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XXXIV Congreso Anual de la Sociedad Española de Ingeniería Biomédica, Valencia, 23, 24 y 25 de Noviembre de 2016
Análisis de Textura Neuronal en modelo murino de la
enfermedad Síndrome de Down
I. Fondón García1, A. Sarmiento Vega1, A.J. Jiménez Contreras1, R.E. López Zaragoza1, B. Galán
Rodríguez2, J.J. Casañas2 y M.L. Montesinos2
1
Departamento de Teoría de la Señal y Comunicaciones, Escuela Superior de Ingenieros, Universidad
de Sevilla, Sevilla, España, {irenef,sarmiento}@us.es
2
Departamento de Fisiología Médica y Biofísica, Universidad de Sevilla, Sevilla,
España,{mlmontesinos, jjcasanas, begaro@us.es}
Resumen
El objetivo de este trabajo es el desarrollo de una nueva
metodología de investigación en el campo de la neurociencia
basada en el procesado de imágenes de inmunofluorescencia de
secciones de tejidos, donde las neuronas se pueden visualizar
tal y como están distribuidas en la realidad, mediante
parámetros de textura. Para la validación de esta metodología
se ha utilizado un modelo de enfermedad de Síndrome de Down
(SD) en sujetos murinos, donde existe una alteración en la
morfología neuronal apreciable en neuronas en cultivos. Se han
evaluado el uso de descriptores de textura clásicos, dispersos y
patrones locales binarios para la clasificación automática de
imágenes de la región CA1 del hipocampo en los tipos control y
SD. Los resultados obtenidos, de hasta un 95% de aciertos,
verifican que la caracterización mediante textura es relevante a
la hora de cuantificar alteraciones morfológicas dendríticas
estudiadas de forma global.
1.
Introducción
Las
enfermedades
neurológicas
cognitivas
y
neurodegenerativas que afectan, entre otras, a la
capacidad de aprendizaje y/o memoria, conllevan una
alteración morfológica neuronal. La cuantificación de
dicha alteración y su evolución proporciona información
muy útil para los científicos. Actualmente, el uso de
técnicas de procesado automático con este fin está muy
limitado, centrándose en el análisis de imágenes de
inmunofluorescencia de neuronas en cultivos aisladas.
aisladas en cultivo pertenecientes a ratones Ts1Cje, un
modelo de SD, y ratones control o Wild Type (WT) libres
de la enfermedad neurodegenerativa [2-4].
En lugar de realizar el estudio del patrón dendrítico de
neuronas aisladas, en este trabajo se estudia el patrón
dendrítico de forma global mediante el análisis de
imágenes de inmunofluorescencia de secciones
histológicas de tejidos del cerebro, véase la Figura 1, en
las cuales se visualizan todas las neuronas tal y como
están distribuidas en la realidad. Nos hemos centrado en
el estudio de la región CA1, por ser una región
fundamental que está implicada en todas las formas de
memoria.
Una vez comprobada la diferencia morfológica existente
en neuronas aisladas en cultivo, el siguiente paso consiste
en comprobar si esa misma diferencia morfológica es
apreciable en secciones de tejidos neuronales. En el caso
particular de la región CA1 del hipocampo la diferencia
de apariencia entre imágenes de inmunofluorescencia de
sujetos WT y SD no es tan clara ni apreciable a simple
vista, por lo que se hace necesario estudiar diferentes
parámetros objetivos capaces de, automáticamente,
discernir entre dos tipos de hipocampo, SD y WT.
En este trabajo hemos considerado que los descriptores
más adecuados para capturar las características más
relevantes de estas imágenes son los descriptores de
textura.
Una de las enfermedades cognitivas y neurodegenerativas
que despierta más interés en el ámbito científico es el
Síndrome de Down (SD). El SD se debe a la trisomía del
cromosoma humano 21, y es la causa más frecuente de
discapacidad intelectual de origen genético.
