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ANALISIS DE LA EXPRESION DEL GEN DE LA ENZIMA POLIGALACTURONASA DEL
MAMEY (Pouteria sapota).
1
Blanca E. Pérez Magaña , Blanca L. Romero Meléndez1, Claudio F. Hernández Rodríguez1, Alma L.
Martínez Ayala2, Andrés Cruz Hernández3, Carlos J Huesca Quintero1, Norma J. López Monroy1
1
Centro Interdisciplinario de Ciencias de la Salud-UMA IPN, 2 Centro de Desarrollo de Productos
Bióticos-IPN. 3 Centro de Investigación y Estudios Avanzados Unidad Irapuato.
RESUMEN
El mamey es una planta de clima tropical que se cree originaria de América Central y
se conoce de su cultivo en Centro y Sudamérica, en el caso de México lo podemos encontrar
en los estados de Chiapas, Guerrero, Michoacán, Campeche, Oaxaca, Puebla, Veracruz y
Morelos (Penington y Sarukhan, 1968). Es un fruto de baja acidez, para su consumo como
alimento tiene un contenido de proteína de 1.70 % por lo que se encuentra entre los frutos
con valores más altos y contiene un 23 mg /100g de ácido ascórbico en el estado maduro.
La solubilización de los carbohidratos trae como consecuencia cambios de la textura del fruto
Villanueva-Arce y col., 2000).
El mamey es un fruto tropical muy apreciado por su agradable y especial sabor, tanto
para el consumo fresco como para la elaboración de helados, ates, jaleas, cremas,
mermeladas, dulces, postres y con las semillas se utilizan para hacer aceites, jabones, y
objetos ornamentales entre otros.
En este fruto se ha encontrado una fuerte relación entre la actividad enzimática de la
poligalacturonasa (PG) y el proceso de ablandamiento del fruto. Mediante la técnica de RTPCR, se obtuvo un fragmento de cDNA de la pulpa de fruto de mamey, utilizando
oligonucleótidos dirigidos a regiones específicas en la secuencia de PG. La clona
seleccionada se denominó pgps-1, que correspondió a un fragmento de 474 nucleótidos que
codifica para 158 aminoácidos, este fragmento mostró alta homología con la secuencia
reportada para durazno, tomate y melón. En el fragmento aislado se encontraron secuencias
conservadas que han sido reportadas en PG de otras plantas, este fragmento aislado se
utilizó como sonda homologa para realizar el análisis de la expresión del gen de la enzima
PG
en diferentes estadios de maduración verde, semimaduro y maduro
mediante un
análisis Northen Blot, observándose la expresión de PG en frutos verdes pero ésta se
incrementa conforme transcurre la maduración, es decir, es mayor la expresión en frutos
semimaduros y aún más en frutos maduros, muy parecida a la expresión del gen de otros
frutos como el jitomate, aguacate, manzana, durazno y melón. En el análisis tipo Southern
blot se observo que existen al menos dos copias del gen que codifica para la PG en el
genoma del mamey
Por lo que la información generada de estas investigaciones permitirá
plantear
estrategias para controlar el proceso de la maduración y poder mejorar la calidad de los
frutos y reducir ó minimizar las perdidas poscosecha de los frutos en un afán de mejorar las
cualidades comerciales y prolongar la vida de anaquel del mamey.
Palabras Clave: Maduración, ablandamiento, pared celular, cDNA
INTRODUCCION
El mamey es una planta de clima tropical que se cree originaria de América Central y
se sabe de su cultivo en Centro y Sudamérica, Filipinas, Cuba y las Antillas, no obstante que
su cultivo se ha incrementado en los últimos años especialmente en Florida y en el caso de
México lo podemos encontrar en los estados de Chiapas, Guerrero, Michoacán, Campeche,
Oaxaca, Puebla, Veracruz y Morelos (Penington y Sarukhan, 1968). Es un fruto de baja
acidez, para su consumo como alimento tiene un contenido de proteína de 1.70 % por lo que
se encuentra entre los frutos con valores más altos y contiene un 23 mg /100g de ácido
ascórbico en el estado maduro, contiene alrededor de 16-20% de carbohidratos insolubles
en el estado no maduro, de los cuales 12 % es almidón, 1.6 % pectinas y el 13% otros
carbohidratos insolubles los cuales se solubilizan durante la maduración disminuyendo a un
total de 13 % con el correspondiente aumento de azucares totales de 7 % al 18 %. La
solubilización de los carbohidratos trae como consecuencia cambios de la textura del fruto
(Villanueva-Arce y col., 2000).
