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XVIII Congreso Nacional de Ingeniería Bioquímica
XVIII National Congress of Biochemical Engineering
VII Congreso Internacional de Ingeniería Bioquímica
VII International Congress of Biochemical Engineering
X Jornadas Científicas de Biomedicina y Biotecnología Molecular
X Biomedicine and Molecular Biotechnology Meeting
Clave: TAM177MAR2012012
ESTUDIO DE LA REDUCCIÓN
REDUCCIÓN DE MERCURIO ((Hg2+) POR
Pseudomonas sp.
Evelia Marlen, Hernández González; María Isabel, Neria González;
Josefina, Pérez Vargas; Juan Carlos, Cancino Díaz; Ricardo Aguilar
López.
DIRECCIÓN DE LOS AUTORES
1
División de Ingeniería Química y Bioquímica, Tecnológico de Estudios Superiores de
3
Ecatepec. 2Depto. de Microbiología, ENCB-IPN,
ENCB
Depto. de Biotecnología y Bioingeniería,
CINVESTAV-IPN.
CORREO ELECTRÓNICO
Ibineria@hotmail.com
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INTRODUCCIÓN
El mercurio entra al ambiente por la
actividad volcánica y geotérmica, y por la
liberación de minerales de las rocas
producida por la erosión del viento y
agua. Esta liberación natural del mercurio
mantiene un nivel de su concentración
constante en el ambiente, pero la
actividad antropogénica es la principal
causa del incremento de la concentración
ambiental, un ejemplo es la carga total de
mercurio atmosférico, la cual se ha
multiplicado por un factor entre 2 y 5
desde el comienzo de la era industrial. La
elevada concentración del mercurio, y en
general de los metales pesados, ha
generado problemas de contaminación
ambiental afectando a los seres vivos
(Cañizares, 2000), debido a la alta
capacidad de acumularse en la estructura
celular. Estos contaminantes han sido
descargado al ambiente alcanzando
concentraciones por encima de los
permisibles (<0.005 ppm) en aguas y
suelos (NOM-001-SEMARNAT 1996).
Por otra parte, la presencia de los metales
pesados en general, producen una
selección de genotipos sobre los
microorganismos que habitan un sitio
contaminado, lo que se expresa como un
mecanismo de resistencia (Voullo, 2003).
Diversos estudios han demostrado que la
interacción metal-microbiota es utilizada
con fines ambientales para implementar
métodos de remoción, detoxificación o
recuperación de metales pesados. Uno de
los mecanismos que más participa en la
resistencia es el llamado inmovilización,
donde
los
organismos
poseen
mecanismos de detoxificación, que son
codificados genéticamente, e inducidos
por la presencia del metal (Moraga et al.,
2003). Un ejemplo de estos mecanismos
genéticos es el operón mer, que es un
conjunto de genes que se inducen en
presencia del mercurio, al encontrarse en
el genoma de una bacteria le confiere
resistencia al metal y le concede la
capacidad de reducir el Hg2+ al estado
elemental (Hg0), a una transformación
menos tóxica, por la acción de la enzima
mercurio-reductasa, que es codificada por
el gen merA (Nascimento et al., 2003).
OBJETIVOS
En el presente trabajo se estudia genética
y fenotípicamente la reducción del Hg2+ a
Hg0 de una cepa de Pseudomonas sp. con
una alta capacidad de resistencia metálica.
MATERIALES Y MÉTODOS
La cepa que se usa en este trabajo fue
aislada de una muestra de lodos
residuales proveniente de la planta de
aguas residuales de Ciudad Universitaria
(UNAM, México D.F). El medio de
selección utilizado, las características
físicas y algunas pruebas bioquímicas
indican que pertenece al género
Pseudomonas. La cepa presenta una alta
resistencia a Cd (400 ppm), Zn (300
ppm), Pb (200 ppm) y Hg (60 ppm).
Análisis Fenotípico de la reducción de
Hg2+.
Una serie de cultivos en 5 ml de medio
Luria-Bertani (LB) fueron realizados a
diferentes concentraciones de Hg2+ (0-120
ppm), para determinar la concentración
mínima inhibitoria (CMI). Una solución
de 1.5 % de HgCl2 fue preparada y
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esterilizada por filtración para el estudio.
