semeje a las condiciones naturales dentro del oviducto materno (Herradón et al., 2007). También se han desarrollado medios de cultivo secuenciales, para satisfacer las necesidades nutricionales de los embriones en sus distintas etapas de desarrollo (Lane et al., 2003; Nedambale et al., 2006). Las diferencias en el desarrollo entre ovocitos madurados in vitro e in vivo se expresan en la etapa de mórula-blastocisto, 4 a 5 días posteriores a la fertilización (Blondin et al., 1996; Hyttel et al., 1997). Mientras que alrededor de 85% de los ovocitos madurados y fertilizados in vivo desarrollan a embriones capaces de establecer una gestación, sólo un tercio de los madurados in vitro desarrollan a la etapa de mórulablastocisto, sin importar si son fertilizados in vivo o in vitro (Leibfried-Rutledge et al., 1987; Dominko y First, 1997). Las tasas de producción de blastocistos luego del cultivo in vitro por 6 a 7 días son del 25% al 40% (Farin et al., 2001; Mucci et al., 2006). El cultivo embrionario es el paso más largo dentro del proceso de PIV, presenta el mayor porcentaje de pérdidas (Mucci et al., 2006), y define en gran medida la calidad de los embriones (Enright et al., 2000; Rizos et al., 2002b; Lonergan et al., 2003). A pesar del progreso logrado en los últimos años en la técnica de PIV, el porcentaje de ovocitos capaces de transformarse en embriones transferibles se ha mantenido entre 30% y 40% (Herradón et al., 2007). Clasificación de los embriones Durante su desarrollo, el embrión pasa por cinco etapas (Lehn-Jensen, 1986): 1) Mórula: una masa de células en cuya superficie se distinguen los blastómeros individuales. 2) Mórula compacta: los blastómeros individuales no se distinguen en la superficie del embrión. 3) Blastocisto joven: es visible una cavidad llena de fluido (blastocele), y se empieza a formar la masa interna de células. 4) Blastocisto: el embrión ocupa la mayor parte del espacio dentro de la zona pelúcida, la masa interna de células se diferencia más, pero el diámetro total del embrión no cambia, incluyendo la zona pelúcida. 5) Blastocisto expandido: el diámetro del embrión aumenta y el grosor de la zona pelúcida se reduce a aproximadamente 1/3 del grosor original. De acuerdo con su calidad, el embrión se clasifica en cuatro grados (Stringfellow y Seidel, 1998): 41 1) Excelente o bueno: la masa embrionaria es simétrica y esférica, con blastómeros individuales (células) uniformes en tamaño, color y densidad. Este embrión es consistente con su etapa de desarrollo esperada. Las irregularidades son relativamente menores, y al menos 85% del material celular es una masa embrionaria intacta y viable. La zona pelúcida es lisa y sin superficies cóncavas o planas que puedan causar que el embrión se adhiera a la caja de Petri o a la pajilla. 2) Aceptable: con irregularidades moderadas en la forma general de la masa embrionaria o en el tamaño, color y densidad de las células individuales. Al menos 50% del material celular es una masa embrionaria intacta y viable. 3) Pobre: irregularidades mayores en la forma de la masa embrionaria o en el tamaño, color y densidad de las células individuales. Al menos 25% del material celular es una masa embrionaria intacta y viable. 4) Muerto o en degeneración: los embriones se encuentran en degeneración, los ovocitos o embriones son de una célula y no son viables. Diferencias entre embriones producidos in vitro e in vivo Los embriones producidos in vitro son de menor calidad que los obtenidos in vivo y presentan diferencias con respecto a estos últimos (Holm y Callesen, 1998; Herradón et al., 2007). Estas diferencias son: a) Morfológicas: embriones más oscuros y de menor densidad por su mayor contenido de lípidos en el citoplasma (Massip et al., 1995); menor número de blastómeros, sobre todo a nivel de la masa celular interna (Rizos et al., 2002a); zona pelúcida más frágil (Duby et al., 1997); reducción del espacio perivitelino y mayor velocidad de desarrollo (Thompson et al., 1998). b) Cromosómicas: una elevada proporción de los embriones presentan mixoploidia: células normales y células poliploides (Viuff et al., 2002). c) Funcionales: alteraciones en la comunicación intercelular, con expresión anormal de las proteínas que forman las uniones gap (Boni et al., 1999). d) Metabólicas: mayor contenido en lípidos, mayor concentración de triglicéridos y menor de otros lípidos (Khurana y Niemann, 2000). e) Alteraciones en la expresión génica (Lonergan et al., 2006). f) Mayor incidencia de apoptosis (Pomar et al., 2005). Todo ello determina una reducción en su potencial de desarrollo pre- y postimplantación, ocasionando bajos porcentajes de gestación (30% a 40%), y escasa resistencia a la criopreservación (Camargo et al., 2006; Herradón et al., 2007). Los embriones PIV presentan un incremento de la mortalidad embrionaria, abortos, problemas gestacionales como hidroalantoides y alargamiento de la gestación. Además, se ha reportado el nacimiento de crías muy grandes, con anomalías estructurales y funcionales, que disminuyen su vigor al nacimiento y provocan mayor mortalidad peri-natal (Camargo et al., 2006; Herradón et al., 2007). Algunos estudios indican que más del 30% de los becerros derivados de embriones PIV presentan peso superior a los 50 kg al nacimiento, sin importar su raza (Kruip y den Daas, 1997), lo que resulta en un incremento del porcentaje de distocias por exceso de volumen fetal (Herradón et al., 2007). 42 Desventajas y ventajas de la PIV de embriones bovinos La variabilidad en la tasa de gestación obtenida después de la transferencia de embriones PIV, junto con la elevada inversión necesaria para equipar el laboratorio de FIV, resulta en un alto costo final de operación. Otro factor importante que limita la PIV de embriones es el relacionado con la criopreservación, ya que las tasas de gestación de embriones PIV congelados son menores que las de aquéllos transferidos en fresco. Se ha demostrado que es posible obtener tasas de gestación del 50% para embriones PIV congelados, pero sólo bajo condiciones óptimas y bien controladas, lo que no siempre es posible en hatos comerciales (Thibier, 2005). No obstante, a pesar de sus desventajas, la PIV de embriones tiene un importante potencial para el futuro dentro del campo de la biotecnología, debido a su flexibilidad, a su bajo costo cuando se cuenta con el laboratorio equipado, y a su seguridad sanitaria cuando se usan las condiciones correctas. La PIV de embriones puede contribuir a que los productores alcancen sus objetivos de producción animal sostenible. En la actualidad, los embriones bovinos PIV representan aproximadamente el 15% del total de los producidos a nivel mundial (Mapletoft y Hasler, 2005; Thibier, 2005). En Brasil, más del 40% de los embriones bovinos transferidos en 2004 fueron embriones PIV (Camargo et al., 2006). Transferencia de embriones La transferencia de embriones (TE) es una biotecnología reproductiva que ha sido usada exitosamente para la rápida multiplicación de poblaciones élite de ganado con el fin de facilitar el mejoramiento genético. Su finalidad es aumentar las tasas reproductivas de hembras valiosas, al igual que la inseminación artificial lo hace con los machos, ya que permite obtener mayor número de crías del que se obtendría de manera natural de una hembra; es decir, obtener en promedio 10 a 15 crías por hembra por año. Dado que el bovino presenta bajas tasas reproductivas y largos intervalos generacionales, la TE es particularmente útil en esta especie (Seidel y Seidel, 1991; Mapletoft y Hasler, 2005). La TE comprende el proceso de remover uno o más embriones del tracto reproductivo de una hembra donadora y transferirlos a una o más hembras receptoras. En la actualidad, la transferencia del embrión representa un paso en una serie de procesos que incluyen la ovulación múltiple e inseminación de las donadoras, la colección de embriones, la producción de embriones in vitro (PIV), y la evaluación, congelación y transferencia de embriones (Hasler, 2004). En los últimos 30 años, la transferencia de embriones bovinos a nivel comercial se ha convertido en un importante negocio internacional; a nivel mundial, más de 500,000 embriones son producidos y transferidos anualmente (Hasler, 2003). La TE se ha convertido en la vía principal para movilizar material genético alrededor del mundo (Mapletoft y Hasler, 2005). La primera transferencia exitosa de embriones bovinos se reportó en 1949 (Umbaugh, 1949) y el nacimiento del primer becerro producto de TE ocurrió en 1951 (Willet et al., 1951). La industria de TE en bovinos surgió en Norteamérica a principios de la década de 1970 (Betteridge, 2003), y su gran demanda propició su rápido desarrollo, 43 con lo que se lograron mejoras importantes y se redujo su costo (Seidel y Seidel, 1991). Así, la TE se desarrolló hasta convertirse en una herramienta de mejoramiento genético utilizada a nivel comercial (Hasler, 2006). El total de embriones bovinos transferidos a nivel mundial en el año 2002 fue de 538,312, de los cuales 52% fueron transferidos post-descongelación y 15% fueron PIV. Norteamérica ha sido el centro de la actividad mundial de la TE comercial, con más de 42,000 vacas donadoras sometidas a ovulación múltiple, y más de 190,000 embriones transferidos anualmente (35% de todas las TE en el mundo); sin embargo este país ha reducido esta actividad. Por el contrario, en Sudamérica la TE comercial se está expandiendo, con el 22% del total de transferencias embrionarias realizadas a nivel mundial en el año 2002, mientras que en Europa y Asia se realizaron 17% en cada uno (Thibier, 2003). A pesar de que en los últimos 20 años no ha aumentado el número de embriones producidos por donadora sometida a ovulación múltiple, el mayor conocimiento de la dinámica folicular (Adams, 1994; Bo et al., 1995) y el desarrollo de métodos para sincronizar la emergencia de la oleada folicular (Bo et al., 1995, 2002), han resultado en la producción de más embriones por unidad de tiempo, ya que las donadoras son sometidas a ovulación múltiple con más frecuencia que antes, y se producen más embriones por año. Esto también ha permitido eliminar la detección de estros en las hembras utilizadas como receptoras, lo que ha facilitado el manejo de los programas comerciales de TE (Bo et al., 2002). En 1974 fue fundada la Sociedad Internacional de Transferencia de Embriones (International Embryo Transfer Society, IETS), que tiene como propósito diseminar información básica y aplicada sobre la TE, y establecer estándares para la realización de esta técnica a nivel comercial que aseguren confianza en su uso y manejo de embriones a nivel mundial (Mapletoft y Hasler, 2005). Existen dos formas de producir embriones para transferencia: una es la PIV, ya sea utilizando ovarios obtenidos en rastros o mediante aspiración intravaginal de ovocitos guiada por ultrasonido realizada en hembras vivas, y la otra es la inducción de ovulación múltiple en hembras donadoras seguida por inseminación artificial y lavado uterino para la recolectar de embriones. Selección de donadoras para ovulación múltiple Aunque no hay manera de saber la respuesta que una donadora tendrá al tratamiento de ovulación múltiple o cuántos embriones viables producirá, sí se pueden mejorar las posibilidades de lograr una recolección exitosa. Para esto se prefiere utilizar hembras con 60 a 90 días posparto, buen historial reproductivo, buen plano nutricional, condición corporal moderada, de alto mérito genético y libres de defectos genéticos. El promedio de embriones obtenidos por donadora son seis a ocho, pero pueden obtenerse más o ningún embrión (Callesen et al., 1996). El semen utilizado para la inseminación de las donadoras debe provenir de toros probados, de alto valor genético (Gordon, 2003). 