Download modulación aguda del metabolismo de glucosa por efecto del

Profesor Patrocinante
Dr. Luis Felipe Barros O.
Centro de Estudios Científicos
(CECs)
Profesor Co-Patrocinante
Dr. Alejandro Reyes P.
Instituto de Bioquímica y
Microbiologia
Facultad de Ciencias
Universidad Austral de Chile
MODULACIÓN AGUDA DEL METABOLISMO DE GLUCOSA
POR EFECTO DEL LACTATO EN NEURONAS DEL BULBO
OLFATORIO
Tesis de Grado presentada como
parte de los requisitos para optar al
grado
de
Licenciado
en
Bioquímica y Título Profesional de
Bioquímico
FELIPE JULIO BAEZA LEHNERT
VALDIVIA – CHILE
2013
A mi madre Margarita, por su esfuerzo y preocupación constante en todos estos años de estudios, a la Dani,
mi hermana, quien se ha transformado en inspiración en los momentos de dificultad por ser un ejemplo de
dedicación y constancia, a mi padre Julio por haberme incentivado desde pequeño a descubrir el mundo en
una aventura constante, a mi amada Pía por ser mi pilar en estos últimos años de estudio y haberme
demostrado que lo esencial es realmente invisible a los ojos, y finalmente a la pequeña y queridísima Javi,
quien como una fiel compañera ha estado a mi lado en el laboratorio en una infinidad de experimentos en los
setups, entregándome la porción de inocencia necesaria que tiene un niño para interpretar mis resultados.
Gracias. FBL
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Felipe Barros O. por haberme abierto las puertas de su laboratorio y encontrar en
éste un lugar lleno de desafíos que hicieron gatillar en mí el amor por la labor científica,
cada una de sus enseñanzas, críticas y consejos sin duda han hecho de mí un mejor
científico en el paso por el laboratorio.
Así también debo agradecer a cada uno de los compañeros de labores y quienes hacen del
laboratorio un lugar placentero para trabajar y con quienes he compartido durante los
últimos dos años: Robin, Tamara, Rodrigo, Alejandro, Sebastián, Karin, Rocío, Ignacio,
Iván y todos los que han pasado por periodos más cortos; escucharlos y observar su trabajo
ha sido una gran privilegio en mi vida.
Por supuesto a cada uno de los profesores que participaron en mi formación como
estudiante, sin la atenta mirada y la agradable disposición para atender todo tipo de
consultas y problemas, con seguridad estas páginas no podrían haber sido escritas.
Esta tesis fue desarrollada en el Laboratorio de Biofísica y Fisiología Molecular
perteneciente al Centro de Estudios Científicos (CECs) y fue financiada por el proyecto
FONDECYT 1100936 bajo la responsabilidad del Dr. Felipe Barros O.
i
INDICE GENERAL
1.1
RESUMEN
1
1.2
SUMMARY
2
2
INTRODUCCIÓN
3
2.1
La importancia del lactato como sustrato energético
3
2.2
El lactato se incrementa en la zona de activación y difunde a otras zonas
del cerebro
5
2.3
El transporte de glucosa y lactato en neuronas
9
2.4
El bulbo olfatorio y el acoplamiento metabólico
9
2.5
Utilización de mediciones de FRET como herramienta de estudio
14
3
MATERIALES Y MÉTODOS
17
3.1
Materiales
17
3.1.1
Animales
17
3.1.2
Reactivos
17
3.2
Métodos
18
3.2.1
Cultivo primario de neuronas del bulbo olfatorio
18
ii
3.2.2
Transfección de los sensores de glucosa y lactato
19
3.2.3
Medición de glucosa y lactato
19
3.2.4
Medición de pH intracelular
26
3.2.5
Ensayo de transporte con 6-NBDG
26
3.2.6
Mediciones de Ca2+
26
3.2.7
Análisis estadístico
27
4
RESULTADOS
28
4.1
Cultivo primario de neuronas embrionales de bulbo olfatorio
28
4.1.1
Neuronas del bulbo olfatorio
28
4.1.2
Características morfológicas
29
4.2
Medición de glucosa y lactato intracelular en neuronas en cultivo
31
4.3
Efecto del lactato sobre el estado estacionario de glucosa
32
4.4
Efecto del lactato sobre células con estados estacionarios cercanos
a 0 mM glucosa
33
4.5
Efecto del lactato sobre el pH intracelular
35
4.6
Efecto del lactato sobre el transporte de glucosa
36
4.6.1
Captación de glucosa
36
iii
4.6.2
Captación de 6mM glucosa
39
4.6.3
Transporte de galactosa en presencia de glucosa
42
4.6.4
Medición del transporte de galactosa en presencia de manosa
45
4.6.4.1
La manosa es metabolizada y produce lactato intracelularmente
45
4.6.4.2
La manosa eficientemente transacelera el transportador de hexosa
48
4.6.4.3
El transporte de galactosa no varía en ausencia o presencia de lactato
48
4.6.5
Transporte de 6-NBDG
49
4.7
Metabolismo de glucosa
53
4.7.1
Metabolismo de glucosa medido con citocalasina-B
53
4.7.2
Medición del metabolismo de glucosa con el método de la tasa de relajación
56
4.8
El transporte no influye sobre el metabolismo neuronal
58
4.9
Evaluación de la producción de lactato de origen glicolítico
60
4.10
La transaceleración con piruvato produce una respuesta bifásica en el estado
estacionario de glucosa
60
5
DISCUSIÓN
64
5.1
El lactato es eficientemente captado por las neuronas
67
iv
5.2
El estado estacionario de glucosa puede ser modificado por cambios a nivel
del transporte o metabolismo
68
5.3
La tasa de transporte de glucosa no es afectada por el lactato
69
5.4
La tasa de metabolismo de glucosa es sensible a la presencia de lactato
75
5.5
El estado estacionario de glucosa responde de forma bifásica a la
perturbación con piruvato
77
6
REFERENCIAS
84
7
ANEXO
92
7.1
Activaciones oscilatorias a nivel glicolítico en neuronas
92
7.1.1
Oscilaciones espontáneas en los niveles de glucosa en neuronas
92
7.1.2
Oscilaciones espontáneas en los niveles de lactato en neuronas
93
v
INDICE FIGURAS
Figura 1
Regulación de la glicólisis por las enzimas glicolíticas
Figura 2
Diagramas de los flujos de glucosa y lactato para las dos teorías
