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REDIELUZ
ISSN 2244-7334 / Depósito legal pp 201102ZU3769
Vol. 1 Nº 2 · Julio - Diciembre 2011: 123 - 129
DE Staphylococcus aureus
Presence of the blaZ and mecA genes as mechanisms of b–lactams
resistance development in Staphyloccocus aureus strains
Endrina Mujica, Andrea Mujica, María Patricia Sánchez, Mauribel Sánchez,
Arleen Sánchez y Nailet Arráiz
Facultad de Medicina, Escuela de Medicina y Escuela de Bioanálisis. Universidad del Zulia,
endrinamujica3@gmail.com
Resumen
Los miembros del género Staphylococcus son cocos Gram positivos, pertenecientes a la familia Micrococcaceae. S. aureus es un coco inmóvil, de 0.8 a 1µm
de diámetro. S. aureus es capaz de producir más de
30 proteínas extracelulares, las cuales pueden aumentar la patogénesis y la virulencia del organismo
(Iglewwski y Clark, 1990). Asimismo, pueden generar
genes de resistencia a b-lactámicos (blaZ y mecA) y
otros antibióticos, dificultando el tratamiento antimicrobiano. El objetivo de esta investigación fue determinar
la presencia de los genes que contribuyen a la resistencia a antibióticos b-lactámicos en cepas de
Staphylococcus aureus aisladas de pacientes que asistieron centros de salud de carácter privado. Se utilizaron técnicas de amplificación por reacción en cadena
de la polimerasa (PCR), para detectar la presencia de
genes mecA, responsables de la producción de una
proteína modificada que confiere resistencia a penicilinas, y blaZ, responsable de la hiperproducción de
b-lactamasas. Se incluyó un grupo de 30 cepas resistentes a oxacilina (SARM) y 20 cepas sensibles a oxacilina (SASM). Como resultado, El gen mecA fue encontrado en 93,33% de las cepas SARM, mientras que
en el grupo SASM, una de las cepas tenía el gen
mecA. En la cepa SARM que carecía del gen mecA se
Recibido: 23 / 07 / 2011. Aceptado: 01 / 09 / 2011
demostró la presencia del gen blaZ, el cual podría ser
el responsable de la resistencia a oxacilina a través de
otro mecanismo de superproducción de b-lactamasa.
Se debe destacar que la cepa sensible a oxacilina,
pero que posee el gen mecA, tiene la capacidad de desarrollar resistencia si es expuesta al antibiótico. La
presencia del gen mecA sigue siendo el principal mecanismo de resistencia a oxacilina en S. aureus.
Palabras clave: S. aureus, gen mecA, gen blaZ, resistencia a antibióticos, RCP.
Abstract
The members of the Staphylococcus genus are
Gram-positive cocci belonging to the Micrococcaceae
family. S. aureus is a motionless cocus measuring
from 0.8 to 1µm of diameter. S. aureus is capable of
producing more than 30 extracelular proteins, which
may increase pathogenesis and virulence of this organism (Iglewwski and Clark. 1990). Likewise, it may generate genes that are resistant to b-lactams (blaZ and
mecA) and other antibiotics, hindering the use of the
antimicrobial treatment. The objective of this study
was to determine the presence of genes that contribute to the development of resistance to b-lactam antibiotics in Staphylococcus aureus strains isolated from
patients attending private health centers. Amplification
techniques by polymerase chain reaction (PCR) were
used to detect the presence of mecA genes, responsi-
Ciencias de la Salud
PRESENCIA DE LOS GENES mecA Y blaZ COMO MECANISMOS
DE DESARROLLO DE RESISTENCIA A b-LACTÁMICOS EN CEPAS
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Endrina Mujica, Andrea Mujica, María P. Sánchez, Mauribel Sánchez, Arleen Sánchez y Nailet Arráiz
Presencia de los genes mecA y blaZ como mecanismos de desarrollo de resistencia a b-lactámicos...
