Transcript
Localización subcelular y función del receptor GABAB en neuronas hipocampales en cultivo Omar Ramírez†‡, Steffen Härtel† y Andrés Couve†‡. Programa de Fisiología y Biofísica, Facultad de Medicina, ICBM, Universidad de Chile†. CENI‡. Resumen Resultados 5 div 7 div 14 div 21 div 1 20 µm GABABR2 GluR2 Figura 1. Patrón de expresión temporal de los receptores GABAB y AMPA. Neuronas hipocampales de 5, 7, 15 y 21 días in vitro (div) fueron fijadas y se detectó por inmunofluorescencia la subunidad R2 del receptor GABAB y GluR2 del receptor de AMPA mediante microscopía confocal. R2 (rojo) presenta un patrón de distribución somatodendrítico que aumenta en intensidad con el tiempo de cultivo y se va haciendo más punteado. GluR2 está menos concentrado en el soma y se distribuye en la arborización dendrítica, donde también presenta un patrón punteado. El ácido γ-amino butírico (GABA) es el principal neurotransmisor inhibidor del sistema nervioso central. Los receptores metabotrópicos GABAB son responsables de la inhibición sináptica lenta. Están compuestos de las subunidades GABABR1 y GABABR2 que contienen el sitio de unión a GABA y los dominios de interacción con proteína G respectivamente. Se distribuyen ampliamente en neuronas del sistema nervioso central (SNC). Su localización en membranas pre y postsinápticas de neuronas excitadoras está determinada por la presencia de las variantes R1a y R1b en el heterodímero. Este estudio se enfoca en la identificación de los dominios intracelulares de R1 y R2 implicados en el transporte y permanencia de las poblaciones perisinápticas y extrasinápticas de receptores GABAB. Nuestro análisis comienza con la subunidad R2, cuyo extremo carboxilo terminal se prolonga más allá de la región de interacción con R1 y contiene un dominio PDZ. Para determinar aquellos dominios relevantes en la localización diferencial del receptor, hemos introducido receptores R2 mutados o truncos en neuronas hipocampales en cultivo mediante el método de Ca3(PO3)2. Realizamos el análisis de la localización de estos receptores mutados a través de microscopia confocal, midiendo el efecto en la tasa de colocalización con los receptores de AMPA en espinas dendríticas. B 5 um Figura 5. Inmunofluorescencia de R1-myc en células COS-7. R1-myc se expresa en células COS-7 y se localiza en el retículo endoplasmático (abajo, inserto). La coexpresión con R2-GFP (arriba) o HA-R2 (abajo) rescata la localización en membrana plasmática de R1-myc 6 Financiamiento: FONDECYT 1040083, MILENIO ICM-P04-068-F, FONDAP 15010006, MECESUP UCH306. Agradecimientos: A Elvis Acevedo por su asesoría técnica y a Lisette Sandoval por Figura 5 de su tesis de bioquímica. 3 2 A 5 Figura 3. Análisis de la fracción P3 en gradiente de sacarosa. La fracción P3 obtenida a partir de cerebro de rata adulta se separó en un gradiente de sacarosa. El input corresponde al 10% en volumen de un S2 de la fracción cargada. C A 4 5 µm F 0,6 0,5 2 µm 0,4 0,3 * B 0,2 0,1 0 5 div 7 div 14 div 21 div 23 div Figura 2. Procesamiento de imágenes y cálculo de colocalización. Neuronas hipocampales de 7 días in vitro (div) fueron teñidas para los receptores endógenos GluR2 (rojo) y GABABR2 (verde). (A) Las imágenes de los procesos neuronales fueron adquiridas mediante microscopía confocal. (B) Las imágenes en A fueron deconvolucionadas utilizando el programa Huygens Professional. (C) La segmentación de la imagen en B se realizó utilizando el programa IDL* versión 6.1 Win 32. La intersección de las máscaras obtenidas para cada canal (región amarilla en C) corresponde al área donde se realiza el cálculo del coeficiente de correlación de Pearson [r]. (D) El gráfico muestra la variación de r al desplazar circularmente un canal respecto del otro hasta un radio de 5 pixeles. (E) Histograma de frecuencia de los valores der calculados en D, indicando que el coeficiente de Pearson calculado es significativo. (F) Variación de la colocalización de GABABR2 y GluR2 en dendritas de neuronas de distintos días en cultivo, donde se observa que hay un aumento significativo entre 5 y los demás div. n=3, *p<0.01, t-student. 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 HAR2 HAR2-C Densidad de espinas dendríticas Nº Espinas / um de Dendrita Longitud de espinas dendríticas Longitug (um) G Pearson Coeff. [r] D 0,35 0,3 0,25 Figura 6. FRAP de R2-GFP en dendritas. Análisis de los distintos componentes del FRAP según su movilidad (arriba). (A) R2-GFP se expresa en neuronas y presenta una alta movilidad. (B) La fluorescencia de las espinas presentes en la región blanqueada se recupera en niveles menores que la región del tronco dendrítico a los 10 minutos de después del fotoblanqueamiento. 0,2 0,15 Conclusiones 0,1 0,05 0 HAR2 HAR2-C Figura 4. Expresión de receptores GABAB recombinantes en neuronas hipocampales. Neuronas hipocampales en cultivo fueron transfectadas a los 17 div. Se utilizó R2 completa (HAR2) y con el dominio carboxilo intracelular truncado (HAR2-C), ambas marcadas en el extremo amino con un epítope HA. (A) Reconstrucción tridimensional de una región de una dendrita con tinción extracelular para HA. En la reconstrucción se puede visualizar la morfología de las espinas y las diferencias de tamaño entre HAR2 y HAR2-C. (B) Análisis morfométrico de las espinas en neuronas transfectadas. La sobreexpresión de HAR2-C produce un aumento en el largo y en la forma de las espinas, las cuales se asemejan a filopodios. Se contó 45 espinas en 6 dendritas distintas para cada condición, *p<0.05, t-student. El receptor GABAB se distribuye en la región somatodendrítica en neuronas hipocampales y adquiere un patrón punteado similar a GluR2 en neuronas maduras. Hemos desarrollado herramientas para cuantificar la colocalización de proteínas en procesos neuronales, esto nos permitirá estudiar la dinámica de la inserción de receptores en sitios sinápticos. Mediante estudios bioquímicos, hemos demostrado que GluR2 y GABABR2 están en distintos compartimientos intracelulares, esto sugiere que la colocalización calculada es principalmente de membrana. Los receptores recombinantes HAR2 y HAR2-C se expresan en tronco y en espinas dendríticas. La sobreexpresión de receptores HAR2-C induce el alargamiento de espinas dendríticas. R2GFP es altamente móvil en neuronas y muestra una movilidad restringida en espinas respecto del tronco dendrítico.
