Download Biosíntesis in vitro de oligofructanos: inulinas y neoinulinas por

Gayana Bot. 69(Número Especial):
66-74, 2012
Especial), 2012
ISSN 0016-5301
Biosíntesis in vitro de oligofructanos: inulinas y neoinulinas por
fructosiltransferasas de Agave tequilana Weber var. azul y A.
inaequidens subsp. inaequidens Koch
Biosynthesis in vitro of oligofructans: inulin and neoinulins by fructosyltransferase of
Agave tequilana Weber var. azul & A. inaequidens subsp. inaequidens Koch
LUZ ADRIANA VIZCAÍNO-RODRÍGUEZ1, MARTHA ALICIA RODRÍGUEZ-MENDIOLA2*, NORMA ALEJANDRA
MANCILLA-MARGALLI4, MARTÍN EDUARDO ÁVILA-MIRANDA3, JUAN ALBERTO OSUNA-CASTRO5 & CARLOS
ARIAS-CASTRO1
Laboratorios de Análisis Instrumental Bioquímico, 2Biotecnología Vegetal, 3Fitopatología Molecular y 4Bioquímica Vegetal.
DEPI del Instituto Tecnológico de Tlajomulco, Jalisco. Km 10 Carretera a San Miguel Cuyutlán, Tlajomulco de Zuñiga, CP
45640. Jalisco, México.
5
Laboratorio de Biotecnología Vegetal, Facultad de Ciencias Biológicas y Agropecuarias, Universidad de Colima. Km 40
autopista Colima-Manzanillo, Tecomán, Colima. México.
*martharodz@gmail.com
1
RESUMEN
El objetivo del trabajo fue establecer la ruta de biosíntesis presente en las células de cultivos en suspensión de Agave
tequilana Weber var. azul y Agave inaequidens, mediante la identificación de los fructanos sintetizados in vitro a partir
de las enzimas con actividad fructosiltransferasa obtenidas de los cultivos. La extracción de las enzimas se realizó
en células de 15 días de edad, los extractos obtenidos se purificaron utilizando sulfato de amonio y cromatografía de
intercambio iónico, en tanto que el peso molecular de las enzimas se determinó mediante SDS-PAGE. La actividad
enzimática fue determinada por incubación individual de las enzimas con sacarosa, 1-kestosa y 1,1-kestotetraosa, 100
mM cada una, a pH 5,5 y 30 ºC. Los carbohidratos sintetizados in vitro fueron identificados con cromatografía en
capa fina (TLC), empleando varios estándares de inulinas como referencia. Los resultados obtenidos mostraron que las
enzimas de A. inaequidens sintetizaron inulinas y neoinulinas, con grado de polimerización (GP) 3 y 4, en tanto que
las de A. tequilana principalmente la inulina: 1-kestosa. Estos resultados son relevantes porque es el primer reporte que
demuestra que los fructanos acumulados en células en suspensión de Agave pueden ser el producto de la actividad de dos
enzimas: 1-SST con capacidad de sintetizar 1-kestosa y de la 6G-FFT/1-FFT, con actividad dual, síntesis de neokestosae
incremento en el GP, lo cual explica la presencia de inulinas y neoinulinas con GP 3 a 5, en una secuencia biosintética
no evidenciada experimentalmente en agave.
PALABRAS CLAVE: Fructanos, células en suspensión, Sacarosa: sacarosa 1-fructosiltransferasa, Fructan: fructan 6Gfructosiltransferasa, prebióticos.
ABSTRACT
The objective of this work was to establish the fructan biosynthetic pathway in Agave inaequidens and Agave tequilana
Weber var. azul cell suspension cultures, through identification of fructans synthesized in vitro with fructosytransferase
enzymes obtained from the cultures. Enzymes extraction was from cells 15 days old, the extracts were purified with
ammonium sulphate and ionic exchange chromatography, whereas the enzymes molecular weight was determined by
SDS PAGE. The enzymatic activity was determined by individual incubation of the enzymes with sucrose, 1-kestose
and 1,1-kestotetraose, 100 mM each, pH 5.5 and 30 °C. The carbohydrates synthesized in vitro, were identified by Thin
Layer Chromatography (TLC), using several inulins standars as reference. The results obtained showed that enzymes
from A. inaequidens sinthetized inulin and neoinulinoligofructans with degree of polymerization (DP) 3 and 4, while
A. tequilana enzymes mainly the inulin 1-kestose. These results are important because it is the first report showing
that fructans accumulated in Agave cell suspension cultures, may be the product from the activity of two enzymes:
66
Biosíntesis in vitro de oligofructanos en Agave: VIZCAÍNO-RODRÍGUEZ, L.A. ET AL.
1-SST with the ability to synthesize 1-kestose and 6G-FFT/1-FFT, with dual activity, neokestose synthesis and DP
increase, which explain the presence of inulins and neoinulins with DP 3 to 5, in biosynthetic sequence not evidenced
experimentally in agave.
KEYWORDS: Fructans, cell suspension cultures, Sucrose: sucrose 1-fructosyltransferase, Fructan: fructan 6Gfructosyltransferase, prebiotics.