ble for the production of a modified protein that provides resistance to penicillin, and blaZ genes, responsible for b-lactams hyperproduction. A group of 30 oxacillin-resistant strains (ORSA) and 20 oxacillin-sensitive strains (OSSA) were included in the study. As a result, the mecA gen was found in 93,33% of the ORSA
strains, whereas in the OSSA group, one of the strains exhibited the mecA gen. In the ORSA strain which
showed no presence of the mecA gen, the presence
of the blaZ gen was detected; this gen could be responsible for oxacillin resistance through a different
mechanism of b-lactams hyperproduction. It is important to point out that the oxacillin-sensitive strain exhibiting the mecA gen has the ability to develop resistance if exposed to the antibiotic. The presence of the
meca gen continues to be the main oxacillin resistance mechanism in S. aureus.
Key words: S. aureus, mecA gene, blaZ gene, antibiotic resistance, PCR.
INTRODUCCIÓN
Los miembros del género Staphylococcus son
cocos Gram positivos, pertenecientes a la familia Micrococcaceae. S. aureus es un coco inmóvil, de 0.8 a
1µm de diámetro; es capaz de producir más de 30
proteínas extracelulares, las cuales pueden aumentar
la patogénesis y la virulencia del organismo
(Iglewwski y Clark, 1990). Asimismo, pueden generar
genes de resistencia a b-lactámicos (blaZ y mecA) y
otros antibióticos, dificultando el tratamiento antimicrobiano.
En 1961, un año después de la incorporación de
la penicilina como tratamiento principal de estas infecciones, se detectaron las primeras cepas de S. aureus resistentes a penicilina (Jevons, 1961). Para poder combatir estas cepas resistentes, se diseñaron
otros b-lactámicos modificados, tales como la meticilina y oxacilina y una vez más, S. aureus desarrolló resistencia a estos antibióticos. Estas cepas resistentes
a meticilina, oxacilina y la mayoría de b-lactámicos se
conocen colectivamente como S. aureus meticilino resistentes (SAMR).
Igualmente, estas infecciones se clasificaban
únicamente como nosocomiales debido a su expansión en los centros de asistencia médica. Esto fue así
hasta que en Australia en 1993, se reportaron los primeros casos de SAMR asociados a la comunidad que
presentaban genes de resistencia a meticilina (David
et al., 2008). El CDC (por sus siglas en inglés Centers
for Disease Control and Prevention) definió esta nueva clase de SAMR como “infecciones que son adquiridas por personas que no han estado recientemente
(en el último año) hospitalizadas o tenido procedi-
mientos médicos (tales como diálisis, cirugía y catéteres). Se puede decir que el SAMR se ha convertido
en un problema mundial debido a su fácil transmisión.
Si el principal factor de riesgo es la asistencia a
centros médicos y la existencia de cepas de SAMR
extra-hospitalarias, hay mayor cantidad de personas
propensas a adquirir la bacteria. Los medios de transmisión incluyen el contacto directo con personas, objetos y superficies infectadas y la presencia de lesiones en la piel. Estos son factores que no se pueden
controlar en la vida diaria, por ello, se han encontrado
infecciones en nuevos grupos de comunidades como
los niños, atletas, prisioneros, bomberos (Roberts et
al., 2011), americanos nativos y habitantes de las islas del Pacífico (Martínez, 2003; Castro, 2010; Chatzakis et al., 2011; Begier, 2004).
El SAMR puede ser el responsable de infecciones en la piel y los tejidos blandos, bacteriemia, neumonía, celulitis, endocarditis y síndrome de shock tóxico. El espectro de enfermedad ha sido tan extenso
que se han encontrado cepas de S. aureus en infecciones oculares (Daum, 2009) e incluso en enfermedades poco comunes tales como pielonefritis xantogranulomatosa (Kempker et al., 2009).