44 Selección de receptoras Las receptoras deben ser seleccionadas por su desempeño reproductivo, facilidad al parto, y buen instinto materno. Deben estar ciclando, con al menos 60 días posparto, buen plano nutricional y buena disposición de la ubre. Se prefieren hembras cruzadas a las de raza pura, por la mayor fecundidad de las primeras, y hembras de tamaño mediano a grande, ya que esto favorece el que puedan parir sin dificultad crías de la raza transferida (Callesen et al, 1996; Leyva et al., 1999). Recolección no quirúrgica de embriones en donadoras inducidas a ovulación múltiple La recolección no quirúrgica de embriones, conocida como lavado, se adoptó a mediados de la década de 1980. Mediante esta técnica, los embriones se recolectan seis a ocho días después del inicio del estro. El primer paso para su recolección es la palpación de los ovarios de la donadora vía rectal para estimar el número de cuerpos lúteos presentes, seguida de la aplicación de anestesia epidural. Se utilizan catéteres Foley calibre 18 a 24 con un globo inflable, así como uno a dos litros de fluido de recolección introducido por gravedad. El lavado puede hacerse en el cuerpo o en los cuernos uterinos, los cuales son llenados con fluido de cuatro a seis veces. El fluido se recolecta en un filtro y se vacía en una caja de Petri para recuperar los embriones usando un estereomicroscopio. Los embriones son transferidos a medio fresco para ser lavados, evaluados y preparados para su transferencia o criopreservación (Seidel y Seidel, 1991; Hasler, 2004). La evaluación de los embriones se basa en su etapa de desarrollo y calidad, según los estándares indicados por la IETS (Stringfellow y Seidel, 1998; Hasler, 2001). Transferencia no quirúrgica de embriones La primera TE no quirúrgica exitosa se hizo en 1964 (Mutter et al., 1964). A inicios de la década de 1980 se desarrollaron y adoptaron técnicas no quirúrgicas (Rowe et al., 1980; Wright, 1981), permitiendo realizarla directamente en los ranchos. La TE se volvió especialmente atractiva para los productores de ganado lechero, por lo que el número de embriones transferidos aumentó de manera significativa a partir de 1980 (Mapletoft y Hasler, 2005). En la actualidad es la técnica más usada en bovinos. Para realizar la TE, primero se palpan los ovarios de la receptora vía rectal para seleccionar el que tiene el cuerpo lúteo y se aplica anestesia epidural. Se carga la pajilla con el embrión en la pistola de transferencia, y ésta se inserta vía vaginal manipulándola a lo largo del cérvix, hasta llegar al cuerno uterino ipsilateral al cuerpo lúteo. El embrión se deposita en la bifurcación de los cuernos uterinos (Seidel y Seidel, 1991). Las tasas de gestación con la TE promedian 70%, pero cuando se transfieren embriones frescos de alta calidad en receptoras adecuadas la tasa de gestación puede aumentar hasta casi 80%. Sin considerar la habilidad de quien realiza la transferencia, los factores que más influyen en la tasa de gestación son la calidad del embrión y la idoneidad de la receptora. Las tasas de gestación son similares cuando se usan como receptoras vacas y novillonas productoras de carne de razas Bos taurus y novillonas lecheras, con tasas más bajas cuando las receptoras son vacas lecheras (Hasler, 1998, 2001). 45 Sincronía de la donadora y receptora La etapa del ciclo estral de la receptora debe corresponder con la de la donadora o con la etapa fisiológica de desarrollo del embrión. para el caso de los embriones PIV (Seidel y Seidel, 1991). Las tasas de gestación son bajas cuando existe asincronía entre la donadora y la receptora (Seidel, 1981, Hasler et al., 1987; Hasler, 2004). La asincronía de ± 24 h aparentemente no reduce las tasas de gestación con embriones de buena calidad; sin embargo, los embriones de menor calidad toleran menos esta asincronía (Hasler et al., 1987; Hasler, 1998). Criopreservación de embriones La criopreservación de embriones es indispensable para los programas de producción y TE en bovinos, ya que evita el tener que contar de manera inmediata con receptoras. Inicialmente se utilizaba glicerol como crioprotector y se requería de un microscopio, de medios específicos para descongelar y de personal