INTRODUCCIÓN
Los fructanos de Agave tequilana Weber son una mezcla
de polímeros de fructosa que incluyen: oligosacáridos del
tipo inulina, neoinulina y conforme incrementa el grado de
polimerización (GP), el componente principal lo constituyen
graminanos y neofructanos ramificados (Mancilla & López
2006). En dicha especie, los mayores rendimientos en la
producción de fructanos se reporta en plantas de 6 a 8 años
de edad, con GP promedio de 10 a 13 (Luna 2010). En
plantas de Agave deserti se ha demostrado la presencia de
oligofructanos en hojas y acumulación de fructanos en tallos
(Wang & Nobel 1998). Actualmente, los fructanos de agave
tienen amplio uso comercial debido a su efecto prebiótico
y también son la materia prima para la obtención de jarabes
(alta fructosa), con lo cual se diversifica su uso tradicional
en la producción de tequila y mezcal (Arias 2007). Por
otra parte, se tiene poca información relacionada con las
enzimas responsables de su biosíntesis a la fecha ninguna
de ellas ha sido purificada, infiriéndose su presencia, tipo
de actividad, e incluso se ha propuesto su participación en
ruta de biosíntesis, con base a la estructura de los fructanos
producidos. Sin embargo, se tiene un avance importante en
el conocimiento de los genes de los que provienen dichas
enzimas, ya que se ha logrado la obtención de dos cDNA que
codifican para proteínas fructosiltransferasas con actividad
1-SST (sucrosa: sucrosa 1-fructosiltransferasa) (Ávila et
al. 2007) y 1-FFT (fructan: fructan 1-fructosiltransferasa)
(Mancilla & López 2006).
La biosíntesis de fructanos a partir de sacarosa (G-F) es
iniciada por la enzima 1-SST, la cual sintetiza 1-kestosa (GFF) molécula precursora; la elongación de dicha molécula por
la enzima 1-FFT origina polímeros de fructosa lineales: tipo
inulina con enlaces β (2-1) entre fructosas adyacentes. Por
otro lado, los fructanos tipo levano requieren la presencia de
la enzima 6-SFT (sacarosa: fructan 6-fructosiltransferasa),
que forma enlaces β(2-6) entre fructosas. Los fructanos
ramificados (graminanos) son producto de la actividad
de ambas enzimas ya que presentan enlaces β(2-1)y β(26). Todos los fructanos anteriores presentan glucosa en
posición terminal. Adicionalmente se ha detectado en
diversas plantas, incluido A. tequilana, la enzima 6G-FFT
(fructan: fructan 6G-fructosiltransferasa), la cual da origen
a fructanos de la neoserie que se caracterizan por contener
glucosa en posición intermedia, debido a la presencia
de residuos fructosilo en el carbono 1 y 6 de la molécula
de glucosa (FGFn). La elongación de la cadena en uno u
ambos extremos genera neoseries de inulina, levanos o bien
graminanos ramificados (Lasseur et al. 2006).
Asociadas al metabolismo de fructanos se encuentran
las invertasas y fructan-exohidrolasas (FEH). Las invertasas
hidrolizan sacarosa y algunas en particular tienen actividad
hidrolítica sobre fructanos de bajo GP. Las FEH purificadas
de plantas monocotiledóneas son específicas y promueven
de forma preferente la hidrólisis de enlaces β (2,1) (1-FEH),
o β (2,6) (6-FEH) y en conjunto con las fructosiltransferasas
permiten la acumulación de un conjunto específico de
fructanos (Van den Ende et al. 2003).
En el presente trabajo se empleó el cultivo de células en
suspensión de agave como modelo de estudio, ya que dichas
células expresan el metabolismo de fructanos en condiciones
controladas de cultivo (luz, pH, temperatura, esterilidad)
y ciclos cortos de producción (1 mes), comparadas con el
tiempo y exposición a factores ambientales que tienen las
plantas de agave en campo (6 a 8 años).
El objetivo de esta investigación es conocer la biosíntesis
de fructanos en el cultivo de células en suspensión de Agave
inaequidens y Agave tequilana Weber var. azul, asociando
el tipo de fructanos sintetizados a la expresión de enzimas
con actividad fructosiltransferasa para definir la ruta de
biosíntesis presente en los cultivos.
MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIAL VEGETAL
Semillas de Agave inaequidens y meristemas obtenidos de
plantas de Agave tequilana Weber var. azul, (1 año de edad)
fueron esterilizados superficialmente, y utilizados para la
inducción de callos friables en medio de Murashige y Skoog
(MS), solidificado con 2 g.l-1 de gelritey suplementado con
1 mg.l-1 de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) (Vizcaíno
2006).