Agentes Antimicrobianos
Los agentes antimicrobianos o antibióticos son
sustancias utilizadas para destruir (bactericidas) o
inhibir el crecimiento (bacteriostáticos) de las bacterias y tienen diferentes mecanismos de acción dependiendo del objetivo a atacar. Los más comunes son
los b-lactámicos, los cuales están agrupados por tener una estructura en común: el anillo b-lactámico
(Salyers y Whitt, 2005). Se dividen en: penicilinas, cefalosporinas, carbapenemas y monobactámicos, Para
lograr el efecto deseado, los b-lactámicos deben actuar en el momento de la división celular (Marín y Gudiol, 2003).
El mecanismo de acción de los b-lactámicos es
inhibir el último paso en la síntesis del peptidoglucano
(principal componente de la pared celular). Además,
su estructura le permite adherirse a proteínas como la
transpeptidasa (también llamada PBP, por sus siglas
en inglés “penicilin-binding proteins”) las cuales tienen
un papel importante en la síntesis de la pared celular
(Salyers y Whitt, 2005). El resultado es una pared celular débil que se rompe al verse afectada por la presión osmótica intracelular.
S. aureus: Mecanismos de resistencia a los
b-lactámicos
La resistencia a estos antibióticos puede producirse por diferentes mecanismos a través de una ex-
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presión genética que puede ser cromosómica, plasmídica o por transposones. Marín y Guidol (2003) afirman, “La resistencia cromosómica aparece por mutación, mientras que los plásmidos y los transposones
pueden ser autotransferibles entre bacterias” (p.47),
lo cual implica que hay diferentes maneras de obtener
esa resistencia.
Entre los mecanismos de resistencia más comunes en S. aureus se encuentran los siguientes:
– Síntesis de la proteína PBP2a: esta proteína es
una modificación de la PBP nativa. La información para que se produzca esta proteína modificada es conferida por el gen mecA presente
en la bacteria. Al tener una estructura diferente, PBP2a tiene una baja afinidad por los b-lactámicos de manera tal que impide la acción del
antibiótico sobre la pared celular. Este gen parece adquirirse mediante transferencia genética horizontal y se localiza en el cromosoma de
la bacteria (Mandell et al., 2002).
– Hiperproducción de b-lactamasas: las b-lactamasas son enzimas producidas cuando la
bacteria adquiere el gen blaZ. Su acción es
romper los anillos b-lactámicos del antibiótico
antes de que cause daños irreversibles en la
bacteria (Mandell et al., 2002). Una sobreexpresión de este gen permite la síntesis de
gran cantidad de b-lactamasas que inactivará
mayor número de moléculas del antibiótico.
Normalmente, el gen es transferido por plásmidos, pequeñas porciones de ADN en forma
circular que están separadas del cromosoma
bacteriano y se reproducen cada vez que el
cromosoma se divide (Passagre, 2001).
Al ser resistente a los antibióticos, las tasas de
morbilidad y mortalidad aumentan severamente y por
ello es esencial una identificación rápida y segura del
patógeno. Se ha demostrado que las pruebas usuales
y las pruebas de susceptibilidad a antibióticos pueden
arrojar resultados erróneos y aunque permiten identificar la S. aureus, muchas veces no permiten determinar que la bacteria tiene la característica de ser resistente a algunos antibióticos. La demora en el reporte
de la resistencia antimicrobiana puede implicar mayor
tiempo de exposición de los demás pacientes al patógeno y por ende, mayor prevalencia de la enfermedad
(Ribero, 1999; Sturenburg, 2009).
Debido a la necesidad de un diagnóstico óptimo,
se han incorporado nuevas estrategias para identificar SAMR, tal como la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP o PCR por sus siglas en inglés: polymerase chain reaction), la cual ha resultado
ser la más efectiva y sensible (Depano y Struelens,
1998). A través de este método, se puede determinar
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la presencia de genes causantes de la resistencia y
así tratar adecuadamente al paciente.
Como se ha revisado, la resistencia a oxacilina
en S. aureus es la expresión de alguna secuencia de
ADN adquirida por la célula. La importancia en la determinación de la causa de la resistencia reside en el
tipo de tratamiento a emplear. Por ello, el objetivo de
esta investigación fue determinar la presencia de los
genes mecA o blaZ como mecanismos alternativos de
resistencia a antibióticos b-lactámicos en cepas de S.
aureus.