El uso de cultivos neuronales está muy extendido en el
ámbito científico, si bien no deja de ser una aproximación
experimental del modelo real. A pesar de ello, en el
estudio del SD, estas técnicas han proporcionado
información muy útil sobre la morfogénesis de las
neuronas del hipocampo de modelos murinos. Como
ejemplo, el grupo científico liderado por la Dra.
Montesinos, directora del Laboratorio de Traducción
Local Sináptica (TTLS) de la Universidad de Sevilla, ha
detectado, usando el Análisis de Sholl [1], diferencias
morfológicas en la arborización dendrítica entre neuronas
ISBN: 978-84-9048-531-6
Figura 1. Imagen tomada con microscopio confocal de una
sección coronal de la región de hipocampo murino y sus zonas
representativas.
La selección de la textura como característica
diferenciadora se debe a su capacidad para proporcionar
medidas de propiedades tales como la suavidad,
rugosidad y regularidad de una imagen [5]. Este enfoque
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es totalmente novedoso en el estudio de la morfología
dendrítica, como evidencia la escasa existencia de
literatura al respecto. Hasta nuestro conocimiento, el
único trabajo en el que se analiza de forma global
secciones histológicas de tejido se encuentra en [6]. Sin
embargo, en ese artículo se estudia únicamente
características de orientación y anisotropía mediante
análisis de estructura tensorial, obteniéndose las mismas
características que se obtienen con el análisis de imágenes
con tensor de difusión. Por el contrario, nuestra trabajo
analiza por primera vez en la literatura diferentes
descriptores de textura, con el objetivo de obtener nuevos
protocolos que permitan la cuantificación objetiva de la
morfología global neuronal.
2.
Materiales y métodos
A continuación, se describen las diferentes etapas del
método propuesto, cuyo diagrama de bloques se ilustra en
la Figura 2. En un primer lugar, se describirá la obtención
y selección de las imágenes de hipocampo. A
continuación, se describirán las técnicas de pre-procesado
implementadas, finalizando con la descripción de los
diferentes descriptores de texturas empleados. El software
Pre-procesado
Eliminación
de artefactos
Corrección
iluminación y
contraste
Extracción de
características
Método 1.
Clásicos y
dispersos
Clasificación
Salidas
convertida a escala de grises, como muestra la Figura 3. A
continuación se seleccionó de forma manual la región de
interés (ROI) constituida por la región CA1 del
hipocampo Finalmente, se rotó la selección con el
objetivo de visualizar el área CA1 horizontalmente.
2.2. Pre-procesado
Debido a las diferencias de iluminación y contraste, así
como a la existencia de artefactos no deseados, se realizó
un procesado previo de las imágenes En primer lugar se
aplicó el algoritmo de Fast Image Inpainting (FII) [7] para
eliminar los artefactos producidos por los vasos
sanguíneos de mayor tamaño que podían afectar al
resultado final. Estos vasos sanguíneos aparecen como
áreas circulares o elipsoides de color gris oscuro, no
siendo una característica diferenciadora entre las clases
SD y WT. Este algoritmo, a partir de una imagen y una
máscara de puntos no deseados, realiza una interpolación
de los valores que tendría la imagen en esos puntos a
partir del resto de la imagen.
A continuación con el objetivo de igualar la intensidad y
mejorar el contraste de las imágenes se realizó una
ecualización adaptativa del histograma con limitación de
contraste, conocida por sus siglas en inglés, CLAHE [8].
Un ejemplo de las distintas etapas del pre-procesado de
una de las imágenes estudiadas se muestra en la Figura 4.
SD
Clasificador
Método 2.
LBP
WT
empleado para la programación del algoritmo ha sido
MATLAB® R2015a.
Figura 3. Imagen del hipocampo en escala de grises. La
selección de la región de interés CA1 se muestra
recuadrada en verde.
Figura 2. Diagrama de bloques del método propuesto.