El ensayo de volatilización del Hg0 se
determinó cualitativamente por el método
de tinción en placa de rayos X reportado
por Nakamura3. Este método se escaló
100 veces, debido a la resistencia del
metal de la bacteria. Para el ensayo se
cosecharon por centrifugación 5 ml de las
células de un cultivo de toda la noche, las
células fueron resuspendidas en 5 ml de
regulador de fosfatos (0.07M, pH 7)
suplementado con 0.5 mM de EDTA, 0.2
Mm de Acetato de Magnesio, 5 mM de
Tioglicolato de Sodio y 50 ppm de HgCl2
En el tapón rosca del tubo se coloco la
placa de rayos X y se procedió a tapar el
tubo que contiene la suspensión celular y
el regulador, como control se tomó el
regulador más Hg2+ sin células, los tubos
fueron incubados por 24 h a 35 °C.
Amplificación del gen merA.
El DNA genómico de la cepa fue extraído
por un método estándar, utilizando un
choque térmico como mecanismo de lisis
celular, seguido de extracciones de fenol
cloroformo para la eliminación de
proteínas, el DNA fue precipitado con
etanol absoluto y lavado con etanol al
70%. El extracto de DNA genómico fue
usado para la detección de gen merA. La
amplificación del gen se realizó vía PCR
usando iniciadores degenerados A1-sf 5’
TCC GCA AGT NGC VAC BGT NGG
3’, A2n-f 5’CCA TCG GCG GCW SYT
GCG TSA A 3’ y el iniciador reverso
A5n-R 5´ ACC ATC GTC AGR TAR
GGR AAVA 3’ (Vetriani et al., 2005),
los cuales al combinarse dan dos
productos de diferentes tamaños. Cuando
se combinan A1-sf y A5n-R da un
amplicón de 288 pb, y cuando se usa el
A2n-f y A5n-R se obtiene un producto
largo de 1200 pb. Ambos productos se
obtienen con una temperatura de
alineamiento de 60 ºC por 30 ciclos. La
reacción se realizó en un termociclador
(MULTIGENE, Labnet). Los amplicones
fueron evaluados por electroforesis en gel
de agarosa al 1%.
Crecimiento bacteriano y reducción del
Hg2+.
La reducción del metal fue seguida
mediante un cultivo de la cepa en 800 ml
de medio LB, suplementado con 5 y 20
ppm de Hg2+, un cultivo sin metal fue el
control. Los cultivos de la cepa fueron
incubados a 37 ºC. El crecimiento
bacteriano fue seguido por D.O600 y peso
seco cada hora hasta alcanzar la fase
estacionaria.
Espectroscopia de Absorción Atómica
(EEA):
La presencia del metal en el cultivo se
realizó por espectroscopia de absorción
atómica. Una alícuota de 2 ml de medio
fueron digeridos con 1 ml de solución
digestora (HNO3, HClO4, 5:2) por 24
horas.
Las
muestras
previamente
digeridas fueron analizadas en el equipo
de absorción atómica (VARIAN).
DESARROLLO
La capacidad de resistencia y de
reducción de mercurio (II) por
Pseudomonas sp. fue analizada por
métodos físicos. La presencia del gen
merA se determinó por PCR punto final.
Mientras que, la actividad de la enzima
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mercurio-reductasa
reductasa se evaluó de manera
indirecta siguiendo la pérdida de mercurio
en un cultivo bacteriano en presencia de
metal.
RESULTADOS
La capacidad de resistencia al mercurio
(II) de la bacteria es alta, debido a que fue
capaz de crecer hasta 100 ppm,
p
los
resultados se presentan en la tabla 1.
Tabla I: Crecimiento de Pseudomonas sp. en
presencia de Hg2+.
Hg+2 (ppm)
5
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
Cepa resistente
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
+++
++
-
Crecimiento: abundante +++, moderado ++, nulo –
El ensayo de reducción dell Hg2+ a Hg0 dio
positivo cuando la células están presentes
en el regulador y no así en el testigo
(regulador-mercurio), en el caso del
cultivo en presencia del metal se observo
una respuesta menor, probablemente a
que la velocidad de volatilización del
mercurio es lenta,, como lo reporta
Nakamura3, ver figura 1.
Regulador
y Hg2+
Regulador
Cultivo con
y Biomasa
Hg2+
Figura 1: Ensayo de volatilización de Hg0. En la
imagen se muestra la tinción en la placa de rayos
X de la volatilización del mercurio reducido por la
acción bacteriana. En el caso del
de cultivo con
mercurio existe volatilización
ación aunque en menor
cantidad.