4
propuestas para el acoplamiento metabólico cerebral
Figura 3
Configuración celular del bulbo olfatorio
Figura 4
Configuración del glomérulo y la relación entre los distintos
6
11
tipos celulares
13
Figura 5
Flujos de los metabolitos
15
Figura 6
Esquema de los sensores y medición de fluorescencia en célula única
20
Figura 7
Esquema setup experimental
23
Figura 8
Mediciones control y cálculo de razones y concentración
24
Figura 9
Evolución en el tiempo de los cultivos de bulbo olfatorio
30
Figura 10
Efecto del lactato sobre el estado estacionario de glucosa
34
Figura 11
Cuatro posibles explicaciones del efecto de lactato sobre la concentración
de glucosa en neuronas
Figura 12
37
Medición del efecto del lactato sobre la captación de glucosa
en el rango bajo
38
vi
Figura 13
Medición del efecto del lactato sobre la captación de glucosa
en el rango alto
Figura 14
Medición del efecto del lactato sobre el transporte de galactosa
en presencia de glucosa
Figura 15
43
Manosa como sustrato energético y transacelerador del
transportador GLUT3
Figura 16
40
46
Medición del efecto del lactato sobre el transporte de galactosa
en presencia de manosa
50
Figura 17
Medición del efecto del lactato sobre el transporte de 6-NBDG
52
Figura 18
Medición del efecto del lactato sobre el metabolismo con citocalasina-B
54
Figura 19
Medición del efecto del lactato sobre la tasa de relajación
57
Figura 20
Cambios extracelulares de glucosa no afectan el metabolismo
59
Figura 21
Consumo y producción de lactato
61
Figura 22
Efecto del piruvato sobre el estado estacionario de lactato y glucosa
63
Figura 23
Modelo propuesto para el efecto del lactato
81
Figura A1
Oscilaciones metabólicas espontaneas en neuronas
94
vii
INDICE TABLAS
Tabla I
Resumen de las propiedades de los azúcares utilizados durante
la experimentación
Tabla II
66
Resumen de los resultados para las tasas de transporte y metabolismo
en cada protocolo realizado
74
viii
LISTRA ABREVIATURAS
AM
acetoximetil-éster
ANLS
Lanzadera de lactato astrocito-neurona
BCECF
2´,7´-bis(carboxietil)-5(6)-carboxifuoresceina
CFP
proteína fluorescente cian
EDTA
ácido etilendiaminotetraacético
FRET
transferencia de energía de resonancia
GABA
ácido γ-aminobutírico
Gal
galactosa
GAPDH
glicerladehido fosfato deshidrogenasa
Glc
glucosa
GLUT
transportador de glucosa
ix
HEPES
[N-(2-hidroxietil)piperazina-N´-(2-ácido etansulfónico)]
KRH
tampón Krebs-Ringer Hepes
Lac
lactato
LDH
lactato deshidrogenasa
Man
manosa
MCT
transportador de monocarboxilatos
NAD+
dinucleótido de nicotinamida y adenine
NADH
dinucleótido de nicotinamida y adenina reducido
NALS
lanzadera de lactato neurona-astrocito
PET
tomografía de emisión de positrones
Pir
piruvato
ROS
especies reactivas del oxígeno
SBF
suero bovino fetal
U.A
unidades arbitrarias
YFP
proteína fluorescente amarilla
6-NBDG
6-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il)amino)-6-deoxiglucosa
1
1. RESUMEN
La glucosa y el lactato son ambos combustibles para los procesos neuronales tanto en reposo
como en activación. Ha sido demostrado que el lactato es capaz de sostener la actividad sináptica
de neuronas y de actuar como un potente neuroprotector ante los incrementos de estrés oxidativo.
En paralelo durante los últimos años, los astrocitos el otro gran grupo celular a nivel cerebral ha
tomado relevancia desde el punto de vista de su función sostenedora. En nuestro laboratorio se ha
observado que el K+ y más tardíamente el glutamato, son las señales que incrementan la glicólisis
en los astrocitos y que estos estarían exportando el lactato hacia el medio extracelular, el que es,
según datos de otros grupos, capaz de difundir y llegar hasta zonas del tejido que aún no han sido
estimuladas.
En esta tesis se investigó la posibilidad que el lactato extracelular pudiera ejercer efectos sobre el
metabolismo de la glucosa en neuronas en cultivo primario. Se eligió el bulbo olfatorio dada la
inminente disponibilidad de un ratón transgénico que permitirá medir el metabolismo de la
glucosa en esa región del cerebro.
Los resultados mostraron que el lactato genera una inhibición aguda del metabolismo de la
glucosa, pero no ejerce un efecto mayor sobre el transporte de la hexosa, lo que podría ser una
señal metabólica para generar una redistribución de la glucosa, desde tejidos no activados que
sólo han sido expuestos a lactato producto de la difusión de éste, hacia la zona activada.
2
1.1 SUMMARY
Glucose and lactate are both fuels for the neuron processes such as in rest or during activation. It
has been shown that lactate is capable of sustain the synaptic activity in neurons beside to act as a
potent neuroprotector in the presence of increased oxidative stress. In parallel during the last
years, astrocytes the other abundant cellular group in the brain has increased in relevance in the
point of view of its supportive function. In our laboratory it has been observed that K+ and later
on glutamate are signals which increase glycolysis in astrocytes and they might be exporting this
lactate to the extracellular medium, which is capable, according to other groups ‘data, to spread
over and travel until places in the tissue which have not been stimulated yet.
In this thesis was investigated the possibility that extracellular lactate might produce any effect
over the glucose metabolism in neuron´s primary cultures. It was chosen the olfactory bulb
because of the imminent available of a transgenic mouse which will permit to measure the
glucose metabolism in that brain region.
