Download Aislamiento, purificación e identificación de metabolitos

METABOLITOS BIOACTIVOS DE LA
BIODIVERSIDAD YUCATECA
Luis Manuel Peña Rodríguez
Laboratorios de Química Orgánica
Unidad de Biotecnología
Centro de Investigación Científica de Yucatán
Mérida, Yucatán, México
lmanuel@cicy.mx
Metabolitos Bioactivos
• Productos naturales
obtenidos de diferentes
fuentes naturales,
terrestres y marinas,
con aplicaciones en la
medicina, la agricultura
y la industria
alimenticia.
Fuentes naturales de metabolitos
bioactivos
Microorganismos (6000 bacterias y
1.5 millones de hongos)
Organismos marinos (10 millones)
Insectos (30 millones)
Plantas (300,000 especies)
(Müller et al., 2000)
LAS PLANTAS EN LA MEDICINA
• Fuente de cura para el
80% de la población
mundial
Fármacos de origen vegetal
Salix sp.
Salicina
Acido acetilsalicílico
Fármacos de origen vegetal
Catharanthus roseus (vicaria)
Vinblastina R=CH3
Vincristina R=CHO
Productos naturales como fármacos
‰
De 1981 a 2006 se reportaron 1184 nuevos fármacos
¾ 5% productos naturales
¾ 23% derivados de productos naturales
¾ 10% modelados a partir de productos naturales
¾ 4% productos naturales de síntesis química
(Newman & Cragg, 2007)
• De los 119 fármacos derivados de plantas,
el 74% son constituyentes activos de plantas
Vinblastina R=CH3
Vincristina R=CHO
Catharanthus roseus
Taxol
Taxus brevifolia
VALOR COMERCIAL DE ALGUNOS
PRODUCTOS NATURALES
• Taxol (Paclitaxel)
15.80 USD (1 mg)
• Vincristina
39.50 USD (1 mg)
• Vinblastina
10.38 USD (1 mg)
• Progesterona
2.66 USD (1 mg)
Fuente: Sigma-Aldrich
Las plantas como fuente de
nuevos fármacos
Existen aproximadamente 300,000
especies de plantas superiores en el
mundo
10% han sido estudiadas desde
un punto de vista fitoquímico o
farmacológico
Se calcula que existen 1 millón
de metabolitos pendientes de
identificar
(Hostettmann et al., 2006)
ƒ 25 zonas de mayor biodiversidad
ƒ 44% de todas las especies vegetales
ƒ 1.4% del área terrestre
• 138,000 km2 (12% protegido)
• 24,000 especies de plantas
• 5,000 endémicas
Cada año México deforesta más de un millón de
hectáreas
“La pérdida del conocimiento de los curanderos sobre los
usos medicinales de las plantas, conforme desaparecen
sus culturas, ha sido comparada con la pérdida de la
biblioteca en Alejandría. Pero para aquellos de nosotros
que estamos empezando a entender como leer las
moléculas en los seres vivos, la pérdida de biodiversidad
representa también la pérdida de una biblioteca, una
biblioteca que contiene las respuestas a las preguntas que
todavía no hemos aprendido a formular.”
Lynn Helen Caporale in “Chemical Ecology: A View from the
Pharmaceutical Industry”
El total de la flora fanerógama de México
se calcula en forma aproximada en
• 22,000 especies
• 220 familias
• 2,410 géneros
• Mas de 7000 especies se utilizan como plantas
medicinales (800 especies se emplean en la medicina
tradicional yucateca
•Menos del 5% han sido estudiadas
•Factores económicos y sociales están llevando a la
destrucción de estos recursos
• El estudio de los recursos puede contribuir a su
protección
Área de distribución de especies endémicas y
nativas de la península de Yucatán
Número total de especies
endémicas y nativas en la
Península de
Yucatán:
168
(Durán et al., 1998; Espadas et al., 2003)
Identificación de metabolitos bioactivos
Selección del material vegetal
Elección del bioensayo
Extracción y purificación
Identificación de la estructura
Modificación química
(Claeson y Bohlin, 1997)
Plantas de interés
• Pentalinon andrieuxii (leishmanicida)
• Colubrina greggii (antiprotozoaria)
• Lonchocarpus xuul (citotóxica)
• Byrsonima bucidaefolia (antioxidante)
• Jacquinia flammea (antifùngica)
Urechites andrieuxii Muell. Arg.