ESTABLECIMIENTO DEL CULTIVO DE CÉLULAS EN SUSPENSIÓN DE
AGAVE
Del callo obtenido se transfirieron 5 g (peso seco) a 100
mL de medio MS líquido (conteniendo 3 g.l-1 de sacarosa
como fuente de carbono y suplementado con 1 mg.l-1 de
2,4-D y 0.005 mg.l-1 de 6-Bencilaminopurina (BAP)). El
67
Gayana Bot. 69(Número Especial), 2012
cultivo se incubó en agitadora orbital a 85 rpm, 25 º C y luz
fluorescente continua (1283. lb.lux). Cada 15 días las células
se recuperaron por filtración y lavadas con agua destilada
para su conservación a -20 º C hasta su empleo.
EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS
EXTRACTO CRUDO
Por cada 100 g de células (trituradas con nitrógeno líquido),
se emplearon 230 ml de buffer de extracción (pH 5.5, 50 mM
de acetato de sodio, 1 mM de EDTA, 1 mM mercaptoetanol,
1% (w/v) de PVP-40 y 0.1% (v/v) de inhibidor de proteasas).
Posterior a 2 h de agitación, la suspensión fue centrifugada
(10.000 rpm) a 4 º C por 30 min. El sobrenadante se colectó
e identificó como extracto crudo.
FRACCIONAMIENTO CON SULFATO DE AMONIO
Al extracto crudo se le adicionó (NH4)2SO4 al 20% (w/v)
de saturación y se dejó 2 h en reposo para precipitar las
proteínas. Posteriormente se centrifugó (10.000 rpm, 30 min)
y el sobrenadante se saturó con 70% (w/v) de (NH4)2SO4, el
precipitado obtenido por centrifugación se dializó durante
6 h con agua destilada y se liofilizó. Las dos fracciones
obtenidas se identificaron como At (A. tequilana) y Ai (A.
inaequidens).
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO ANIÓNICO, Q-SEPHAROSE
Las fracciónes At y Ai se disolvieron independientemente
en buffer pH7 (15mM de Tris-HCl, 5 mM EDTA), y se
adicionaron a la columna C16/20 Q-sepharose, equilibrada
previamente con el mismo buffer. La elusión de las fracciones
se llevó a cabo con un gradiente discontinuo 0,1; 0,2; 0,3
y 0,4 M de Cloruro de Sodio (NaCl), obteniéndose cinco
subfracciones, las cuales se dializaron y liofilizaron para su
conservación a -80 ºC. Las subfracciones se denominaron
At1, At2, At3, At4 (A. tequilana) y Ai1, Ai2, Ai3, Ai4 (A.
inaequidens).
ELECTROFORESIS
Las subfracciones obtenidas (extractos enzimáticos) se
procesaron en Gel de poliacrilamida sodio duodecil-sulfato
(SDS-PAGE) (Laemmli1 970). Las bandas de proteínas
fueron teñidas con azul Coomassie.
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
La mezcla de reacción consistió en 10 μl de extracto
enzimático y 10 μl del sustrato a evaluar (sacarosa, 1kestosa o 1-kestotetraosa 100 mM), incubados en buffer de
acetato con pH 5.5, a 30 ºC por 24 y 48 h. La reacción se
detuvo por calentamiento a 85 ºC durante 5 min (Mancilla
& López 2006).
DETECCIÓN DE CARBOHIDRATOS
Se realizó en cromatografía de capa fina (TLC), empleando
como fase móvil 1-propanol/1-butanol/agua (12:3:4) (V/
68
V/V) y sílica gel 60 como fase estacionaria. La solución
reveladora contenía 45,45% (V/V) de anilina (4% V/V en
acetona), 45,45% (V/V) de difenilamina (4% (V/V) en
acetona) y 9,1% (V/V) de ácido fosfórico al 85% (V/V)
(Mancilla & López 2006). Los principales productos de
reacción se identificaron por comparación con estándares
conocidos (glucosa, fructosa, sacarosa y 1-kestosa, 1kestotetraosa (Sigma) y 1-kestopentaosa (Megazyme)). El
medio de cultivo se analizó por Cromatografía de Líquidos
de Alta Resolución (HPLC).
RESULTADOS
ANÁLISIS DE CARBOHIDRATOS
MEDIO DE CULTIVO
No se detectaron fructanos en el medio de cultivo.
CARBOHIDRATOS INTRACELULARES
En la Figura 1, se muestra el tipo de carbohidratos
intracelulares, presentes en los cultivos a los 15 días de
incubación. De acuerdo con las condiciones de TLC
ensayadas los tiempos de retención (Rf) para los estándares
son: glucosa y fructosa 0,65, sacarosa: 0,59, I3: 0,44, I4: 0,37
e I5: 0,29. En las células de A. tequilana se detectó: glucosa,
fructosa eI3 (Fig. 1A), en A. inaequidens (Fig. 1B) se detectó
glucosa, fructosa, sacarosa, I3 e I4, además de carbohidratos
con diferentes tiempos de retención (0,50 y 0,41) respecto
al de las inulinas, los cuales de acuerdo con lo reportado
corresponden a la neokestosa y fructanos de la neoserie.
EXTRACTO CRUDO DE PROTEÍNAS
En la Figura 2 se muestra que la fracción A (A. tequilana)
emplea 1-kestosa (I3) como sustrato donador y aceptor para
generar neokestosa y fructanos con DP 4 y 5, así como
sacarosa y glucosa. En la fracción B (A. inaequidens), la
incubación con 13 incrementa el DP hasta 4 y 5. En presencia
de sacarosa sintetizó 1-kestosa (48 h de incubación) (Fig. 2).