The results shown that lactate generate an acute inhibition over the glucose metabolism, but do
not produce any major effect over the transport of the hexose, which could be a metabolic signal
for generate a redistribution of glucose from non- activated tissue which has only been exposed
to lactate by its own diffusion, towards the activated zone.
3
2. INTRODUCCION
El metabolismo energético cerebral es un área de gran interés básico y clínico. Se sabe que la
oxidación de la glucosa es la principal fuente energética para el cerebro adulto, el cual es un
órgano altamente demandante. Se conocen las vías metabólicas responsables del metabolismo de
glucosa (figura 1), pero los mecanismos celulares y moleculares que regulan la utilización de la
glucosa son menos conocidos. Aún cuando el cerebro constituye solo el 2% del peso corporal, un
20% del gasto energético corporal ocurre en él. Por su parte el gasto energético neuronal es 3
veces mayor que el astrocitario, con un consumo de 3,4x108 ATPs/s versus 1x108 ATPs/s para
astrocitos (Attwell y Laughlin, 2001). En neuronas el gasto energético gatillado tras estimulación
eléctrica (4Hz) tiene como componentes principales
los
potenciales de acción (15,4x108
ATPs/s) y los potenciales post-sinápticos (13,0x108 ATPs/s) que corresponden a un 47% y un
34% de la demanda total, siendo en ambos casos el gasto principalmente producto de la bomba
de Na+/K+, que restaura el gradiente de iones disipado por los potenciales eléctricos (Atwell y
Laughlin, 2001). Por lo tanto, no es difícil de suponer de estos datos, que la regulación del
metabolismo energético es de fundamental importancia para las neuronas en función de poder
mantener constante el paso de información de forma rápida, eficiente y con la necesidad de
perpetuar esta propiedad a lo largo de toda una vida.
2.1 La importancia del lactato como sustrato energético
Experimentos in vitro han informado que las neuronas pueden obtener el ATP producto del
metabolismo tanto de glucosa como de lactato (Pellerin, 1998) y que ambos son capaces de
4
Figura 1. Regulación de la glicolisis por las enzimas glicolíticas. Según la bioquímica clásica
la glicólisis está regulada a nivel de 3 enzimas que catalizan reacciones irreversibles:
hexoquinasa, fosfofructoquinasa y piruvato quinasa (en negrita). La enzima gliceraldehído 3-P
deshidrogenasa utiliza NAD+ como cofactor el que es re-oxidado a NADH por la enzima lactato
deshidrogenasa en el proceso de formación de lactato a partir de piruvato.
5
mantener la actividad eléctrica y sináptica (Schurr y Gozal, 2012). A su vez, ha sido observado
que durante actividad neuronal hay un aumento de lactato extracelular acompañado de un
aumento del consumo de glucosa y oxígeno, hallazgos que junto a muchos otros han sido el
motor de un sinnúmero de estudios cuyo objetivo es entender los mecanismos implicados en
estos incrementos, y así validar o refutar el modelo convencional del metabolismo energético
cerebral. Este propone a la glucosa como el combustible de preferencia en los procesos
oxidativos de la neurona, teoría que ha sido denominada como la lanzadera de lactato neuronaastrocito (figura 2 A) (NALS por sus siglas en inglés). Según el modelo NALS, el aumento de
lactato extracelular es producto del consumo de glucosa por las neuronas, las que producirían
lactato el que sería el combustible preferencial de los astrocitos. En oposición a ésta, Pellerin y
Magistretti (Pellerin y Magistretti, 1994) propusieron posteriormente una nueva hipótesis en la
cual la dirección de la lanzadera es inversa, es decir el lactato es producido por los astrocitos y
consumido por las neuronas: la teoría de la lanzadera de lactato astrocito-neurona (figura 2 B)
(ANLS por sus siglas en ingles). Hoy en día numerosos grupos de investigación buscan
evidencias que permitan dirimir entre estos dos modelos.
2.2 El lactato se incrementa en la zona de activación neuronal y difunde a otras zonas del
cerebro
El traspaso de información de una neurona a otra se efectúa en el espacio sináptico, y se produce
fundamentalmente gracias a la liberación de glutamato por la neurona presináptica el cual difunde
6
Figura 2. Diagramas de los flujos de glucosa y lactato para las dos teorías propuestas para
el acoplamiento metabólico cerebral. Astrocitos y neuronas son los grupos celulares más
importantes a nivel cerebral, su acoplamiento metabólico es reconocido, pero la dirección de los
flujos aún se encuentra en debate. En A se observa un diagrama de la teoría de la lanzadera de
7
lactato de neurona-astrocito (NALS) y en B la lanzadera de lactato de astrocito-neurona (ANLS).
Las flechas verdes indican el flujo de la glucosa y el lactato.
a través de este espacio y se une a los receptores glutamatérgicos de la neurona post-sináptica.
Este proceso se encuentra estrechamente asociado a los astrocitos que rodean todo el espacio en
donde se produce el paso de información y que tienen como misión, entre otras muchas, la de
captar el glutamato y el potasio, catión que se incrementa rápidamente en el medio extracelular
durante la actividad sináptica. Estudios publicados han mostrado como el glutamato induce un
rápido y reversible aumento en el transporte de glucosa en astrocitos (Loaiza et al., 2003), como
también fue reportada una inhibición aguda del transporte de glucosa en neuronas hipocampales
(Porras et al., 2004). Así también, recientemente en nuestro laboratorio se ha demostrado que un
aumento de la concentración extracelular de potasio es capaz de inducir una activación aguda de
la glicólisis en astrocitos (Bittner et al., 2011), proceso que se produce
producto de la
despolarización y a través de la alcalinización intracelular dependiente del cotransportador
electrogénico de sodio/bicarbonato NBCe1 (Ruminot et al., 2011). El incremento glicolítico tiene
como consecuencia el incremento de la exportación de lactato desde los astrocitos hacia el medio
extracelular (Ruminot et al, datos no publicados), quedando de esta forma disponible para ser
captado y utilizado como sustrato energético para las neuronas, las que son consumidoras
preferenciales de lactato frente a periodos de alta disponibilidad del monocarboxilato (Gutiérrez
et al, en preparación), mismo resultado que se han descrito utilizando mediciones de lactato y
glucosa marcados radiactivamente (Bouzier-Sore et al, 2003, 2006). Por otra parte, al contrario de
cómo sucede con el glutamato que es eficientemente captado por los astrocitos asociados a la
hendidura sináptica, el lactato tiene la capacidad de difundir en el tejido cerebral alcanzando
zonas más lejanas con respecto al punto de activación (Cruz et al, 2007). En esta zona las células
8
sólo sienten el incremento del lactato sin necesidad de gatillar en ellas un potencial de acción, de
manera que este aumento solo pudiese ser una señal para redistribuir la glucosa a zonas en donde
la actividad es mayor, por lo cual el estudio del efecto del lactato como sustrato energético en
neuronas no activadas resulta ser una arista importante en el entendimiento del metabolismo
energético cerebral.