(APOCYNACEAE)
Planta trepadora
bejuco
guaco,
contrayerba.
conocida como
cantibteac
o
Contra mordeduras de serpientes
(raíz y hojas)
Disturbios nerviosos (látex)
Leishmaniasis
(raíz y hojas)
cutánea
localizada
Pech-López. Tesis de Licenciatura-UADY, 2002.
ESTUDIOS DE RAYOS X
Urechitol A
Obtención del ácido betulínico y derivados
Hojas de
Pentalinon andrieuxii
(365g)
Maceración
Extracto crudo de hojas de
P. andrieuxii
PA-1 (54.5g, 14.9%)
Partición L-L (Hx)
Polaridad baja
PA-2A
Gravedad
Ácido betulínico (1)
(62.7 mg, 0.1%)
Antiprotozoal Activity of Betulinic Acid Derivatives
Table 1. IC50 (µM) values of antiprotozoal activity of betulinic acid and derivates
Sample
Leishmanicidal
Trypanocidal
Ácido betulínico (1)
Antiplasmodial
LA
M2903
TULA
F32
Betulinic acid (1)
>200
>200
50.0
22.5
Betulinic acid acetate (2)
44.9
>200
154.4
11.8
Betulonic acid (3)
51.2
>200
161.4
>20
Betulinic acid methyl esther (4)
>200
69.9
93.3
>20
Betulin (5)
>200
>200
173.0
>20
0.6
0.2
0.2
Amphotericin B
Benznidazol
384.4
Leishmanicida
Tripanocida
Chloroquine
0.2
Betulinato de metilo (4)
LA: Leishmania amazonensis; M2903: L. braziliensis; TULA: Trypanosoma cruzi tulahuen; F32: Plasmodium falciparum.
Antiplasmódica
Lonchocarpus xuul Lundell
Nombre común:
Se le conoce como xuul, kan-xuul ó yaax-xuul.
Características generales:
Árbol endémico de la Península de Yucatán.
10m de alto, flor rojo-morado, fruto café, corteza
parda clara.
Usos locales:
Su madera es usada localmente para la construcción
Distribución:
Península de Yucatán, Chiapas (salto de agua),
Belice (corozal, Orange walk) y Guatemala (Petén).
Phytochemistry ( 2002 ) 60 :533-540
Actividad Biológica de Isocordoína
Leishmania
Amazonensis
Leishmania
Donovani
IC50= 40μg/mL
IC50= 26.7 μg/mL
Leishmania
Brazilensis
IC50= 10μg/mL
Tripanosoma
Cruzi
IC50= 26.7μg/mL
P-388
OVCA 433
IC50= 57μg/mL
IC50= 1.2 μM
Anti-Cancer Drug Design ( 1995), 10, 482-490
Borges-Argaez et al. Phytomedicine (2007)
INHIBICIÓN DE LA IkBa CINASA (PROTEASA VIRAL EN EL VIH) DE
ISOCORDOINA Y SUS DERIVADOS, NATURALES Y SEMISINTETICOS
Actividad analgésica de chalconas naturales y semisintéticas en el
modelo de contorsiones abdominales inducidas por ácido acético
(0.6 %) administrado via intraperitoneal.
Byrsonima bucidaefolia Standl.
• Localizada
principalmente en
mesoamérica
Nombres comunes:
“craboo”, “nancen
agria”, “zacpah”
• Actividad antioxidante
en su extracto
metanólico
Aislamiento del metabolito BBH-19K
BBH-16B
(11.18 g)
CLV
7 x 5cm
DCM/Hx/MeOH
BBH-17C
(94.8 mg)
CPG: 2 x 20 cm
DCM/MeOH 1:1
Sephadex LH-20
BBH-19K
(5.6 mg)
BBH-19H
(4.9 mg)
BBH-19J
(32.2 mg)
BBH-19I
(35.8 mg)
BBH-19L
(1.4 mg)
Methyl gallate trimeric ester
from gallotanins in
B.
bucidaefolia
Table 1. Antioxidant activity of metabolites 1-6
in the DPPH free-radical test.