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención y selección de cepas de S. aureus
Se seleccionaron 50 cepas de S. aureus aisladas de pacientes que asistieron a consulta en centros
de salud de carácter privado en la región zuliana. Se
incluyeron 30 cepas resistentes y 20 cepas sensibles
a oxacilina. La susceptibilidad a antibióticos fue determinada por el método de difusión en disco. Las lesiones a partir de las cuales las cepas SARM fueron aisladas incluyen principalmente abscesos, heridas traumáticas y úlceras en extremidades (Tabla 1).
Tabla 1. Tipo de lesiones en pacientes
de los cuales se aisló S. aureus resistente
a la meticilina (SARM) y sensible
a la meticilina (SASM) (n=50)
Grupo
Número de
Pacientes
Patología
SARM
12
Absceso
1
Conjuntivitis
8
Heridas por trauma
7
Úlceras en pie
2
Ulceras en brazos
6
Absceso
6
Úlcera en pie
8
Herida por trauma
(n=30)
SASM
(n=20)
Obtención del ADN de S. Aureus
Se tomaron 10 colonias de cada cultivo y se colocaron en tubos conteniendo 400 µl de buffer TrisEDTA, pH 8. Se le agregó 10 µl de lisostaphina 10
mg/ml (Promega) y se incubaron en baño de maría a
37°C por 1 hora. Se agregó SDS (1%) y proteinasa K
(250 ng/µl) y se incubó en baño de maría a 50°C por
1 hora. Se hizo una extracción con solventes orgánicos y la fase acuosa (contiene el ADN) fue recuperada con una micro-pipeta y se transfirió a otro tubo. El
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ADN de la fase acuosa fue precipitado al agregar 800
µl de etanol 100% y centrifugado a 10000 rpm por 10
minutos. Se repitió el procedimiento con etanol 70%,
pero la centrifugación fue llevada a cabo por 5 minutos. El ADN se resuspendió en 200 µl de buffer TE.
Se utilizó 3 µl de la muestra para ensayos de amplificación por PCR.
Ensayos de amplificación por PCR
de los genes blaz y mecA
Se preparó la mezcla de reacción de amplificación (50 µl) con los siguientes componentes: 10 µl de
buffer taq DNA polimerasa (Promega), 2,5 µl de
MgCl2, 1 µl de mezcla de desoxirribonucleótidos
(dATP, dCTP, dGTP y dTTP), 0,5 µl de cada par de
oligonucleótidos específicos del gen mecA o 0,5 µl de
cada oligonucleótido específico del gen blaZ, Se utilizó 0,25 µl de Taq DNA polimerasa (5 U/µl) para cada
reacción (PROMEGA). Como control interno en cada
reacción, se incluyó un par de cebadores (0,5 µl cada
cebador) específicos del género S. aureus, el cual debería resultar positivo en todas las muestras.
Los tubos fueron colocados en un equipo termociclador marca MJResearch, modelo PTC-100, al cual
se le ajustaron los siguientes ciclos de temperatura:
30 ciclos de amplificación: 1 minuto a 94°C, 1 minuto
a 50°C, 1 minuto a 72°C. Antes de estos ciclos se
hizo desnaturalización de 5 minutos a 94°C y al final
de los 30 ciclos un paso final de amplificación a 72°C
por 5 minutos. El tamaño esperado de los productos
de PCR para los genes en estudio fueron: 756 pb
para genero S. aureus, 310 pb para el gen mecA (21)
y 173 pb para el gen blaZ (Martineau et al., 2000).