En astrocitos de cultivo primario ha sido demostrado que el lactato genera un efecto inhibitorio
agudo a nivel glicolítico (Sotelo-Hitschfeld et al., 2012) presumiblemente por un proceso de
retroalimentación negativa que regularía la producción de lactato en estas células, pero nada ha
sido informado en cuanto a los efectos del lactato sobre el metabolismo glicolítico en neuronas.
Bouzier-Sore y colaboradores utilizando cultivos primarios de neuronas sin astrocitos ha
demostrado que el lactato es eficientemente metabolizado por las neuronas (Bouzier-Sore et al.,
2003, 2006), pero el efecto agudo sobre el metabolismo glicolítico del monocarboxilato no ha
sido estudiando, lo cual constituye un dato fundamental para poder entender si el lactato no es
solo eficientemente metabolizado, sino que también un sustrato energético preferencial de las
neuronas.
Estudios in vivo y en rebanadas hipocampales han mostrado también un efecto inhibitorio del
lactato sobre la actividad neuronal (Gilbert et al., 2006), lo que asociado al estado metabólico,
una vez más sitúa al lactato como una señal que disminuiría el consumo de glucosa en pos de un
incremento en la utilización de lactato como combustible.
9
2.3 El transporte de glucosa y lactato en neuronas
El transporte de glucosa y lactato es un proceso saturable que puede ser descrito por un parámetro
de afinidad, Km, y un parámetro de capacidad, Vmax. En neuronas, los transportadores para
glucosa y lactato son GLUT3 y MCT2 respectivamente, con afinidades más altas por sus
sustratos (Km GLUT3 1-2 mM, Km MCT2 0.5 mM), en comparación con los astrocitos (Km
GLUT1 5-8 mM, Km MCT1 3-5 mM, Km MCT4 15-30 mM) (Barros y Deitmer, 2010). La
glucosa es transportada por el transportador de glucosa (GLUT), el cual es pasivo, uniporte y
bidireccional, siendo particularmente en neuronas considerado como un transportador de alta
afinidad, mientras que el lactato es co-transportado junto a un protón por el transportador de
monocarboxilatos (MCT) lo que hace que el transporte del lactato afecte el pH intracelular y
además sea afectado por las condiciones de pH. Aún cuando la dirección de estos flujos está
determinado por las gradientes químicas,
las neuronas están mejor preparadas para tomar
combustibles, ya que si bien es cierto, la Km no es el único factor que informa la capacidad
celular de utilizar combustibles y tampoco es un indicador directo de la afinidad entre el
transportador y el sustrato (Barros y Deitmer, 2007), los valores informados en la literatura
posicionan a las neuronas, al poseer afinidades aparentes más altas por sus sustratos, como mejor
equipadas para soportar periodos de disminución de combustible y para reaccionar rápidamente a
sus propios aumentos en demanda.
2.4 El bulbo olfatorio y el acoplamiento metabólico
Considerando la importancia de la glucosa y el lactato como combustibles neuronales, durante el
desarrollo de esta tesis se midieron los efectos del incremento de lactato extracelular en el
10
metabolismo y transporte de glucosa en neuronas, a través de la medición de fluorescencia de un
nanosensor de glucosa y otro de lactato en neuronas en cultivo primario, con un microscopio
confocal equipado para realizar mediciones de FRET. Durante el proyecto se utilizó como
modelo el bulbo olfatorio ya que la estructura y conectividad sináptica ha sido muy bien descrita
in vivo en la literatura y a su vez existe la posibilidad de escalabilidad en la aproximación
fisiológica de los fenómenos estudiados al contar en el laboratorio con un ratón transgénico que
expresa el nanosensor de glucosa en las células mitrales del bulbo, con lo cual luego de realizar
una caracterización y aproximación in vitro de los fenómenos, se podrán realizar análisis in situ
para de esta forma complementar la información de ambas técnicas.
El bulbo olfatorio es una estructura altamente laminada y sus distintos tipos celulares pueden ser
fácilmente identificados por su posición en estas láminas las que
forman dos capas
funcionalmente distintas (figura 3). Una capa nerviosa superficial constituida por células gliales y
axones desmienilizados de las neuronas olfatorias sensitivas y una capa interna constituida por
los glomérulos. En esta última capa es donde se produce la sinapsis entre los terminales de las
neuronas olfatorias sensitivas y las dendritas de las células periglomerulares y principales (Leqoc
et al., 2009). La fisiología y la red de señalización a través de los distintos grupos celulares y los
puntos de activación en las distintas posiciones del bulbo y el cerebro ha sido claramente descrita
y mapeada en mamíferos (Mori et al., 2011). En el inicio el proceso de señalización comienza
cuando las neuronas receptoras sensitivas detectan un olor, el mensaje viaja a través de los
axones de estas células hasta el glomérulo, el que sólo recibe la información de solo un tipo de
olor y que puede provenir de muchos axones de distintas
11
Figura 3. Configuración celular simplificada del bulbo olfatorio. La activación de las células
sensibles al mismo odorante a nivel del epitelio sensitivo generan la activación de sólo un
glomérulo a nivel de la capa glomerular del bulbo olfatorio. El estimulo viaja a través del tejido
olfatorio el cual está constituido por varias capas en relación a la presencia de dendritas
primarias, somas de las células mitrales o los axones que luego se proyectan hasta la corteza
olfatoria.
