Download Cultivo embrionario in vitro en la especie porcina (II)

García-Vázquez,
F. A.; Matás, C.
Bovino
Cultivo embrionario in vitro
en la especie porcina (II)
Francisco A. García-Vázquez y Carmen Matás
Departamento de Fisiología, Facultad de Veterinaria, Universidad de Murcia
E-mail: fagarcia@um.es, cmatas@um.es. www.um.es/grupo-fisiovet.
kIntroducción
En esta segunda parte completamos
la visión sobre el estado actual del cultivo
embrionario in vitro en la especie porcina, centrándonos en la Dinámica de los
Cultivos embrionarios.
kDinámica del CE
En la dinámica del CE debemos tener en
cuenta diferentes aspectos que pueden influir
en el desarrollo embrionario. En este apartado
vamos a ver algunos de estos factores.
• Medio secuencial: El embrión in vivo
pasa por diferentes estados de desarrollo
con diferentes necesidades metabólicas.
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Por tanto, el cultivo in vitro requiere medios
con los nutrientes adecuados en cada fase
del desarrollo. En la especie humana, Gardner et al., (1996) analizaron la composición
metabólica de los fluidos del oviducto y el
útero a lo largo del ciclo menstrual y observaron que las concentraciones de metabolitos a los que son expuestos in vivo los
ovocitos y los embriones en sus primeros
estadios varían a lo largo del tracto reproductor femenino. Para imitar esta situación
se han desarrollado lo medios secuenciales
los cuales aportan los nutrientes, oligoelementos y hormonas según el estadio de desarrollo embrionario aunque con un coste
elevado. Además, un medio de cultivo bajo
las condiciones en la que se desarrolla un
embrión (por ejemplo temperatura y humedad) durante un largo periodo fácilmente
puede deteriorarse y no soportar el desarrollo embrionario adecuadamente (StewartSavage y Bavister, 1988).
Generalmente el cultivo secuencial se
ha llevado a cabo en dos medios distintos
en los que variará tanto la composición
como la concentración de sus componentes. Ejemplos de medios comerciales
secuenciales en la especie humana son el
medio G1 y G2 (Gardner’s Growth Médium)
(Gardner et al. 1998). El medio G1 está basado en el nivel de carbohidratos presente
en las trompas y aminoácidos esenciales
para la división. También posee EDTA para
secuestrar los cationes divalentes tóxicos
y contrarrestar la actividad glicolítica del
embrión. El medio G2 está basado en el
nivel de carbohidratos en el útero, contie-
Cultivo embrionario in vitro en la especie porcina (II)
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ne aminoácidos esenciales y no esenciales,
pero no contiene EDTA. En bovino Lane et
al., (2003) utilizaron estos medios secuenciales comerciales (G1.2/G2.2) frente a otros
no secuenciales. Los resultados fueron similares en cuanto a la calidad embrionaria, sin
embargo, tras la transferencia de embriones
obtuvieron mayor éxito con embriones que
habían sido cultivados bajo un sistema secuencial. En la especie porcina también se
ha estudiado este medio frente a un medio simple de una única etapa como es el
NCSU23, sin embargo, en esta especie no
se han mejorado los resultados con medio
secuencial (Swain et al. 2001). Este hecho
podría atribuirse a la diferente composición
del medio más que al sistema secuencial ya
que el NSCU23 contiene glucosa, glutamina
y taurina pero no piruvato ni lactato como
es el caso de G1 y G2. No obstante, el uso de
diferentes medios según los requerimientos
del embrión (medio secuencial) parece ser
una metodología prometedora para la mejora del desarrollo embrionario aunque la
composición del medio variará no solo en
función del estadio embrionario sino también en función de la especie.
• Sistema de cultivo dinámico: como
ya se ha mencionado anteriormente, el
uso de un medio estático (sin renovación)
(Figura 4a) puede conllevar al acumulo de
toxinas procedentes del metabolismo del
embrión, como por ejemplo el amonio, y
por otro lado no se renuevan los nutrientes
esenciales. Por lo que se propone un nuevo
sistema donde el medio se renueve constantemente, es el denominado sistema de
cultivo dinámico (Figura 4b). Además, según
Gardner (1999) este sistema provoca un
menor estrés en el embrión, dando lugar a
una mayor viabilidad. El problema de estos
sistemas según algunos autores es no solo
la eliminación de las productos tóxicos sino
también de los factores beneficiosos (factores autocrinos y paracrinos) procedentes del
propio embrión.
Figura 4. a) Esquema del sistema estático de cultivo de embriones donde el medio no es
renovado. b) Sistema dinámico en el cual el medio de cultivo es renovado constantemente.
• Tranquilidad o estrés: En 2002, Leese
propuso la siguiente hipótesis “…la supervivencia de los embriones pre-implantaciones mejora con un bajo metabolismo; una
situación que se lleva a cabo reduciendo la
concentración de nutrientes en el medio de
cultivo…”, por tanto según el autor la consecuencia del cultivo embrionario in vitro
es el aumento de la actividad metabólica
y compromete la capacidad de desarrollo.
Por otro lado, la reducción del metabolismo
mediante agentes específicos incluyendo
bajos niveles de oxígeno y bloqueantes
químicos del metabolismo oxidativo mejora
el desarrollo. Otra observación que apoya
dicha hipótesis, sería que en los ovarios y
en oviducto la temperatura es menor que
en los tejidos adyacentes, lo que conlleva un
descenso del metabolismo.