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO ANIÓNICO, Q-SEPHAROSE
En la Tabla I se muestran los productos de reacción obtenidos
en la incubación de las fracciones en presencia de sacarosa
(S), 1-kestosa (I3) y 1,1-kestotetraosa (I4), durante 24 h de
incubación.
La fracción At1 a partir de sacarosa genera glucosa y fructosa;
empleó 1-kestosa y sintetizó neokestosa y oligofructanos con
DP 4 y 5. Considerando que este comportamiento puede
variar en función del tiempo de incubación se realizó el
experimento de la Figura 3, en la que se observa que durante
las primeras 4 h de incubación el primer producto obtenido es
un tetrasacárido y sacarosa, a las 24 h se detectó la síntesis de
neokestosa y oligrofructanos con DP 5. En la incubación con
1,1-kestotetraosa (I4) se obtuvieron oligofructanos con DP5 y
1-kestosa, a las 24 h se detectó además neokestosa y sacarosa.
Biosíntesis in vitro de oligofructanos en Agave: VIZCAÍNO-RODRÍGUEZ, L.A. ET AL.
a
F,G
S
G, F
S
neokestosa
neokestosa
I3
I3
I4
I4
I5
a
b
I5
estándar
estándar
b
estándar
S
I3
S
estándar
I3
FIGURA 1. Cromatografía en capa fina (TLC) de carbohidratos
intracelulares obtenidos del cultivo de células en suspensión de A.
tequilana(a) y A. inaequidens (b) a los 15 días de incubación. Mezcla
de estándares: Glucosa (G), fructosa (F) (color rojo), sacarosa (S),
1-kestosa (I3), 1,1-kestotetraosa (I4) y 1,1,1-kestopentaosa (I5).
FIGURA 2. Productos de reacción de la actividad enzimática para
la fracción A(a) y B(b), empleando sacarosa(S) y 1-kestosa (I3),
como sustrato, 48h y 30 ºC. Mezcla de estándares: Glucosa (G),
fructosa (F), sacarosa (S), 1-kestosa (I3), 1,1-kestotetraosa (I4) y
1,1,1-kestopentaosa (I5).
FIGURE 1. Thin layer chromatography (TLC) of intracellular
carbohydrates obtained from cell suspension culture of A. tequilana
(a) and A. inaequidens (b) within 15 days of incubation. A mixture
of standards: glucose (G), fructose (F) (red), sucrose (S), 1-kestose
(I3), 1,1-kestotetraose (I4) and 1,1,1-kestopentaose (I5 ).
FIGURE 2. Reaction products of enzymatic activity for fraction A(a)
and B(b), using sucrose (S) and 1-kestose (I3) as substrate, 48h and
30 ºC. A mixture of standards: glucose (G), fructose (F), sucrose
(S), 1-kestose (I3), 1,1-kestotetraose (I4) and 1,1,1-kestopentaose
(I5).
TABLA I. Productos de reacción obtenidos por incubación de las fracciones At1-2, durante 24 h, 30 º C y pH 5,5 empleando como sustratos:
100 mM sacarosa (S), 100 mM 1-kestosa (I3), 100 mM 1,1-kestotetraosa (I4) determinados por TLC.
TABLE I. Reaction products obtained by incubation of fractions At1-2 for 24 h, 30 ° C and pH 5.5, using as substrates: 100 mM sucrose (S),
100 mM 1-kestose (I3), 100 mM 1,1 - kestotetraose (I4), determined by TLC.
G
F
GF
FGF
GFF
DP4
Sustrato
DP5
TLC
Fracción At1
GF (S)
*
*
GFF (I3)
*
*
*
GFFF (I4)
*
*
*
*
*
GYF
S
*
*
neokestosa
I3
I4
I5
S
I4 estándar
I3
sustrato
Fracción At2
GF (S)
*
GFF (I3)
*
GFFF (I4)
*
*
*
*
GYF
S
*
I3
I4
I5
estándar
S
I3
I4
sustrato
69
Gayana Bot. 69(Número Especial), 2012
La incubación de At2 con 1-kestosa inicialmente sintetizó
fructanos con DP4y sacarosa durante las primeras 24 h (cabe
mencionar que a las 48h se detectó neokestosa), presentó ligera
actividad hidrolítica en presencia de sacarosa e I4.
Las fracciones At3 y At4 incubadas con sacarosa generan
glucosa y fructosa, y no presentaron actividad sobre los sustratos
(I3y I4) bajo las condiciones de incubación ensayadas.
Con respecto a A. inaequidens (Tabla II), la fracción
Ai1, sintetizó I3 desde sacarosa con liberación de glucosa.
La incubación con I3 produjo neokestosa y fructanos con
DP4, incubada en presencia de I4 se sintetizó oligos con
DP5 y DP3.