2.1. Obtención y selección de imágenes
La captación de las imágenes se realizó en el Centro de
Investigación, Tecnología e Innovación de la Universidad
de Sevilla (CITIUS). Se utilizó un microscopio confocal
espectral de barrido láser ZEISS LSM 7 DUO. Las
preparaciones se sometieron a marcaje de las estructuras
somatodendríticas neuronales utilizando anticuerpos
específicos contra la proteína MAP2. A cada preparación
se le tomó una pila de imágenes compuesta por doce
planos focales. Posteriormente se seleccionó el plano
focal que tenía el mejor contraste y nitidez en la región de
interés, y el resto de planos se descartaron del estudio
para evitar tener datos correlados en las imágenes
estudiadas.
La base de imágenes obtenida estaba finalmente formada
por nueve imágenes (una de ellas de sección coronal),
conteniendo un total de diez muestras de hipocampos:
cinco de ellas pertenecientes a la clase SD, y otras cinco a
la clase WT. Cada imagen de hipocampo inicial fue
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(a)
(b)
(c)
Figura 4. (a) Región de interés original. Los vasos sanguíneos
de mayor tamaño están remarcados en amarillo. (b) Imagen
obtenida después de aplicar el algoritmo de Fast Image
Inpainting. (c) Imagen obtenida tras aplicar el algoritmo
CLAHE para la mejora del contraste.
Debido al escaso número de imágenes de las que se
disponía y empleando la metodología seguida
ampliamente en la literatura acerca de la caracterización
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de imágenes mediante textura, se procedió a dividir cada
región CA1 de interés en dieciséis bloques cuadrados de
50 píxeles no solapados, obteniéndose un total de 16
bloque por cada una de las imágenes seleccionadas. En
total la base de imágenes está compuesta por 80 imágenes
SD y 80 WT.
2.3. Extracción de características
En este trabajo se han evaluado dos grupos de
descriptores de textura: descriptores de textura clásicos en
combinación con otros descriptores más recientes que
explotan la característica “sparse” o dispersa de la textura
(método 1), y descriptores de textura patrones locales
binarios (LBP) (método 2).
La técnica de evaluación de la calidad para todos
clasificadores probados es una validación externa.
seleccionaron para cada tipo de imágenes, SD y WT,
bloques para la etapa de entrenamiento de
clasificadores y 32 bloques para la etapa de testeo.
3.
Clasificador
Como primer estudio, se decidió evaluar la eficacia de
descriptores texturales clásicos y descriptores dispersos
debido a su robustez y contrastado funcionamiento en la
clasificación de imágenes. El vector de características
resultante estaba formado por:
• Descriptores estadísticos: media,
desviación
estándar, coeficiente de asimetría o skewness,
kurtosis y entropía.
•
La particularización de la dimensión
denominada dimensión de Hausdorff [9].
fractal
Descriptores de texturas de Haralick [10] a partir de
la matriz de co-ocurrencia.
• Media y varianza del vector textura dispersa,
descrito en [11-12] usando cinco componentes.
Método 2. Descriptores LBP
En este método se incluyeron los códigos LBP [13],
debido a su baja complejidad computacional y su alto
poder de discriminación. De todas las variantes LBP
existentes, se seleccionó un código circular e invariante a
la rotación, con vecindad de ocho píxeles y radio igual a
uno. Por cada bloque se obtuvieron treinta y seis códigos
LBP. El vector de características estaba formado por el
histograma de estos treinta y seis códigos.
2.4. Entrenamiento y clasificación
Para evaluar la capacidad descriptora de las características
obtenidas, se entrenaron y validaron cinco clasificadores
distintos, evaluándose los métodos 1 y 2 por separado.
Los clasificadores empleados han sido:
•
•
Support Vector Machine (SVM) [14]. en sus
versiones de kernel lineal, cuadrática, cúbica y
Gaussiana.
K-Nearest Neighbour (KNN) [15] en sus versiones
de distancia minina de coseno y cúbica.
•
Complex Tree (un solo árbol de decisión).
•
Bagged Tree [16].
•
Random Forests [17].