12
neuronas receptoras en el epitelio sensitivo. A continuación, en el glomérulo se produce la
sinapsis entre las neuronas pre sinápticas (neuronas sensitivas) y las neuronas periglomerulares y
principales (mitrales o en penacho). Esta sinapsis es glutamatérgica en ambos casos (Trombley et
al, 2003), pero a continuación se produce la liberación de GABA por parte de las neuronas
periglomerulares, el cual es captado a través de receptores GABAB por la célula olfatoria
sensitiva inhibiendo la liberación de glutamato (figura 4). Por otro lado, un efecto característico
del glomérulo del bulbo olfatorio son las sinapsis dendrodendrítica excitatoria que producen las
células mitrales o en penacho sobre las células periglomerulares, o la inhibitoria que provocan las
neuronas periglomerulares sobre las mitrales o en penacho, generando de esta manera un circuito
que auto-regula el excesivo gasto energético a nivel glomerular que se produciría producto de
una señal excitatoria intensa (Shepherd, 2007). Por otra parte el glutamato activa a los astrocitos
presentes en el glomérulo activando el metabolismo glicolítico e iniciando el proceso de reciclaje
de glutamato (Gurden et al., 2006). Estudios tempranos de fMRI mostraron señales de BOLD
(Blood oxygen level dependence) tanto en la capa nerviosa como en la glomerular. Además
Chaigneau y colaboradores, informaron que la red capilar es mucho más densa en la capa
glomerular que en la nerviosa, y que es además una de las más densas del cerebro (Chaigneau et
al., 2003). Todos estos datos se relacionan con la información que luego de estimulación
olfativa el oxigeno es principalmente consumido en la zona glomerular en donde la red capilar es
mayor así como la densidad de mitocondrias (Lecoq et al., 2009). En conjunto, lo anterior es
sugestivo de una producción de ATP a través de un metabolismo fundamentalmente oxidativo en
el glomérulo, mientras que en la capa nerviosa el ATP seria producto del metabolismo glicolítico
(Lecoq et al, 2009).
13
Figura 4. Configuración del glomérulo y la relación entre los distintos tipos celulares. El
principal punto de transducción de señales a nivel olfatorio se produce en el glomérulo en donde
se producen estimulaciones glutamatérgicas e inhibiciones mediadas por GABA entre los
distintos tipos de células que constituyen esta unidad. El glutamato liberado por el axón de la
neurona sensitiva genera 3 respuestas en: 1- células periglomerulares (axones y dendritas ya que
los somas de estas células se encuentran rodeando al glomérulo), 2 - astrocitos y 3- en la dendrita
primaria de la neurona post-sináptica.
14
2.5 Utilización de mediciones de FRET como herramienta de estudio
Los estudios in vivo entregan datos complejos de comprender y analizar los cuales necesitan del
complemento de información in situ e in vitro. El estudio del metabolismo in vitro ha sido
llevado a cabo principalmente con isótopos radioactivos y metodologías de baja resolución
espacial y temporal. A partir de la utilización de nanosensores basados en FRET, este problema
se ha solucionado, así como también se ha logrado la medición de células individuales en
cultivos. Así con esta metodología solo basta entender cuáles son los flujos que mantienen los
estados estacionarios para cada uno de los metabolitos y de ésta forma entender cómo diversos
estímulos ejercen los cambios sobre estos flujos y el estado estacionario tanto para la glucosa
como para el lactato (figura 5) y determinar así tasas de medición del transporte y el metabolismo
glicolítico fundamentalmente (Bittner et al., 2010).
Desde el punto de vista de las proyecciones de este trabajo de tesis y la asociación clínica de esta
investigación, se ha observado que la disfunción del bulbo olfatorio está asociada a varias
enfermedades neurodegenerativas, tales como el Parkinson y el Alzheimer (Farso et al, 2005). Al
mismo tiempo se ha descrito que en estas enfermedades neurodegenerativas el metabolismo
energético está de alguna forma disociado (Allaman et al 2010, Chen et al 2006, Arnaiz et al
2001), con lo cual el estudio del metabolismo de la glucosa en el bulbo olfatorio se transforma en
un desafío y un primer paso en el descubrimiento de cómo los mecanismos asociados al
metabolismo energético influyen sobre estas enfermedades y la posible formulación de
estrategias novedosas para combatirlas.
15
Figura 5. Flujos de los metabolitos. Tanto la glucosa como el lactato son mantenidos
intracelularmente por diversos procesos que generan un equilibrio dinámico conocido como
estado estacionario. (A) Representación de los dos procesos que mantienen el estado estacionario
de la glucosa: transporte y metabolismo. La manipulación de cada uno de ellos genera cambios
en la glucosa en el tiempo de la manera que esta expresado en la ecuación en la derecha. (B)
Variables que mantienen el estado estacionario para el lactato intracelular entre las que se
distinguen: el transporte de lactato, el consumo y el lactato metabólico proveniente de la
oxidación glicolítica de glucosa, tal como se describe en la ecuación diferencial a su derecha.
Para ambos flujos el transporte de glucosa y lactato se mantiene en equilibrio entre un importe y
exporte del correspondiente sustrato. Para el transportador de monocarboxilatos no se ha
considerado el gradiente de protones a modo de simplificación en la definición de los flujos.
16
Considerando que el lactato es un eficiente sustrato para las neuronas, que la adición de lactato
inhibe la actividad eléctrica neuronal y que en astrocitos el lactato inhibe agudamente la glicólisis
se plantea la siguiente hipótesis:
“Variaciones en la concentración del lactato extracelular inducen cambios agudos en el
transporte y metabolismo de la glucosa en neuronas del bulbo olfatorio en cultivo
primario.”