En las fracciones Ai2 y Ai3 hidrolizaron sacarosa
aglucosa y fructosa, así como oligofructanosa fructosa. En
la incubación con sacarosa de la fracción Ai4, se detectó 1kestosa y glucosa, incubada con I3 dicha fracción generó
DP4, sacarosa y glucosa.
CARACTERIZACIÓN DE FRACCIONES POR SDS-PAGE
Para A. tequilana (Fig. 4), las fracciones At1 y At2 presentaron
bandas con peso molecular de 51, 37, 22 y 20 kDa. En
tanto que para A. inaequidens, en las fracciones Ai1 y Ai4se
observaron bandas de 44 y 23 kDa. La fracción Ai2 presentó
una banda con peso molecular estimado en 75 kDa (datos no
mostrados).
TABLA II. Productos de reacción, obtenidos por incubación de la fracción Ai1-4, durante 24 h, 30 ºC y pH 5,5 empleando como sustratos: 100
mM sacarosa (S), 100 mM 1-kestosa (I3), 100 mM 1,1-kestotetraosa (I4) determinados por TLC.
TABLE II. Reaction products obtained by incubation of fractions Ai1-4 for 24 h, 30 °C and pH 5.5, using as substrates: 100 mM sucrose (S),
100 mM 1-kestose (I3), 100 mM 1,1 - kestotetraosa (I4), determined by TLC.
Sustrato
GF (S)
GFF (I3)
GFFF (I4)
G
F
GF
FGF
*
*
*
*
*
*
GFF
*
TLC
DP 4
DP5
Fracción Ai1
GYF
S
*
neokestosa
I3
I4
I5
*
estándar
S
I3 I4
SUSTRATO
Fracción Ai2
GF (S)
GFF (I3)
GFFF (I4)
*
*
*
*
*
*
GYF
S
*
I3
I4
I5
S
I3
I4
estándar
SUSTRATO
GF (S)
GFF (I3)
GFFF (I4)
*
*
*
Fracción Ai3
*
*
nd
GYF
S
I3
I4
I5
estándar
S
I3
SUSTRATO
GF (S)
GFF (I3)
GFFF (I4)
*
*
Fracción Ai4
*
*
*
nd
GYF
S
I3
I4
I5
estándar
S
I3
SUSTRATO
70
I4
I4
Biosíntesis in vitro de oligofructanos en Agave: VIZCAÍNO-RODRÍGUEZ, L.A. ET AL.
I3 I4
estándar
I3
I4 estándar
G, F
S
neokestosa
50
I3
I4
tetrasacárido
37
I5
a
250
150
100
75
25
b
28
15
10
std
FIGURA 3. TLC. Productos de reacción obtenidos de la actividad
enzimática de proteína de A. tequilana fracción At1 en presencia
de 1-kestosa (I3) 1,1-kestotetraosa (I4) durante 4(a) y 24(b) h de
incubación. GP. Mezcla estándar G (glucosa), S (sacarosa), I3, I4, y
1,1,1-kestopentaosa I5.
FIGURE 3. TLC. Reaction products obtained from the enzymatic
activity of A. tequilana protein At1 fraction in the presence of
1-kestose (I3) 1.1-kestotetraosa (I4) for 4 (a) and 24 (b) h of
incubation. Standard mixture GP G (glucose), S (sucrose), I3, I4,
1,1,1-kestopentaose I5.
DISCUSIÓN
En ambos cultivos se detectaron carbohidratos intracelulares,
en el caso de A. inaequidens incluye monosacáridos y
oligofructanos con DP 3 y 4, tanto lineales como de la
neoserie; estos últimos se caracterizan por un Rf menor al de
las inulinas (Praznick 2006, Ritsema 2003). En A. tequilana
se detectaron fructanos con DP3 con tiempo de retención
similar al de 1-kestosa, ello infiere la expresión de enzimas
con actividad fructosiltransferasa en ambos cultivos. En la
síntesis de fructanos, la actividad fructosiltransferasa puede
definirse como la transferencia de un grupo fructosilo (desde
sacarosa o fructanos) a una molécula precursora o aceptora
(sacarosa, 1-kestosa, neokestosa, etc.); la posición y el tipo
de enlace formado define el tipo de enzima responsable de
dicha actividad.
La actividad detectada en los extractos crudos de
proteína permiten confirmar la expresión de proteínas
con actividad glicosilhidrolasa que incluye: invertasas,
fructosiltransferasas y fructan- exohidrolasas. Las invertasas
se caracterizan por hidrolizar sacarosa en forma irreversible
generando glucosa y fructosa (Chen et al. 2009, Roitsch &
González 2004. Vargas et al. 2007).
Dicha actividad se detectó en el extracto crudo de A.
tequilana durante la incubación de la proteína con sacarosa
100mM, sin embargo durante la incubación del extracto de
A. inaequidens con sacarosa se obtuvo 1-kestosa, la cual es
sintetizada por actividad de la enzima 1-SST con liberación
de glucosa como subproducto, tal como ha sido reportada
At2
At1
FIGURA 4. SDS-PAGE (de izquierda a derecha), PM: marcador
de peso molecular (250, 150, 100, 75, 50, 37, 20, 15 y 10 kDa)
fracciones At2 y At1.