El mamey es un fruto tropical muy apreciado por su agradable y especial sabor, tanto
para el consumo fresco como para la elaboración de helados, ates, jaleas, cremas,
mermeladas, dulces, postres y con las semillas se utilizan para hacer aceites, jabones, y
objetos ornamentales entre otros.
Los frutos ocupan el cuarto lugar en importancia económica en el mundo entre los
productos agrícolas y son unos de los más redituables en los países en desarrollo; México
posee una gran biodiversidad de frutales que son importantes no sólo por ser especies
nativas, sino por su papel dentro de la economía y la alimentación; muchas de estas
especies presentan magníficas oportunidades para el abastecimiento del mercado nacional e
internacional sobre todo en los países desarrollados y con clima templado o frío.
La maduración de los frutos es un proceso dinámico, caracterizado por una serie de
cambios bioquímicos y fisiológicos que conducen a que estos sean suaves y comestibles,
algunos de estos cambios influyen en el desarrollo del color, aroma, sabor y textura (Brady,
1987; Gómez-Lim, 1999). Estas modificaciones indican la participación de diversas vías
metabólicas que incluyen a todos los componentes celulares. Cuando comparamos los
órganos de una misma planta con los frutos propios, estos muestran una alta actividad
metabólica, la cual continúa después de la cosecha y que es determinante para la vida de
anaquel y puede ser causa de grandes problemas y pérdidas durante el transporte y la
comercialización de los productos frescos.
El proceso de la maduración involucra cuestiones tales como la regulación del control
metabólico, la comunicación entre organelos, los reguladores de crecimiento y la expresión
genética. Diversos estudios genéticos han sugerido que el proceso de la maduración está
programado en la célula y que requiere de la expresión diferencial de genes, lo que resulta
en la transcripción de mRNA específicos y en la síntesis de proteínas de novo (Lincoln y
Fischer, 1988; Darley y col., 2001).
En este sentido una tendencia en las investigaciones ha sido el uso de técnicas de
biología molecular, dirigidas al aislamiento, reconocimiento y expresión de los genes de las
principales enzimas que actúan durante el ablandamiento que se presenta en la maduración
de los frutos (Brummell y Harpster, 2001).
El ablandamiento de los tejidos de los frutos durante la maduración, puede tener
diferentes causas, entre las que se encuentra la ruptura de las interacciones entre los
polímeros que constituyen la pared celular, compuesta por un alto contenido de celulosas,
pero también por polisacáridos no celulósicos entre los que se tiene una proporción alta de
cadenas de galacturónidos que forman el esqueleto fundamental de las pectinas (Fischer y
Bennet, 1991). Por su síntesis rápida, abundancia y habilidad para hidrolizar los enlaces α
(1-4) en las cadenas de galacturónidos, la PG ha sido considerada una enzima clave para el
ablandamiento de los tejidos (Fischer y Bennett, 1991).
El primer cDNA de la enzima poligalacturonasa PG relacionado con la maduración
secuenciado fue el de jitomate (DellaPenna y col., 1986; Grierson y col., 1986).
Posteriormente los cDNA para PG han sido aislados de diferentes frutos tales como el
aguacate (Kutsunai y col., 1993), la manzana (Atkinson, 1994), el kiwi (Atkinson y Gardner,
1993) entre otros, demostrando que el aumento en la actividad de PG durante la maduración
es precedida por un aumento en la transcripción del gen que codifica para esta enzima. Sin
embargo, los factores que regulan la transcripción del mRNA de PG durante la maduración
no se conocen.