Objetivo General
Determinar el efecto del cambio de lactato extracelular sobre el estado estacionario de
glucosa en cultivos primarios de neuronas de bulbo olfatorio
Objetivos Específicos
1.1 Montar y caracterizar cultivos primarios de neuronas de bulbo olfatorio
1.2 Medir los niveles intracelulares de glucosa y lactato en neuronas en cultivo
1.3 Evaluar el efecto de los cambios de lactato extracelular sobre el transporte de glucosa
en neuronas en cultivo
1.4 Evaluar el efecto de los cambios de lactato extracelular sobre el metabolismo de la
glucosa en neuronas en cultivo
17
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Materiales
3.1.1 Animales
En este estudio se utilizaron bulbos olfatorios de embriones de ratón cepa B6B/CBA con 17,5
días de gestación, animales que fueron mantenidos a temperatura ambiente (20±2)°C, en un ciclo
día/noche de 12 horas y con acceso libre a comida y agua en las dependencias del bioterio del
Centro de Estudios Científicos. Los experimentos fueron aprobados y estuvieron estrictamente
ceñidos a los estándares del comité de uso y cuidado de animales del Centro de Estudios
Científicos.
3.1.2 Reactivos
El azúcar fluorescente 6-NBDG y el acido plurónico se obtuvieron de Molecular Probes (Eugene,
OR, EE.UU.). El sulfato de magnesio, bicarbonato de sodio, D-glucosa, L-lactato, lactato de
sodio y buffer HEPES de Sigma Chemical Co. El resto de sales tales como el cloruro de sodio,
cloruro de potasio, cloruro de calcio se obtuvieron de Merck & Co., Inc. El medio Neurobasal,
suplemento B27, penicilina-estreptomicina, fungizona y tripsina –EDTA fueron obtenido en
Gibco , el suero bovino fetal de Hyclone y la lipofectamina 2000 y la sonda sensible a pH
BCECF-AM en Invitrogen. Los anticuerpos utilizados para la inmunodetección fueron antiNeuN
y antiGFAP de Millipore y Dako respectivamente, por su parte los anticuerpos secundarios
fueron Alexa-488 y Alexa-546 ambos de Jackson.
18
3.2 Métodos
3.2.1 Cultivo primario de neuronas del bulbo olfatorio
Ratones con 17,5 días de gestación fueron sacrificadas por dislocación cervical. Posteriormente, y
a través de una incisión en el vientre se extrajeron los embriones los cuales fueron sacrificados
por decapitación y las cabezas fueron depositadas en medio HANK´S (100µM HEPES ácido,
1,36µM NaCl, 74µM KCl, 50µM Glucosa, 44µM KH2PO4, rojo fenol, pH 7.4) con 102UI – 102
µgmL penicilina-estreptomicina y 2,5µg/mL fungizona a 4°C.
A continuación se obtuvieron bulbos olfatorios libres de meninges a través de microdisección.
Posteriormente el tejido fue digerido con tripsina-EDTA 1X durante 5 min a 37°C. La reacción se
detuvo con la adición de medio Neurobasal-B27 10mM glucosa suplementado con 5% SBF,
2mM piruvato, 1mM glutamina, 2,5 µg/mL fungizona, 10 2UI – 102 µg/mL penicilinaestreptomicina.
Luego se procedió a realizar disgregación mecánica de los tejidos, obteniéndose células
cerebrales en suspensión, una mezcla de neuronas y astrocitos, las cuales fueron plaqueadas
sobre cubreobjetos de 25 mm previamente tratados con poli-L- lisina (1g/L) en medio Neurobasal
B27 10mM glucosa, 5% SBF y se incubó por 120 minutos en una atmósfera artificial con 5%CO 2
– 95% aire a 37°C. El medio fue reemplazado cumplido el periodo de incubación por medio
Neurobasal suplementado con 2mM glutamina, 1mM piruvato, 2% B27, 2,5 µg/ml fungizona,
102UI – 102 µg/mL penicilina-estreptomicina.
Las células fueron utilizadas entre los días 14 y 16 de realizado el cultivo con un 60-80% de
confluencia por placa. El medio Neurobasal fue parcialmente reemplazado cada 3 días.
19
3.2.2 Transfección de los sensores de glucosa y lactato
Entre los días 4 y 5 post cultivo, fueron transfectados el sensor de glucosa o lactato mediante el
método de lipofección con lipofectamina 2000
Las placas fueron lavadas en dos oportunidades con PBS 1X pH 7,4, luego de este proceso se
agregó el medio de lipofección en medio Neurobasal - B27 10mM glucosa suplementado con
2mM glutamina. Las placas se incuban entre 4-5 horas en una atmosfera artificial de 5% CO2 y
95% O2. Posteriormente se cambia el medio por medio Neurobasal B-27 10mM glucosa
suplementado con 2mM piruvato, 1mM glutamina, 2,5 µg/mL fungizona, 10 2UI – 102 µg/mL
penicilina- estreptomicina.
3.2.3 Medición de glucosa y lactato
La medición de la glucosa y lactato se realizó a través de la fluorescencia emitida por los
nanosensores FLII12glu700µΔ6 (figura 6 A-B) o LACONIC (figura 6 C-D) respectivamente.
Estos nanosensores son capaces de sensar las fluctuaciones de glucosa o lactato intracelular a
través de la técnica de transferencia de energía resonante de Förster (FRET) al poseer un dominio
central de unión a glucosa o lactato y dos proteínas fluorescentes (una en cada extremo) capaces
de realizar la transferencia de energía.
Las células fueron medidas a temperatura ambiente (22-25 °C) en una solución gaseada con 95%
aire y 5% CO2 con lo que se logró una concentración de oxígeno en el buffer de perfusión de 7,6
mg/l, medido con la sonda de oxígeno WTW 340i. El microscopio confocal utilizado fue un
20
Figura 6. Esquema de los sensores y medición de fluorescencia en célula única. En (A) se
observa el sensor de glucosa FLII12glu700µΔ6 en donde se distingue en gris la proteína de unión
a glucosa y en sus extremos ambas proteínas fluorescentes CFP e YFP. Sin ligando unido al
sensor la eficiencia de FRET está muy disminuida, lo cual se revierte cuando el sustrato se une y
genera un cambio en la configuración del sensor con lo que se incrementa la transferencia de
energía de CFP a YFP. (B) Imágenes de ambos canales, se puede ver como la expresión del
21
sensor genera un patrón de exclusión nuclear. (C) Esquema del sensor de lactato LACONIC
constituido por el segmento de sensing unido en cada extremo a las proteínas mTFP y Venus.