FIGURE 4. SDS-PAGE (from left to right): PM molecular weight
marker (250, 150, 100, 75, 50, 37, 20, 15 and 10 kDa) fractions
At2 and At1.
en chicoria (Van den Ende et al. 1996), Helianthus tuberosus
(Koops & Jonker 1996), Hordeum vulgare (Lüscher et
al. 2000) y deberá estar presente en todos los cultivos
que sintetizan fructanos ya que la 1-kestosa es el fructano
precursor de todos ellos.
La incubación con 1-kestosa de ambos extractos
incrementó el grado de polimerización, con obtención de
oligofructanos con DP 4 y 5. Para el caso de A. tequilana
la detección de neokestosa, isómero de 1-kestosa, infiere la
actividad de la enzima 6G-FFT, la cual es responsable de
la síntesis de fructanos de la neoserie empleando sacarosa
y oligofructanos como sustrato donador, transfiere un
residuo fructosilo al hidroxilo del C6 de la glucosa presente
enoligofructanos de bajo DP, de acuerdo con lo reportado en
Lolium perenne L. (Lasseur et al. 1996), Onion (Fujishima
et al. 2005) y Asparagus officinales (Ueno et al. 2005). El
incremento en el grado de polimerización puede ser producto
de la actividad de la enzima 1-FFT, la cual transfiere un
grupo fructosilo (empleando principalmente 1-kestosa
como sustrato donador) a la fructosa terminal del fructano
formando un enlace β(2,1) de acuerdo con lo reportado
para Wheat (Byeong & Housley 1992), Cichorium intybus
L. (Van den Ende et al. 1996), Chicory (Vergauwen et al.
2003).
En el caso de A. tequilana la purificación mediante
intercambio iónico permitió concentrar la actividad
fructosiltransferasa en 2 fracciones At1 y At2. En ambas se
observó síntesis de neokestosa, por lo tanto hay actividad
6G-FFT, sin embargo empleando 1-kestosa como sustrato
71
Gayana Bot. 69(Número Especial), 2012
aceptor y donador el primer producto de síntesis es un
oligofructano con DP 4 y sacarosa como subproducto,
posteriormente se detectó neokestosa y oligofructanos
con DP 5, lo cual corresponde al mecanismo de reacción
propuesto para la enzima 6G-FFT/1-FFT con actividad dual,
que permite la obtención de oligofructanos isómeros de la
serie inulina y neoinulina con enlaces β(2-1) y DP desde
3 hasta 7 unidades Lolium perenne (Lasseur et al. 1996),
Onion (Fujishima et al. 2005) y Asparragus officinales
(Ueno et al. 2005).
Dichas fracciones (At1 y At2) presentaron dos bandas
con peso molecular de 51 y 22 kDa. Resultados similares
se obtuvieron para la proteína 6G-FFT/1-FFT de cebolla,
que es un polipéptido de 66 kDa, con dos subunidades (52
kDa y 25kDa determinados por SDS-PAGE). En la misma
Figura 4, para las fracciones (con actividad invertasa), se
observaron bandas con peso molecular estimado de 37,
20kDa, semejantes a los encontrados (43 y 25 kDa) en la
invertasa vacuolar de 68 kDa, correspondientes a la isoforma
I de zanahoria (Unger et al. 1992, 1994, mencionados por
Sturm 1999).
La purificación del extracto crudo por cromatografía de
intercambio iónico para A. inaequidens permitió separar e
identificar dos isoformas con actividad 1-SST expresadas
en el cultivo celular Ai1 y Ai4, resultados similares se han
obtenido en Hordeum vulgare y Heliantus tuberosus, con
dos y cinco isoformas de la enzima 1-SST, respectivamente
(Lüscher et al. 2000). Cabe mencionar que en la fracción
Ai1se detectó además actividad 6G-FFT/1-FFT, durante
la incubación con 1-kestosa. Las fracciones Ai2 y Ai3
hidrolizaron los oligofructanos ensayados con liberación de
fructosa, lo cual es característico de enzimas con actividad
fructanexohidrolasa de acuerdo con lo reportado (Van Riet
et al. 2008).
La fracción Ai4 con actividad 1-SST presentó bandas de
44 y 23 kDa (datos no mostrados). Estos pesos moleculares
son semejantes (49 y 24 kDa) a los encontrados en la 1-SST
purificada desde Cichorium intybus, que es un polipéptido
de 69kDa (Van den Ende et al. 1996). La fracción Ai2 con
actividad FEH e invertasa mostró una banda con peso
molecular estimado en 75 kDa. Estos resultados coinciden
(70 kDa) con los encontrados en la tercera isoforma de
actividad fructanexohidrolasa1-FEH w3 obtenida de trigo,
que principalmente hidroliza fructanos con enlace β (2-1)
(Van Riet et al. 2008).
De acuerdo con la Tabla III, las actividades enzimáticas
detectadas fueron: a) A. inaequidens: 1-SST, 6G-FFT/1FFT, FEH e invertasa; b) A. tequilana, 6G-FFT/1-FFTe
invertasa.