La capacidad de clonar genes vegetales y usarlos para transformar plantas ha
permitido un mayor avance en el entendimiento del papel de la pared celular vegetal durante
su desarrollo. La inserción de estos genes en plantas transgénicas han generado nueva
información sobre la contribución de las enzimas hidrolíticas en los cambios de la pared
celular durante el ablandamiento que se presenta en el proceso de la maduración (King y
O’Donoghue, 1995). El conocimiento de la función y regulación genética durante la
maduración es importante para comprender la producción, calidad y almacenamiento ó
manejo poscosecha de los frutos. Las bases moleculares de la maduración de frutos han
sido firmemente establecidas, empleando como modelo de estudio el fruto del jitomate
(Lycopersicon esculentum).
Experimentos recientes han mostrado que es posible apagar o suprimir la expresión
de genes existentes en plantas transgénicas, mediante la introducción de un gen construido
para generar un RNA antisentido, con lo cual se reducen los niveles tanto de mRNA de la
poligalacturonasa (PG) así como su actividad enzimática en cualquier estadio de maduración
de los frutos permitiendo que los tomates sean más firmes y soporten mejor el manejo
poscosecha, además de incrementar su vida en anaquel (Gray y col., 1992).
El mamey es una fruta climatérica de particular interés por las
propiedades
alimenticias y gustativas que presenta, con un buen potencial de mercado en función de que
sus características sensoriales son apreciadas, sin embargo, presenta corta vida de anaquel
debido a su alta tasa de respiración, lo cual limita su manejo y distribución (Saucedo y Baez,
1999). Por lo que en el presente trabajo se considero importante realizar investigaciones
dirigidas al análisis de la expresión del gen que codifica para la enzima poligalacturonasa del
mamey en tres diferentes estadios de maduración a través de la estrategia del Northen blot.
MATERIALES Y METODOS
Colecta de frutos
En el presente trabajo se usaron frutos de mamey en tres diferentes estadios de
maduración definidos de la siguiente manera: verdes, semimaduros y maduros que fueron
colectados en una huerta mixta comercial localizada en Coatlán del Río Morelos en el ciclo
de producción de 2005, posteriormente fueron trasladados al laboratorio el mismo día de la
colecta donde se realizó la separación manual de las pulpas y fueron congeladas a –70 º C
hasta el momento de ser utilizadas.
Extracción de RNA
El RNA fue extraído de frutos de mamey con tres diferentes estadios de maduración
definidos de la siguiente manera: verde, semimaduro y maduro empleando el método
descrito por Mason y Botella (1997) con algunas modificaciones. Los tejidos congelados se
pulverizaron con nitrógeno líquido. El polvo fue homogenizado en un tubo Eppendorf con 2.5
volúmenes de buffer de lisis para RNA 0.15 M Tris-Base, 50 mM EDTA, 2%(p/v) SDS,
1%(v/v) 2-ß-mercaptoetanol, se ajustó el pH 7.5 con ácido bórico saturado. Después de 1
min de agitación vigorosa en el vórtex, el homogenizado se incubó en baño maría durante
15 minutos, se precipitó con
0.25 volúmenes de etanol absoluto y 0.11 volúmenes de
acetato de potasio 5M, se mezcló por un minuto en vórtex. Se extrajo la mezcla con un
volumen de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1 v/v), se homogenizó por un minuto en vórtex
y se centrifugó a 10000 rpm, por 30 min a 4 ºC, se recupero la fase acuosa, la cual fue reextraída 2 veces, con un volumen de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1 v/v/v) y
después con un volumen de cloroformo-alcohol isoamílico (24:1 v/v), se centrifugó a 10000
rpm por 10 min a una temperatura de 4 ºC cada vez, se recuperó la fase acuosa. Para
recuperar el RNA se agrego un tercio de su volumen de cloruro de litio 8M, mezclando
suavemente, se congelo con nitrógeno liquido y se almaceno a -70 ºC toda la noche. Al día
siguiente la suspensión se centrifugó a 12000 rpm durante 45 min a 4 ºC, con mucho
cuidado se desecho el sobrenadante, la pastilla de RNA fue recuperada en 25 μl de agua.
La integridad del RNA en diferentes estadios de maduración se analizó por electroforesis en
gel de agarosa al 1%.