Castillo-Avila et al., Nat.Prod.Comm., 2009
Comparación de la composición de los extractos de
B. bucidaefolia por CCD
1. Ext. MeOH
4. Ext. DCM
7. Infusión
2. Ext. EtOAc
5. Ext. EtOH
8. EtOAc (inf.)
3. Ext. BBH
6. Ext. An
9. C+ (vit. C)
Jacquinia flammea Millispaugh
(Teophrastaceae)
Purificación de la fracción metanólica
de J. flammea por VLC
Ext MeOH
CHCl3:MeOH:H2O (14:7:1)
CHCl3:MeOH:H2O (10:10:1)
9 fracciones
JF16(A.H)
Bioensayo antifúngico contra
Colletotrichum gloesporioides
Hidrólisis del producto mayoritario del extracto metanólico de J. flammea.
HCl 2N
Sakurososaponina
Primulagenina A (SL-11pp)
Actividad antifúngica del extracto crudo hidrolizado de J. flammea
1.- Extracto metanólico
2.- Producto de hidrólisis del extracto
metanólico
pp.- Primulagenina A ( SL-11pp)
9.- Producto de acetilación de SL-11pp
A →L .- Fracciones de VLC (SL-7)
SK.- Sakurososaponina
(-).- Control negativo
„
„
„
„
„
Cepa: Collectotrichum gloeosporoides
Medio: PDA
Control (+) : Neomicol® ,10µg (5µl - 0.2%)
Control(-) : CH2Cl2/MeOH (9:1)
Concentración de muestras: 500µg (10µl - 5%)
(+).- Control positivo
Sergio L. Medina Ruiz
Colubrina greggii S. Watson
Familia: Rhamnaceae
Sinonimia:
Común:
(china may, guayol, guayul,
manzanita, pimiento ché, tatuán, trampillo,
trompillo o vara prieta).
Descripción:
Arbusto de 1 a 5 m de altura
Hojas alternas, lanceoladas, ápice acuminado
Inflorescencias en tirsos, de 15 a 40 flores,
sépalos verdosos deltados.
Frutos casi esféricos con semillas negras
Uso etnobotánico:
Abscesos y granulaciones de párpados
Antitusivo y asma
Tuberculosis
Disentería
Enfermedades del hígado
Ulceraciones y emoliente
(Fernández, 1986)
Purificación de la fracción CG-2B
CG-5A
Extracto crudo
CG-1
Crisofaneína (9)
Partición L-L
AcOEt
CG-5B
Polaridad media
CG-2B
CG-6C
VLC
CH2Cl2/An (99:1-94:6)
CHCl3/Hx/MeOH (70:25:5)
CG-5E
CG-5N
Actividad
antiprotozoaria
Flash
Hx/An 8:2
VLC
CH2Cl2/Hx/MeOH
(70:20:1-89:1:10)
CH2Cl2/MeOH (90:10)
Ácido Betulínico (1)
CG-6F
CG-6I
Gravedad
Eter/Hx (1:1)
CG-7C
CG-7I
CG-8D-J
CG-9E
CG-8J-L
CG-10D
Gravedad
CHCl3/Hx/MeOH
(50:40:10-70:20:10)
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Corrección de la estructura de DCG-6F
DCG-6H
9 CH3
9 CH2
7 CH
9C
Metilacíón
CH3I /K2CO3
C34H52O6
HSQC de DCG-25
51.52
51.32
Acetato de ácido ceanótico
m/z 557 (M+ + H+) C34H53O6
H HMBC 3.66 (3H, s) 174.27
3.68 (3H, s) 176.64
m/z 511 (M+ ‐ H2O) C32H46O5
m/z 529 (M+ + H+) C32H47O6
7 CH3
8 CH2
8 CH
9C
LOS COSTOS DE UN PRODUCTO FARMOQUIMICO
Drug Dicovery Today, 10, 2005
Cortesía: Dr. Fernando Echeverri
Taxus brevifolia
HISTORIA DEL TAXOL
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1963 Detección de actividad antitumoral en
extractos de Taxus brevifolia
1971 Identificación de la estructura del Taxol
1979 Establecimiento del modo de acción del Taxol
1983 Inicio de las pruebas de Fase Clínica I
1985 Inicio de las pruebas de Fase Clínica II
1992 Se licencia la producción de Taxol a Bristol-Myers
1992 Taxol es aprobado para tratar cáncer de ovario
1993 Inicio de la búsqueda de fuentes alternas de Taxol
1993 El uso de Taxol se aprueba en Europa y
Latinoamérica
1994 Taxol es aprobado para tratar el cáncer de seno
1995 Se aprueba el uso de Taxol semisintético
1997 Taxol es aprobado para tratar el sarcoma de Kaposi
1998 Aparece el Taxol genérico
DATOS SOBRE EL TAXOL
• Rendimiento de taxol en Taxus brevifolia: < 0.02%.