Considerando que en todas las evaluaciones
realizadas en el presente trabajo, solamente se detectaron
oligofructanos con DP 5 o menores y con base a la actividad
fructosiltransferasa detectada, se infiere que en el cultivo de
células en suspensión de Agave inaequidens y A. tequilana
opera un sistema de dos enzimas 1-SST y 6G-FFT/1-FFT
con actividad dual. Cabe mencionar que en plantas de A.
tequilana de 6 años de edad que acumulan fructanos con
DP desde 3 hasta 27, a partir de extractos de proteína se
ha detectado actividad 6G-FFT, pero no se ha reportado
si dicha enzima presenta o no actividad dual, sin embargo
se detectó uncDNA que codifica para la enzima 1-FFT de
agave, expresada en Pichia pastoris, la cual no sintetiza
neokestosa in vitro. En plantas de agave y con base al tipo
de fructanos detectados, se infiere opera un sistema de
cuatro enzimas 1-SST, 6G-FFT, 1-FFT y 6-SFT (Mancilla
& López 2006).
La principal aportación del presente trabajo es demostrar
que la enzima 6G-FFT presente en Agave tiene actividad
dual, con capacidad de sintetizar isómeros con DP de 3 a 5.
Con base a lo anterior la nueva propuesta para la biosíntesis
de fructanos se muestra en la Figura 5. Esta ruta se caracteriza
principalmente por la presencia de la enzima 6G-FFT/1FFT para la biosíntesis de neokestosa, a diferencia de la
que sugiere que la síntesis de 1-kestotetraosa y neokestosa
ocurre por acción de las enzimas 1-FFT y 6G-FFT de forma
individual (Mancilla & López 2006).
TABLA III. Actividad fructosiltransferasa detectada en proteínas purificadas del cultivo de células en suspensión de Agave.
TABLE III. Fructosyltransferase activity of proteins detected in Agave cell culture suspension culture.
ACTIVIDAD
A. tequilana
1-SST
X
6G-FFT/1-FFT
X
X
Invertasa
X
X
FEH
72
A. inaequidens
X
Biosíntesis in vitro de oligofructanos en Agave: VIZCAÍNO-RODRÍGUEZ, L.A. ET AL.
La elongación de la cadena a partir de los tetrasacáridos puede
ocurrir en uno o ambos extremos
FIGURA 5. Mecanismo de reacción propuesto para la síntesis de oligofructanos en cultivos de células en suspensión de Agave.
FIGURE 5. Reaction mechanism proposed for the synthesis of fructo-oligosaccharides in cell suspension cultures of Agave.
AGRADECIMIENTOS
A la Dirección General de Educación Superior Tecnológica
(DGEST) por la Beca de Doctorado otorgada Nº
052003863FP.
BIBLIOGRAFÍA
ARIAS, C.C. 2007. Informe técnico del proyecto: Determinación
bioquímica de la madurez del Agave tequilana Weber
var. azul en el laboratorio y su implementación en campo.
México. C.R.T. 56 pp.
ÁVILA, F.A., C. OLVERA, P. RUDIÑO, G.I. COSSAB, S. NIETO & A.
LÓPEZ. 2007. Molecular characterization of sucrose:sucrose
1-fructosyltransferase (1-SST) from Agave tequilana
Weber var. azul. Plant Science 173: 478-486.
BYEONG, R. & T. L. HOUSLEY .1992. Purification and Characterization
of Wheat β (2-1) Fructan:fructanfructosyltransferase
Activity. Plant Physiology 100: 199-204.
CHEN, T.H., Y.C. HUANG, C.S. YANG, C.C. YANG, A.Y. WANG &
H.Y. SUNG. 2009. Insights in to the catalytic properties of
bamboo vacuolar invertase through mutational analysis of
active site residues. Phytochemistry 70: 25-31.
FUJISHIMA, M., H. SAKAI, K. UENO, N. TAKAHASHI, S. ONODERA,
N. BENKEBLIA & N. SHIOMI. 2005. Purification and
characterization of a fructosyltransferase from onion bulbs
and its key role in the synthesis of fructo-oligosaccharides
in vivo. New Phytologist 165: 513-524.
KOOPS, A. J. & H.H. JONKER. 1996. Purification and characterization
of the Enzymes of Fructan Biosynthesis in Tubers of
Helianthus tuberosus Colombia. Plant Physiology 110:
1167-1175.
LAEMMLI, U.K. 1970. Cleavage of structural proteins during the
assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:
680-685.
LASSEUR, B., J. LOTHIER, A. DJOUMAD, B. DE CONINC, S. SMEEKENS,
A. VAN LAERE, A. MORVAN-BERTRAND, W. VAN DEN ENDE,
& M.P. PRUD´HOMME. 2006. Molecular and functional
characterization of a cDNA encoding fructan:fructan 6Gfructosyltransferase (6G-FFT)/ fructan:fructan 1-fructosyl
transferase (1-FFT) from perennial ryegrass (Lolium
perenne L.). Journal of Experimental Botany 57(11):
2719-2734.