Detección de los genes en estudio
Se preparó agarosa al 1% en buffer Tris-Borato
89mM, EDTA 2mM pH 8) (TBE). Una vez solidificada
la agarosa, se colocó en una cámara de electroforesis
y se aplicaron 5 µl de cada producto de PCR en los
bolsillos del gel. Se aplicó una corriente de 80 voltios
por 2 horas. Los geles se tiñeron con bromuro de etidio, y se observaron las bandas de ADN en un transiluminador ultravioleta marca UVP, modelo M20. Se
tomó fotografía con una cámara digital Olympus, modelo C-4000 Zoom.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La Figura 1 muestra el resultado del ensayo de
PCR de 7 de los 50 aislados clínicos de S. aureus analizados, distinguiéndose claramente los fragmentos de
ADN de los genes que se están estudiando. El gen
16S rDNA se incluyó como control del ensayo debido a
que este ADN debe estar presente en todas las muestras porque permite identificar que la bacteria es S. aureus y asegurar que la reacción de amplificación de
ADN por PCR está funcionando correctamente. El gen
mecA, que es el gen responsable de la resistencia a
oxacilina está presente en las muestras de los carriles
1, 2, 4, 5, 6 y 7. El carril 3 es una cepa resistente a
oxacilina que carece del gen mecA, mientras que la
posición 7 corresponde a una cepa sensible a oxacilina aun cuando es portadora del gen mecA.
En 28 de las 30 cepas del grupo SARM se demostró la presencia del gen mecA (93,33%), indicando que este gen, responsable de la producción de
una proteína modificada que no es reconocida por el
antibiótico; sigue siendo el principal mecanismo de re-
Figura 1. Ensayo para detectar el gen mecA en cepas de S. aureus analizadas. Se observan
fragmentos de ADN de los genes para identificar la especie S. aureus (rDNA 16S) y para identificar el
gen de resistencia a oxacilina (mecA). Cs: control de una cepa de referencia de S. Aureus
sensible a oxacilina; Cr: control de una cepa de referencia resistente a oxacilina. Del 1 al 7
corresponde a cepas en estudio. Se observa en el carril 3 una cepa resistente pero que carece
del gen mecA; en el carril 7 se muestra una cepa sensible a la oxacilina,
aunque fue detectado el gen mecA.
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sistencia a oxacilina en las bacterias aisladas en este
estudio. En la Tabla 2 se resumen los resultados obtenidos. Es importante resaltar que la presencia del
gen mecA confiere resistencia no solo a oxacilina,
sino a todos los antibióticos b-lactámicos o familia de
las penicilinas, lo cual limita las alternativas de tratamiento en individuos infectados con SARM (Martineau et al., 2000).
Tabla 2. Presencia de los genes mecA y blaZ
en cepas de SARM y SASM
Fenotipo de Genotipo
resistencia
SARM
SASM
Presente
Ausente
Total
mecA
28 (93,33%)
2 (6,66%)
30
blaZ
2 (6,66%)
28 (93,33%)
mecA
1 (5%)
19 (95%)
blaZ
0
0
20
Dos de las cepas SARM carecían del gen mecA
(6,66%), indicando que su mecanismo de resistencia
no se debe a la producción de la proteína modificada
PB2a. Aun cuando no se conocen todos los mecanismos posibles de resistencia diferentes de mecA, una
de las alternativas propuestas es la hiperproducción
de b-lactamasas debido a la presencia del gen blaZ,
por lo cual se investigó este gen. Efectivamente,
como se muestra en la Figura 2 y Tabla 2, el gen blaZ
fue detectado en estas cepas y es posible que un
gran exceso de b-lactamasa pueda hidrolizar, aunque
más lentamente, la estructura del anillo b-lactámico
de la oxacilina (conocida como resistente a la acción
de b-lactamasas), como ha sido propuesto por otros
autores (Baron, 1995).