• Un árbol de 100 años produce aprox. 5 Kg de corteza.
•12.5 ton. de corteza (2500 árboles) producen 1 Kg de taxol.
• Para las fases clínica y preclínica de taxol se colectaron
entre 2.5 y 7.5 ton. de corteza (500-1500 árboles).
• 12,500 mujeres (casos por año en EU) requieren 90,000
árboles para su tratamiento de cáncer de ovario.
Arthur Barclay
Taxus baccata
Preparación de Taxol semisintético
Robert Holton
Economía del Taxol
Fuentes alternas de Taxol
Pestalotiopsis microspora
Taxomyces adrenae
CTV’s Taxus baccata
FUTURO
9 Cultivo de tejidos vegetales
9 Ingeniería metabólica
9 Biotransformación
9 Síntesis
9 Plantas transgénicas
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA DE
Capraria biflora
Proyectos: estudiantes
Dafne-DD
Leishmanicidas de plantas
Carlos-DDM
Fitotoxinas de M. fijiensis
Chucho-M
Biosíntesis de
terpenoides
Claudia-DDM
Antioxidantes en bromelias
Glendy-M
Tripanocidas
de plantas
Agradecimientos
NACIONALES
• Dr. Salvador Said Fernández. CIBIN-IMSS, Monterrey, NL
• Dra. Gloria M. Molina Salinas. CIBIN-IMSS, Monterrey, NL
• MC Manuel J. Chan Bacab, Universidad Autónoma de Campeche
• Dra. María Luisa Villarreal. Universidad Autónoma del Estado de Morelos
INTERNAS
QBB Karlina García Sosa-Técnico Académico
QBB Fabiola Escalante Erosa-Técnico Académico
• Dr. Germán Carnevalli Fernández Concha. URN
• Dr. Rafael Durán García. URN
• Dra. M. Marcela Gamboa Angulo. UBT
• Dra. Rocío de Lourdes Borges Argáez. UBT
• Paulino Simá Polanco. URN
• Filogonio May Pat. URN
Agradecimientos
INTERNACIONALES
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Dra. Susana Zacchino. UNRosario, Argentina
Dr. Alberto Giménez Turba. IIFB-UMSA, Bolivia
Dr. Alberto Loyola Morales. UAntofagasta, Chile
Dr. Valdir Cechinel Filho. UNIVALI, Brasil
Dr. Alberto Sánchez. UELondon, UK
Dra. Giulia Getti. UELondon, UK
Dr. Solomon Habtemariam, UGreennwich, UK
Dr. Peter Waterman. SCU, Australia
Dra. Linda Balbury. SCU, Australia
Dr. Andrew Flowers. SCU, Australia
Dr. Olov Sterner. Lund University, Suecia
Dr. Jean-Luc Galzi. UStrasbourg, Francia
Dr. Eduardo Muñoz. UCórdoba, España
Dr. Gordon Cragg. NCI, USA
Dr. Scott Franzblau. LSU, USA
FINANCIAMIENTO
-International Foundation for Science
-Programa Iberoamericano de Ciencia y
Tecnología para el Desarrollo
(CYTED,
Proyectos X.5, X.7, X.11, RIBIOFAR)
-Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología
-Red Alfa-Comunidad Europea
-FOMIX-Yucatán
-Consejo Británico
-Centro de Investigación Científica de Yucatán