Este sensor es inversamente proporcional a la concentración de metabolito, al tener una alta
eficiencia de FRET al encontrarse vacio el sitio de sensing, situación que cambia cuando se une
una molécula. (D) Imagen de fluorescencia para ambas proteínas en neuronas expresando el
sensor LACONIC, se observa la exclusión del sensor.
22
Olympus FV1000 equipado con un objetivo de inmersión en agua de 20x (N.A. 1.0) y un laser
solido de 440nm (figura 7). Alternativamente, las células fueron analizadas con un equipo
Olympus BX51WI con un objetivo 40x de inmersión en aceite (N.A. 1.3) o con un objetivo 20X
de inmersión en agua (N.A. 0.95). Los microscopios cuentan con monocromadores CAIRN
(Faversham, UK) y una camara Hamatsu Orca asociada al software kinetics y una cámara
Rollera controlada con el software Metafluor, en orden respectivo con los dos microscopios. Para
las mediciones de la razón de fluorescencia las células fueron excitadas a 430nm por 0,2 -0,8 s.
La emisión fue dividida con un optosplit CAIRN, equipado con filtros de paso de banda a 480 ±
20 nm (CFP y mTFP) y 535 ± 15 nm (GFP y Venus). Los datos fueron presentados como la
razón de fluorescencia entre la emisión de CFP o mTFP y la emisión de YFP o Venus, en orden
respectivo para los sensores de glucosa y lactato, y fueron normalizadas con respecto a la razón
de la concentración mínima de glucosa intracelular para el sensor FLII12glu700µΔ6 (figura 8 A) y
con la minima concentración intracelular de glucosa y lactato para el sensor LACONIC (figura 8
B.
Los ensayos se realizarán con un sistema de perfusión utilizando tampón Krebs Ringer Hepes
(KRH en mM: NaCl 136, KCl 3, MgSO4 1.25, CaCl2 1.25, HEPES 10, glucosa 2, lactato 1, pH
ajustado a 7.4 con NaOH) o bien tampón Krebs Ringer Hepes gasificado con 95% O 2/5%CO2
(KRH en mM: NaCl 112, KCl 3, MgSO4 1.25, CaCl2,HEPES 10, NaHCO3 24, glucosa 2, lactato
1, pH ajustado a 7.2 con NaOH)
23
Figura 7. Esquema Setup experimental. Los covers con las células en cultivo son montados
sobre una cámara asociada a un sistema de perfusión abierto en donde las células son expuestas a
distintos buffers, los que son luego extraídos por medio de una bomba peristáltica. Las
mediciones se realizan a través de un microscopio confocal en donde la luz proveniente de una
lámpara de xenón es difractada y seleccionada por un monocromador para luego pasar por un
primer filtro dicroico (1) reflejando solo la luz por debajo de los 440nm. A continuación la luz
pasa por el objetivo (2) el que luego recibe la emisión de ambas proteínas fluorescentes. En (3)
un segundo filtro dicroico separa las señales para finalmente pasar a través de los filtros de
emisión para CFP /mTFP (4) y YFP/Venus (5). Ambas señales son captadas por una cámara
manejada por un software que entrega un resultado a tiempo real durante el experimento.
24
Figura 8. Mediciones control y calculo de razones y concentración.
Las señales de
fluorescencia tanto para CFP o mTFP (cian) como para YFP o Venus (verde agua) se grafican
para ambos sensor: glucosa (A) y lactato (B). Con los valores se calcula la razón de la manera
que se encuentra expresada en la parte baja de los cursos temporales para cada uno de los
sensores. Para el sensor de glucosa se ha fabricado una curva de calibración con lo que a través
25
del conocimiento de la máxima razón de cambio del sensor (Rmax) y el valor de la razón al
realizar una calibración interna generando un vaciamiento de glucosa intracelular (Ro) se logra
calcular la concentración intracelular de glucosa. Kd corresponde a la constante de disociación
del sensor por su sustrato.
26
3.2.4 Medición de pH intracelular
Se utilizó la sonda comercial sensible a concentración de protones, BCECF AM en una dilución
de 1000X. La carga de esta sonda en los cultivos neuronales se realizó a continuación de las
mediciones de glucosa o lactato con los sensores anteriormente descritos. El periodo de
incubación estándar es de 5 minutos en una atmosfera gasificada al 95%aire/ 5% CO2.
La fluorescencia del BCECF se monitoreó excitando a 440/490 nm, colectando la emisión a 535
nm en el mismo microscopio Olympus BX51 equipado como fue descrito anteriormente. Una
perfusión similar a la detallada en el punto anterior fue utilizada.
3.2.5 Ensayo de transporte con 6-NBDG
Los ensayos de transporte de 6-NBDG fueron realizados en tampón HEPES. Se cargaron 150µM
6-NBDG y se realizó el curso temporal de captación de 6-NBDG en un microscopio Confocal
Olympus FV1000 con un objetivo de 60X. La excitación de la sonda se realizó con un laser a
488 nm y la emisión fue colectada a 505-550 nm. La concentración intracelular de hexosa fue
calculada a partir de la comparación de la fluorescencia intracelular y la señal fuera de la célula.
3.2.6 Mediciones de Ca2+
Las células fueron cargadas por un periodo de 30 minutos con 4 µM Fluo-4 en una atmósfera con
un 5%CO2/95% aire en tampón KRH/HCO3- suplementado con 2mM glucosa y 1mM lactato. El
lavado se realizó con el mismo tampón en tres oportunidades. Posteriormente se utilizó un
27
protocolo de excitación de la sonda cada 2 segundos con un laser de 488nm y la emisión fue
captada a los 505-550nm.
3.2.7 Análisis estadístico
Los resultados son presentados como promedios y/o promedios normalizados ± error estándar.