LUNA, T.G. 2010. Madurez del Agave tequilana Weber var. azul
y su relación con las características de los fructanos
acumulados en su piña. Tesis. Instituto Tecnológico de
Tlajomulco Jalisco. México. 82 pp.
LÜSCHER, M., U. HOCHSTRASSER, T. BOLLER & A. WIEMKEN. 2000.
Isolation of sucrose:sucrose 1-fructosyltransferase (1-SST)
from barley (Hordeum vulgare). New Phytologist 145:
225-232.
MANCILLA, M.N.A. & M.G. LÓPEZ. 2006. Water-Soluble
Carbohydrates and Fructan Structure Patterns from Agave
and Dasylirion Species. Journal of Agricultural and Food
Chemistry 54(20): 7832-7839.
MURASHIGE, T. & F. SKOOG. 1962. A revised medium for rapid
growth and bioassays with tobacco cultures. Physiologia
Plantarum 15: 473-497.
PRAZNIK, W. 2006. The potential of fructan plants for food and
nonfood application. Congreso Internacional Agave una
planta con futuro. Guadalajara. México. 206 pp.
RITSEMA, T., J. JOLING & S. SMEEKENS. 2003. Patterns of
fructans synthesized by onion fructan:fructan 6Gfructosyltransferase expressed in tobacco BY2 cells- is
fructan:fructan 1-fructosyltransferase needed in onion.
New Phytologist 160: 61-67.
ROITSCH, T. & M.C. GONZÁLEZ. 2004. Function and regulation
of plant invertases: sweet sensations. TRENDS in Plant
Science 9(12): 606-613.
STURM, A. 1999. Invertases. Primary Structures, Functions, and
Roles in Plant Development and Sucrose Partitioning.
Plant Physiology 121: 1-7.
UENO K., S. ONODERA, A. KAWAKAMI, M. YOSHIDA & N. SHIOMI.
2005. Molecular characterization and expression of a
cDNA encoding fructan:fructan 6G-fructosyltransferase
from asparagus (Asparagus officinalis). New Phytologist
165: 813-824.
VAN DEN ENDE, W. & A. VAN LAERE. 1996. Variation in the in vitro
generated fructan pattern from sucrose as a function of the
purified chicory root 1-SST and 1-FFT concentrations.
Journal of Experimental Botany 47(304): 1797-1803.
VAN DEN ENDE, W. D. VAN WONTERGHEM, P. VERHAERT, E. DEWIL
& A. VAN LAERE. 1996. Purification and characterization
of fructan:fructanfructosyltransferase from chicory
(Cichorium intybus L.) roots. Planta 199: 493-502.
VAN DEN ENDE, W., B. DE CONICK, S. CLERENS, R. VERGAUWEN &
A. VAN LAERE. 2003. Unexpected presence of fructan
6-exohydrolases (6-FEHs) in non-fructan plants:
73
Gayana Bot. 69(Número Especial), 2012
characterization, cloning mass mapping and functional
analysis of a novel `cell-wall invertaselike´specific 6-FEH
from sugar beet (Beta vulgaris L.). The Plant Journal 36:
697-710.
VAN DEN ENDE, W., D. VAN WONTERGHEM, E. DEWIL, P. VERHAERT,
A. DEE LOOF & A.VAN LAERE. 1996. Purification and
characterization off 1-SST the key enzime initiating fructan
biosynthesis in young chicory roots (Cichorium intybus).
Physiologia Plantarum 98: 455-466.
VAN RIET, L., D. ALTENBACH, R. VERGAUWEN, S. CLERENS, A.
KAWAKAMID, M. YOSHIDA, W. VAN DEN ENDE, A. WIEMKEN
& A. VAN LAERE. 2008. Purification, cloning and functional
differences of a third fructan 1-exohydrolase (1-FEHw3)
from wheat (Triticum aestivum). Physiologia Plantarum
133: 242-253.
VARGAS, W.A., H.G. PONTIS & G.L. SALERNO. 2007. Differential
expression of alkaline and neutral invertases in response
to environmental stresses: characterization of alkaline
isoform as stress leaves. Planta 226: 1535-1545.
VERGAUWEN, R., A. VAN LAERE & W. VAN DEN ENDE. 2003. Properties
of Fructan:fructan 1-fructosyltransferases from Chicory
and Globe Thistle, Two Asteracean Plants Storing Greatly
Different Types of Inulin. Plant Physiology 133: 341-401.
VIZCAÍNO, R.L.A. 2006. Determinación del efecto de macronutrientes
y reguladores de crecimiento en la producción de fructanos
a partir de cultivos de células en suspensión de Agave
inaequidens spp. inaequidens y Agave tequilana Weber
var. azul. Tesis. Instituto Tecnológico de Tlajomulco
Jalisco. México. 87 pp.
WANG, N. & P.S. NOBEL. 1998. Phloem Transport of Fructans in
the Crassulacean Acid Metabolism Species Agave deserti.
Plant Physiologist 116: 709-714.
Recibido: 15.10.10
Aceptado: 16.12.10
74