El análisis molecular indica la presencia
del gen merA (Figura 22), por lo que el gen
se expresa en presencia del mercurio y la
enzima mercurio-reductasa
reductasa se produce.
Marcador de peso
molecular 1 kb
1200 pb
288 pb
Figura 2. Amplificación del gen merA por PCR.
La imagen muestra dos amplicones, un fragmento
largo de 1200 pb y un fragmento corto de 288 pb.
Este hecho corresponde por lo observado
en el ensayo de volatilización, ya que sólo
el Hg0 es capaz de reaccionar con la plata
contenida en la película de ra
rayos X,
produciéndose una emulsión de Hg
Hg-Ag
que se presenta como un obscurecimiento
de la película, ver figura 1.
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Curva de crecimiento bacteriano en
presencia de mercurio
En base a los resultados obtenidos se
decidió, evaluar el crecimiento de la
bacteria bajo diferentes concentraciones
de mercurio, donde se observó que a
mayores concentraciones (20 ppm) hay
un periodo de inducción muy largo (+6
horas), y a concentraciones menores de 5
ppm, el efecto es casi nulo y la fase
estacionaria se alcanza alrededor de 12
horas, ver figura 3.
tiempo de muestro fue digerida con 1 ml
de solución digestora (HNO3, HClO4, 5:2)
por 24 horas. De las soluciones obtenidas
se cuantificó el mercurio residual por
espectroscopia de absorción atómica. Con
las lecturas obtenidas de cada tiempo, se
realizó el balance de materia para
determinar el mercurio volatilizado, y los
datos fueron graficados, ver figura 4. Por
lo que se obtuvo un 60% de reducción de
mercurio para 5 ppm, mientras que para
20 ppm de mercurio se reduce el 75%.
16
0.8
14
12
10
0
Absorbancia (600 nm)
0.6
Concentracion de Hg (ppm)
0.7
0.5
0.4
Control
2+
5 ppm Hg
2+
20 ppm Hg
2+
40 ppm Hg
0.3
0.2
0.1
0.0
8
6
4
2
0
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
-2
0
2
Tiempo (h)
4
6
8
10
12
Tiempo (h)
Figura 3: Curva de crecimiento de
Pseudomonas sp. a diferentes concentraciones
de metal. La cepa fue cultivada en caldo L-B
suplementado con 5, 20 y 40 ppm de mercurio, los
cultivos se incubaron a 37 ºC.
Figura 4: Curva de Hg○ volatilizado. (●)
Mercurio volatilizado para 20 ppm, (■) Mercurio
volatilizado para 5 ppm.
Seguimiento de la reducción
mercurio en un cultivo por lote.
La cepa de Pseudomonas sp. contienen en
su genoma genes que le confieren la
capacidad de reducir el mercurio (II), por
lo que se considera una bacteria con un
alto potencial biotecnológico para la
detección y reducción del mercurio a
formas menos tóxicas.
de
De acuerdo al resultado del ensayo de
volatilización del mercurio, se determinó
la cantidad de mercurio reducido de los
cultivos
anteriores
para
las
concentraciones 5 y 20 ppm. Una alícuota
de 2ml de medio de cultivo de cada
CONCLUSIONES
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Rev
Lat
biomasa
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Microbiol, 42:131-143
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en bacterias aisladas de la bahía de
Iquique. Investigaciones marinas,
Redalyc, 31:001, 91-95
3. Nakamura K., Nakahara H. (1988):
Simplified X-ray film method for
detection of bacterial volatilization of
mercury chloride by Escherichia coli,
Appl. Environ. Microbiol, 54, 28712873
4. Nascimento A.M.A., Souza, E.C.
(2003): Operon mer: Bacterial
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environments. Genet. Mo. Res., 2:1,
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5. NOM-001-SEMARNAT 1996. Norma
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aguas residuales en aguas y bienes
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6. Vetriani C., Chew Y. S., Miller S. M.,
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from
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deep-sea
hydrothermal vent, Appl. Environ.
Microbiol., 71, 220–226
7. Voullo, D. (2003): Microorganismos y
metales pesados: una interacción en
beneficio del medio ambiente. Química
viva, 2:93-94
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