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Resultados
La métrica utilizada para valorar los métodos
desarrollados es el porcentaje de aciertos. Los resultados
de clasificación obtenidos se muestran en la Tabla 1.
Método 1. Descriptores clásicos y dispersos
•
los
Se
48
los
Método 1
Método 2
SVM (kernel lineal)
96.88%
92.18%
SVM (kernel
cuadrático)
SVM (kernel cúbico)
93.75%
90.62%
93.75%
89.06%
SVM (kernel
gaussiano)
k-NN (distancia
mínima coseno)
k-NN (distancia
mínima cúbica)
Complex Tree
92.19%
90.62%
75.00%
95.62%
78.13%
90.62%
76.56%
76.56%
Bagged Tree
85.94%
95.31%
Random Forests
89.06%
93.75%
Tabla 1. Porcentaje de aciertos. Se ha destacado para cada
método, el clasificador con el que mejor resultado se ha
obtenido.
De todas las posibles combinaciones, el mejor resultado,
un 96.88%, se obtiene con el método 1 (descriptores de
textura clásicos y dispersos) y usando SVM en su versión
de kernel lineal. En el caso del método 2, que usa los
descriptores de textura LBP, el resultado es ligeramente
inferior, 95.62%, aunque sigue siendo un porcentaje de
acierto muy alto.
4.
Discusión
El principal objetivo de este trabajo de investigación es
verificar el uso de descriptores de texura para discernir
diferencias morfológicas neuronales de forma global en
secciones de tejido cerebral entre modelos murinos de
Sindrome de Down y sujetos murinos control. Para ello,
se ha realizado un experimento en el que se clasifica una
imagen de la region de interés en SD o WT dependiento
únicamente de descriptores de textura utilizando varias
técnicas recientes de aprendizaje de máquinas. Se han
utilizado dos conjuntos de descriptores de textura
diferentes, obteniendose unos porcentajes de aciertos muy
altos en ambos métodos estudiados.
De los resultados obtenidos se infiere que efectivamente
la textura de la región CA1 del hipocampo de ratones SD
se encuentra alterada respecto a la textura de la misma
región en sujetos control. Esta alteración era previsible
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debido a las diferencias morfológicas dendríticas
apreciadas en neuronas aisladas en cultivo en estudios
previos realizados en el Laboratorio de Traducción Local
Sináptica de la Univerisdad de Sevilla. Sin embargo, el
hecho de haber sido capaz de identificar el tipo de ratón al
que pertenece una determinada imagen en función
únicamente de la textura de forma completamente
automática, abre un nuevo paradigma de investigación
que puede ser utilizado en el estudio de un gran número
de enfermedades cognitivas y neurodegenerativas.
Referencias
[1]
D.A.Sholl, Dendritic organization in the neurons of the
visual and motor cortices of the cat, Journal of Anatomy
vol. 87, nº 4, pp. 387-406, 1953.
[2]
J.A. Troca-Marín, A. Alves-Sampaio, M.L. Montesinos,
Deregulated mTOR-mediated translation in intellectual
disability, Prog. Neurobiol. Vol 96 pp. 268-282, 2012
[3]
M.L. Montesinos, Roles for DSCAM and DSCAML1 in
central nervous system development and disease, In Cell
Adhesión Molecules: Implications in Neurological
Diseases, Advances in Neurobiology, Springer 2014.
En este trabajo de investigación se ha propuesto una
nueva metodología en la investigación de enfermedades
neurodegenerativas, a través del estudio de estructuras
dendríticas en tejidos completos y no de neuronas
aisladas, basada únicamente en características de textura
de la región de interés usando imágenes de
inmunofluoresencia.
[4]
J.A. Troca-Marín, J.J. Casañas, I. Benito, M.L.
Montesinos, The Akt-mTOR pathway in Down's
syndrome: the potential use of rapamycin/rapalogs for
treating cognitive deficits, CNS Neurol Disord Drug
Targets vol. 13, pp. 34-40, 2014.