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Como era de esperarse, la mayoría (95%) de las
cepas de S. aureus sensibles a oxacilina carecen de
los genes de resistencia estudiados; sin embargo, se
encontró que una de las cepas sensibles a oxacilina
(5%) contenía en su genoma el gen mecA (Figura 1,
línea 7). Estos resultados son de gran importancia
porque aun cuando por el método de difusión en disco se había demostrado que la cepa era sensible, el
hecho de que tenga el gen mecA indica que posteriormente esta bacteria puede desarrollar resistencia a
oxacilina al ser expuesta al antibiótico. Para apoyar
esta afirmación se pueden citar algunos estudios que
señalan que al incubar estas cepas fenotípicamente
sensibles, pero conteniendo el gen mecA en presencia de oxacilina, éstas desarrollan resistencia estable
e irreversible al antibiótico (Martineau et al., 2000).
Este aspecto es muy importante para la indicación de un tratamiento, porque si un paciente infectado
con una cepa fenotípicamente sensible a la oxacilina,
pero genotípicamente resistente (presencia de mecA),
es erróneamente tratado con oxacilina, el tratamiento
puede fallar. La detección del gen mecA como ensayo
de resistencia es altamente recomendada por algunos
autores, debido a que su expresión puede ser heterogénea cuando se hace por métodos fenotípicos, es decir, pudiera no expresarse o hacerlo en bajos niveles
(Strommenger et al., 2003; Al nakib et al., 2011).
Por último, a pesar de que la resistencia a oxacilina se pudo explicar en las cepas incluidas en este estudio por la presencia de los genes mecA o blaZ, se
debe resaltar que existen otros mecanismos de resistencia a antibióticos que aún no han sido bien caracterizados y que no fue posible incluir en este estudio.
En general, se ha encontrado que la mayoría de
cepas S. aureus resistente a oxacilina son adquiridas
Figura 2. Ensayo para analizar la presencia del gen blaZ que confiere información para la
producción de enzima b-lactamasa. M: marcador de referencia de fragmentos de mecA y blaZ
para comparación con las muestras. 1 y 3: las dos muestras resistentes a oxacilina que carecen
del gen mecA. Se analizó la presencia del gen blaZ, para orientar si el posible mecanismo de
resistencia a oxacilina se puede explicar por la superproducción de b-lactamasa; 2: se corrió
una de las muestras conteniendo el gen mecA.
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Presencia de los genes mecA y blaZ como mecanismos de desarrollo de resistencia a b-lactámicos...
por pacientes hospitalizados, pero cabe destacar que
9 de las cepas que contenían el gen mecA en este
estudio, provenían de pacientes de la comunidad, es
decir, que asistieron sólo a consultas ambulatorias en
el centro de salud. Esto tiene graves implicaciones en
materia de salud pública porque las cepas SARM parecen estar propagándose en las comunidades y no
están restringidas a los ambientes intrahospitalarios.
Entre las limitaciones que se presentaron para
el desarrollo de este estudio está que no se pudo llevar a cabo con todos los procedimientos recomendados para el análisis fenotípico. Por ejemplo, no se
pudo realizar el ensayo de concentración inhibitoria
mínima por el método automatizado VITEK ni la detección directa de la proteína PBP2A, que consiste en
una prueba de aglutinación en látex.
Otra limitación es el reducido número de cepas
analizadas, lo cual obedeció a insuficiencia en la disponibilidad presupuestaria de los laboratorios que facilitaron su infraestructura, reactivos y suministros
para el desarrollo de este estudio. Se recomienda dar
continuidad a esta investigación incluyendo un mayor
número de cepas de S. aureus, con el fin de caracterizar mejor la contribución de los genes en estudio al
patrón de resistencia a antibióticos en nuestra región.
CONCLUSIONES
La presencia del gen mecA es el principal mecanismo de resistencia a oxacilina en las bacterias aisladas en este estudio; sin embargo se puso en evidencia que la hiperproducción de b-lactamasas por la
expresión del gen blaZ puede explicar la resistencia a
oxacilina observada en cepas que carecen del gen
mecA.
Por último, la expresión de resistencia a oxacilina es de difícil interpretación por medio de métodos
fenotípicos, debido a una expresión variable del gen
mecA. El análisis de los genes mecA y blaZ contribuye a caracterizar el mecanismo de resistencia a antibióticos b-lactámicos.
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