Análisis tipo Northen Blot
Los RNAs totales de los tres estadios de maduración verde, semimaduro y maduro
fueron fraccionados en gel de agarosa al 1.5 % por electroforesis, posteriormente se llevo a
cabo la transferencia a membrana de nylon (Hybond-N+; Amersham Pharmacia
Biotechnology, UK England) con ayuda de 5x SSC (Sambrook et al., 1989) como buffer de
transferencia. Se llevó a cabo la fijación del RNA a la membrana nylon (Hybond-N+) en luz
UV 1200 x 100 μJ/cm2 en un Stratalinker durante 14 s. El filtro fue prehibridizado a 42 oC en
10 ml de solución de (50% formamida, 5x SSC, solución Denharts 5x, 0.5% SDS, y 100
μ/ml de esperma de salmón desnaturalizado) por lo menos 2 horas. La hibridación fue
realizada durante 14 a 16 horas a 42 oC con la sonda homologa marcada radiactivamente
con α-32P-dCTP en la mezcla de hibridación (Sambrook y col., 1989). El filtro fue lavado en
condiciones astringentes y la película fue expuesta a rayos X durante 12 h a -70 ºC. El
autorradiograma fue revelado y se analizo la expresión del gen en los tres diferentes
estadios de maduración.
RESULTADOS Y DISCUSION
Los RNAs totales de los tres diferentes estadios de maduración verde, semimaduro y
maduro fueron extraídos de frutos de mamey por el micrométodo de Masson y Botella
(1997) el mismo día. Al emplear este método se le hicieron varias modificaciones para la
obtención de RNAs de buena calidad e integridad tales como: que durante el periodo de
incubación en el baño maría a 65°C con el buffer de lisis, cada cinco minutos las muestras
se agitaron vigorosamente en el vórtex cada cinco minutos durante tres veces, debido a que
la muestras en el estadio verde presenta un alto contenido de pectinas que hace difícil la
extracción del RNA, otra modificación fue que se hicieron dos extracciones seguidas con
fenol:cloroformo:alcohol isoamílico en una proporción 25:24:1. en lugar de hacer solo una.
La integridad de los RNAs en diferentes estadios de maduración se visualizaron en
gel de agarosa al 1% (Figura 1) por la presencia de dos bandas correspondientes al RNA
ribosomal, fracciones 25S y 18S (López-Gomez y Gómez-Lim, 1992).
Para evaluar la expresión del gen de la enzima PG de mamey,
cantidades iguales de RNAs de mamey
se emplearon
de cada uno de los estadios de maduración
establecidos mediante el análisis tipo Northern blot. La sonda homologa utilizada fue el
fragmento de cDNA de la enzima PG de mamey
que correspondió a la clona pgps-1 que
fue aislada por la estrategia de RT-PCR a partir de frutos de mamey y que correspondió a
un fragmento de 474 nucleótidos, que codifico para 158 aminoácidos (Figura 2a y 2b).
Los estudios de expresión en la mayoría de estos frutos han mostrado que existe un
aumento en la actividad de PG durante la maduración. En el aguacate se identificó un cDNA
de una endo-PG a, su patrón de expresión durante la maduración se correlaciono con el pico
climatérico. El mRNA no se detecto en frutos inmaduros, pero se encontró en forma
abundante en frutos maduros (Kutsunai y col., 1993).
Para la manzana primero fue reportada la expresión de la actividad de una exo-PG
(Bartley, 1978), sin embargo la actividad de una endo-PG fue detectada más tarde por (Wu y
col. 1993). La evidencia de la presencia de una endo PG en la maduración de manzanas fue
confirmada por (Atkinson, 1994).
En el durazno se aisló una PG completa; de una biblioteca de cDNA y por análisis
Northen blot no fue detectado el mRNA en duraznos inmaduros, este apareció en bajos
niveles como un transcrito de 1700 pb en frutos maduros que experimentaron ablandamiento
(Lester y col., 1994).
Para el caso del melón se aislaron tres isoenzimas endo (MPG1, MPG2 y MPG3) a
partir de un cDNA de 1370 pb que codifico para 456 aminoácidos, mostrando que la mayor
actividad de la MPG1 coincidió con el pico de ablandamiento de la pulpa del melón (Hadfield
y col. 1998 a/b).