capacitado para hacer la descongelación. Al usar etilen glicol como crioprotector en lugar del glicerol, se hizo posible la transferencia de embriones directamente de la pajilla (Voelkel y Hu, 1992; Hasler et al., 1997), sin necesidad de usar microscopio ni medios de descongelación. Cuando se usa etilen glicol, se descongela la pajilla con el embrión en baño maría, y su contenido se deposita directamente en el útero de la receptora, sin que se produzca estrés osmótico al embrión por el crioprotector (Mapletoft y Hasler, 2005). Las tasas de gestación son similares para embriones congelados con glicerol o etilen glicol, por lo que este último es el que se usa predominantemente en la TE comercial. Las tasas de gestación resultantes de la transferencia de embriones congeladosdescongelados son aproximadamente 10% menores que las de embriones frescos de igual calidad (Hasler, 1998, 2004; Leibo y Mapletoft, 1998). Para embriones PIV, la tasa de sobrevivencia post-descongelado es similar para los congelados con etilen glicol o con glicerol (Voelkel y Hu, 1992; Hasler et al., 1997). Durante el año 2002, más de la mitad de los embriones colectados en Norteamérica fueron congelados, la mayoría con etilen glicol para transferencia directa (Thibier, 2003). Bioseguridad Siempre y cuando hayan sido correctamente manejados en el proceso de colección y transferencia, los embriones bovinos producidos in vivo no transmiten enfermedades infecciosas (virales y bacterianas), lo que posibilita su exportación de manera segura (Stringfellow y Seidel, 1998). El manejo correcto incluye asegurarse de que el embrión tenga la zona pelúcida intacta libre de partículas adheridas, y someterlo a varios lavados (Mapletoft y Hasler, 2005). Se ha sugerido que la TE puede usarse para salvar material genético en el caso de un brote de alguna enfermedad (Wrathall et al., 2004), lo que podría resultar una alternativa útil para lograr hatos libres de enfermedades (Mapletoft y Hasler, 2005). Sin embargo, el caso es diferente para embriones PIV (Marquant-Leguienne et al., 2000). La estructura de la zona pelúcida de estos embriones difiere de los producidos in vivo; se ha demostrado que es más probable que ciertos patógenos permanezcan en embriones PIV después del lavado que en embriones producidos in vivo (Stringfellow y Givens, 2000). Esta es un situación potencialmente seria para el comercio 46 internacional de embriones PIV, especialmente si los ovocitos son colectados de ovarios derivados de rastros (Marquant-Leguienne et al., 2000). Ventajas de la TE Las principales ventajas del uso de la TE son (Mapletoft y Hasler, 2005): Menor costo de transportación de embriones comparado con el de animales vivos. Menor riesgo de transmisión de enfermedades. Reducción de costos por cuarentenas. Mayor capacidad de selección de animales de una base genética amplia. Mayor capacidad de conservación de genes de los animales seleccionados en el país que realiza la exportación. Mayor capacidad de adaptación de los animales producidos, particularmente importante en ambientes tropicales y subtropicales, donde el becerro resultante tiene la oportunidad de adaptarse estando en el útero y después al amamantarse de una vaca receptora nativa del área. Desventajas de la TE A pesar de los beneficios potenciales de la TE, aún no se ha logrado diseminar su uso a nivel mundial. En países desarrollados, el costo que implica el aplicar esta técnica es alto. En países en desarrollo, además del costo, limita su uso la falta de instalaciones, infraestructura adecuadas, y personal capacitado y con experiencia para utilizar esquemas de ovulación múltiple y TE o para realizar la transferencia de embriones PIV. Además, la importación del equipo y material requerido aumenta su costo (Rege, 1996; Barros y Nogueira, 2001). REFERENCIAS Adams, G.P. 1994. Control of ovarian follicular wave dynamics in cattle; implications for synchronization and superstimulation. 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