[5]
R. González and R. E. Woods, Digital Image Processing,
3ª edition, Prentice Hall, Nueva Jersey (EE.UU.), 2008.
El método desarrollado consta de una etapa de preprocesado de las imágenes de la región CA1, en la cuál se
eliminan los artefactos existentes en las imágenes debido
a la presencia de vasos sanguíneos; y a continuación se
realiza una igualación de intensidad y mejora del
contraste. Tras el pre-procesado de las imágenes se
procede a la extracción de características de textura. Se
han evaluado dos conjuntos de descriptores diferentes: un
primer conjunto de descriptores de textura clásicos y
descriptores que explotan la característica dispersa de los
datos; y un segundo conjunto de descriptores de códigos
de patrones locales binarios. A continuación se ha
procedido a la clasificación automática de las imágenes
en las clases SD y WT usando diferentes técnicas de
aprendizaje de máquinas.
[6]
M. D. Budde and J. A. Frank, Examining brain
microstructure using structure tensor analysis of
histological sections, NeuroImage vol. 63, n11, pp. 1–10,
October, 2012.
[7]
F. Bornemann and T. März: Fast Image Inpainting Based
on Coherence Transport. Springer Science+Business
Media, 2007.
Contrast-limited
adaptive
histogram
equalization
(CLAHE). At MathWorks. Last query: 14 de Julio de
2015.
Available
link
at:
http://es.mathworks.com/help/images/ref/adapthisteq.html
5.
Conclusión
La base de imágenes utilizada en los experimentos, se ha
construido mediante la división de regiones completas
CA1 en trozos más pequeños, obteniéndose en total 80
imágenes de tipo SD y 80 de tipo WT.
Mediante el método de validación externa, se han
obtenido porcentajes de acierto de más del 95% de los
casos en los dos conjuntos de descriptores analizados,
siendo los clasificadores de tipo SVM en su versión
kernel-lineal y K-NN con distancia mínima coseno, los
clasificadores con mejores rendimientos para cada
conjunto de descriptores respectivamente.
En el futuro sería deseable contar con una base de
imágenes de mayor tamaño de forma que se estudie la
región CA1 completa, en lugar de analizar trozos más
pequeños de la misma.
Agradecimientos
Este trabajo ha sido financiado por el proyecto de la Junta
de Andalucía P11-TIC-7727 y por la Escuela Superior de
Ingenieros de la Universidad de Sevilla.
[8]
[9]
A. F. Costa, G. Humpire-Mamani, A. J. M. Traina: An
Efficient Algorithm for Fractal Analysis of Textures.
Brazil, 2012.
[10] R. M. Haralick, K. Shanmugam, I. Dinstein:Textural
Features for Image Clasification. IEEE Transactions on
systems, man and cybernetics, 1973.
[11] A. Sarmiento, I. Fondón, M. Velasco, A. Qasair, P.
Aguilera: Gaussian mixture model generalized for
segmentation of melanomas. Annual congress of the
Spanish Society of Biomedical Engineering (CASEIB),
2014.
[12] C. Scharfenberger: Statistical Textural Distinctiveness for
Salient Region Detection in Natural Images. IEEE
Conference on Computer Vision and Pattern Recognition
(CVPR), 2013.
[13] Multiresolution Gray-scale and Rotation Invariant Texture
Classification with Local Binary Patterns. Ojala, T.,
Pietikäinen, M. and Mäenpää, T. (2002). IEEE Trans.
Pattern Analysis and Machine Intelligence 24(7): 971-98.
[14] C. Cortes, V. Vapnik: Support-Vector Networks. AT&T
Bell Labs (USA), 1995.
[15] N. S. Altman: An introduction to kernel and nearestneighbor nonparametric regression. The American
Statistician 46(3): 175–185, 1992.
[16] L. Breiman: Bagging predictors. Technical Report No.
421. Department of Statistics, University of California,
1994.
[17] L. Breiman: Random Forests. University of California,
2001.
ISBN: 978-84-9048-531-6
16