En lo que se refiere al análisis de la expresión del gen de la enzima poligalacturonasa
del mamey en los tres diferentes estadios de maduración a través de de la estrategia del
análisis Northen Blot se observa la expresión de PG en frutos verdes y ésta se incrementa
conforme transcurre la maduración, es decir, es mayor la expresión del gen en frutos
semimaduros y aún más en frutos maduros (Figura 3).
Figura 1
1
2
3
25 S
18 S
5S
Figura 3
1
Figura 1 Patrón electroforético de
2
3
RNAs aislado del mesocarpo de mamey en
diferentes estadios de maduración 1) Verde, 2) Semimaduro, y 3) Maduro
Figura 3. Patrón de expresión del gen de la enzima PG de mamey en tres estadios
diferentes de maduración: 1) Verde, 2) Semimaduro y 3) Maduro
2a
GGATCCGATT
AATAGCGTGC
CTCGAGTCTT
TTAACAGTCA
CCCAATGCTA
GTCAAAAAAA
GTTACCAACC
CAAGTTAGTA
TCCTGSAGTT
TTTGATCGAT
AGTTCTGGTC
TGGAAAAGAA
TATCCTCAAT
CATCCTGCAS
CACCAAACGC
AAAAAAATTG
TGATGCCATG
GTGCCAGCGC
SAAGATTGTG
GACTATCCAA
GATGACAATG
CTCCGCTAAC
CCATTCTGTG
CCCAGGTTCT
ATACATTGTW
GCAGTGTATA
ACCGGGGCCA
CAACGGAGAC
ACAGYCGACG
ACGTGAATTS
GGGTTNTGGG
GAATCCATTG
TACCAGTGAA
TCCAATTCCT
TAATYTGGTC
ATTTYTGGTA
CAAGCCACAT
GCAATCGGSG
WTAATKGCAC
CATCCGTATA
CATTAACCAT
CTGGATCTCC
GACAACCTTT
TKCCCAGGCT
ATAAATTTAG
ATTAATATTG
TCTTGATCCA
YCTGTGCTGA
GTGAATTAAT
GGATCCATAT G
2b
DSHRSKLIHVXLXSXVTIXNXRISTXXDCVSVGAGTTNLWIKNVACGPGHGIRLVTNINY
QKLYTANXXXXPKFMTXLXNVCVWCSIGSLGKELEEPGXQDVTVKKVVFTGTQNGLRI
KTRGRSSNGFVSGVLFQHAIMVNAXNPIVIDQN
Figura. 2a) Secuencia nucleótidica del fragmento de pgps-1 clonado, 2b) Secuencia de
aminoácidos deducida de pgps-1
CONCLUSIONES
La maduración de frutos es un proceso ampliamente estudiado, se ha reportado la
participación de diferentes enzimas, considerándose que la enzima poligalacturonasa PG es
una de las más importantes durante este proceso. En el caso del mamey en un trabajo
previo se llevo a cabo el aislamiento y la caracterización de un cDNA que codifica para la
poligalacturonasa PG del mamey, la clona seleccionada se denominó pgps-1, que
correspondió a un fragmento de 474 nucleótidos, que codifica para 158 aminoácidos, este
fragmento mostró alta homología con la secuencia reportada para durazno, tomate y melón,
este fragmento aislado se utilizó como sonda homologa, al llevar a cabo el análisis de la
expresión del gen de la enzima poligalacturonasa del mamey en tres diferentes estadios de
maduración a través del análisis Northen Blot. Se observo la expresión del gen de la
enzima PG en frutos verdes y ésta se incrementa conforme transcurre la maduración, es
decir, es mayor la expresión en frutos semimaduros y aún más en frutos maduros. Muy
parecida a la expresión de la
PG con otros frutos tales como el jitomate, aguacate,
manzana, durazno y melón.
Por lo que la información generada de estas investigaciones permitirá
plantear
estrategias para controlar el proceso de la maduración y poder mejorar la calidad de los
frutos y reducir ó minimizar las perdidas poscosecha de los frutos en un afán de mejorar las
cualidades comerciales y prolongar la vida de anaquel del mamey.
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