Sin embargo, esta teoría ha sido cuestionada y otros autores plantean justamente la teoría opuesta ¿estresamos o no al
embrión? La respuesta correcta a esta pregunta debe ser que en general, el estrés especialmente de forma incontrolada y continua causa serios daños y por tanto se debe
evitar. Pero, se ha demostrado que en determinadas situaciones donde un apropiado y
bien aplicado estrés ayuda a los gametos y
embriones a aumentar su tolerancia a otras
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situaciones estresantes incluidas aquellos
procedimientos que ocurren en el laboratorio (revisado por Vajta et al. 2010). Prybenszky et al. (2008) describieron un método donde usaban una determinada presión
hidrostática como pre-tratamiento de
ovocitos madurados in vitro, aumentando
las tasas de división embrionarias y el desarrollo a estadio de blastocisto.
El fenómeno de que un estrés subletal induce una respuesta de mejora hacia
otros tipos de estrés ha sido observado en
todos los niveles de la vida desde bacterias a organismos multicelulares incluidos
los humanos, es el denominado síndrome
general de adaptación o también conocido
como Ley de Selye (1963).
Sin embargo, las investigaciones que
se han realizado parecen confirmar que el
estrés crea una especie de protección, que
bien podría tratarse del desarrollo de un estado de resistencia. Pero, todavía no hay datos suficientes para explicar con detalle que
factores están involucrados en la respuesta
al estrés de los gametos y embriones.
kEvaluación de la calidad
embrionaria
diferentes técnicas y procesos de evaluación embrionaria, pudiéndose clasificar
en método invasivos (Figura 5) y no invasivos. Los métodos invasivos son aquellos
en los cuales el embrión muere al aplicar
la técnica de evaluación, y los no invasivos
aquellos en los que todavía el embrión es
viable. A continuación destacamos algunos
de estos métodos.
kTransferencia de
embriones
Una vez que ya tenemos los embriones, la siguiente pregunta seria ¿Cómo
sabemos que los embriones obtenidos son
de buena o mala calidad? Para ello existen
Finalmente, tras la obtención de los
embriones, se requieren del desarrollo de
sistemas biotecnológicos adecuados que
Figura 5. Blastocisto porcino de 6 días cultivado in vitro y teñido con
Hoescht para la identificación de los núcleos celulares.
• Métodos NO INVASIVOS
Cronología desarrollo
Evaluación morfológica
Pruebas metabólicas (Respirometría)
Formación blastocistos y eclosión
Descendencia tras transferencia
• Métodos INVASIVOS
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Recuento número células
Análisis cromosónico y expresión génica
Tinción diferencial
Microscopía electrónica
Estudio componentes celulares
Cultivo embrionario in vitro en la especie porcina (II)
nos proporcionen una alta eficiencia en
la transferencia embrionaria en estadios
avanzados del desarrollo. En la especie porcina, la transferencia embrionaria ha sido
realizada con éxito mediante procedimientos quirúrgicos durante décadas (Figura 6)
(Hazeleger y Kemp, 1999, Garcia-Vazquez
et al. 2010), por lo que las aplicaciones comerciales han sido en parte limitadas por
este hecho. En los últimos años se han
desarrollado diferentes técnicas para la
transferencia embrionaria mediante endoscopia o por métodos no quirúrgicos
(transcervical) (revisado por Hazeleger y
Kemp, 1999). Este último método permite
la transferencia de embriones sin necesidad de anestesia, ni material quirúrgico
ni personal altamente especializado, aumentando la aplicación de esta técnica a
nivel de campo con una considerable reducción de los costes.
Por tanto, con un desarrollo adecuado
de la producción in vitro de embriones,
incluyendo el cultivo embrionario, y la
transferencia embrionaria podemos aplicar estas biotecnologías en otras áreas
de la biomedicina como la producción
de animales transgénicos por diversas
metodologías como microinyección pronuclear, vectores virales, transgénesis
mediada por espermatozoides… (Gadea y
García-Vázquez, 2010), clonación animal
o la recuperación de animales en peligro de extinción. Además, en un futuro
no muy lejano y cuando los sistemas de
criopreservación embrionaria se encuentren más avanzados, estos embriones se
podrían conservar de manera indefinida,
pudiendo realizar intercambios genéticos
de una manera más sencilla y efectiva.
kProblemática CE porcino
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nº 13
kAgradecimientos
A todos los miembros de Departamento de Fisiología de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Murcia.
kFinanciación
Ministerio de Ciencia e Innovación
(AGL-2009-12512-C02-01) y Fundación Séneca de la Región de Murcia (08752/PI/08).
y conclusiones
kBibliografía
El limitado desarrollo de los embriones
obtenidos in vitro hasta estadío de blastocisto y su menor calidad en comparación
a los obtenidos in vivo, no se debe a un
fallo puntual en el sistema de producción
in vitro de embriones, sino a una combinación de determinados factores como
una inadecuada o incompleta maduración citoplasmática, una inadecuada formulación de los medios de cultivo y unas
condiciones de cultivo subóptimas (revisado por García-Roselló, 2005). Por tanto, se
debe seguir investigando en las diferentes
líneas que conlleva la producción in vitro
embrionaria, con el fin de mejorar los rendimientos finales.
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