Para los análisis estadísticos y de regresiones lineales se utilizó el programa computacional
Sigma Plot (Jandel). Las diferencias en los valores normalizados fueron evaluadas de manera
pareada con la prueba t-student. En los análisis estadísticos se consideró significativa p < 0,05
28
4. RESULTADOS
4.1 Cultivo Primario de neuronas embrionales de bulbo olfatorio.
4.1.1 Neuronas del Bulbo Olfatorio
El bulbo olfatorio histológicamente está constituido en base a una estructura laminar, en donde se
distinguen
principalmente cinco porciones: 1) la de las fibras sensoriales aferentes en el
segmento más externo, 2) la capa glomerular que es además la unidad funcional de transmisión
de información, 3) la capa periglomerular constituida por las dendritas primarias y los somas de
las células en penacho, 4) la capa de células mitrales y 5) la capa nerviosa o granular en donde
encontramos los axones de las neuronas post-sinápticas. Las primeras aproximaciones
morfológicas de las neuronas del bulbo olfatorio en cortes histológicos fueron realizadas por
Ramón y Cajal a final del siglo XIX (Levine y Marcillo, 2008) con la ayuda de microscopios de
luz y tinciones simples tales como las de Nissl, siendo capaces de describir la anatomía básica de
la vía nerviosa asociada a la percepción de olores en donde los axones de los receptores olfatorios
pasan a través de la placa cribiforme y forman una capa en la superficie del bulbo olfatorio desde
donde penetran en los glomérulos. Posteriormente Pinching y Powell (Pinching & Powell, 1970)
realizaron un trabajo más acabado en relación a las neuronas presentes en la capa glomerular, la
que subdividieron en glomérulo y región periglomerular. A nivel celular describieron la
existencia de tres grupos de neuronas: 1) las neuronas en penacho y mitrales, encargadas gracias
a sus grandes arborizaciones dendríticas de captar los estímulos provenientes desde los axones de
las células olfatorias sensitivas; 2) las células periglomerulares que rodean al glomérulo junto con
las células gliales encargadas del soporte y 3) las células de axón corto.
29
4.1.2 Características morfológicas
En cultivos primarios de bulbo olfatorio de embriones de 17,5 días de gestación, las células
gliales crecen en una monocapa que da sostén a los distintos tipos neuronales que crecen por
encima. Macroscópicamente se pueden describir tres tipos de arreglos de neuronas en los
cultivos; 1) neuronas individuales, 2) en agrupaciones que consisten en grupos aislados de
neuronas altamente interconectadas entre si y 3) en agregados en donde neuronas pequeñas y
generalmente redondas se apilan sobre neuronas más grandes y desde donde se proyectan haces
de fibras hacia otros agregados, agrupaciones o neuronas individuales de las inmediaciones. En
los cultivos de neuronas embrionarias de bulbo olfatorio luego de tres horas in vitro (figura 9 A),
los cuerpos neuronales son solo visibles como círculos muy refringentes, sin prolongaciones y se
caracterizan por estar aislados los unos de los otros, característica que comienza a cambiar a
partir del tercer día in vitro cuando comienzan a generar proyecciones (figura 9 B-E). A partir de
aquí se inicia una sutil diferenciación morfológica entre los distintos tipos celulares,
distinguiéndose así las dendritas primarias en forma de penachos de las células de penacho y las
grandes arborizaciones de las dendritas de las células mitrales. También comienzan a ser
distinguibles las células periglomerulares, las que son de forma ovoide con arborizaciones
dendríticas mucho más pequeñas pero altamente varicosas. Finalmente un tercer grupo, menos
común de encontrar que los dos anteriores, en donde tenemos las células de axón corto que
poseen un soma más grande, con una forma esférica o medianamente ovoide no regular, con
axones más gruesos no muy ramificados y con pocas espinas en la mayoría de los casos. La
fluorescencia producto de la transfección del sensor de glucosa o lactato comienza a ser visible a
partir del cuarto día (no mostrado) con un máximo de fluorescencia al día 10 (figura 9 D), la que
30
Figura 9. Evolución en el tiempo de los cultivos de bulbo olfatorio.
Los bulbos fueron
disectados de embriones de 17,5 días de gestación y cultivados en una atmósfera a 37°C y 95%
aire / 5% CO2. (A) se observan neuronas con forma circular a 3 horas de haber sido plaqueadas,
en (B) los cultivos luego de 4 días in vitro comienzan a diferenciarse morfológicamente con
características propias de neuronas. En (A) y (B) no se observa fluorescencia ya que el sensor es
transfectado durante el cuarto día. En (C), (D) y (E) se aprecia la evolución del cultivo a los 7, 10
y 14 días respectivamente. Las flechas indican las células que expresan el sensor de glucosa. En F
una tinción inmunocitoquímica para los núcleos neuronales (verde) y para astrocitos (rojo) en
cultivos de 14 días, con lo que se demuestra la existencia de una gran cantidad de glías en el
cultivo.
31
se mantiene constante hasta al menos los días 14-15 cuando se realizan las mediciones (figura 9
E). Estos tres tipos neuronales están estrechamente asociados a células no neuronales; los
astrocítos o células gliales, característicamente sin forma definida, mucho más grandes, y poco
refringentes a la luz, con una gran cantidad de proyecciones en forma estrellada, las que se
encargan de formar una monocapa continua en donde las neuronas sustentan su crecimiento. Esta
configuración quedó de manifiesto en los cultivos de 17,5 días in vitro al realizar una tinción
inmunocitoquímica utilizando como marcadores primarios los anticuerpos anti-GFPA y antiNeuN (figura 9 F) para marcar astrocitos y neuronas respectivamente y luego incubar con los
anticuerpos secundarios alexafluor-564 y 488 según corresponde cada una de las placas de
cultivo.
4.2 Medición de glucosa y lactato intracelular en neuronas en cultivo
Las células transfectadas luego de cuatro días in vitro con los sensores FLII12glu700µΔ6 o
LACONIC, fueron utilizadas para realizar mediciones de glucosa o lactato intracelular.
Inicialmente se realizaron ensayos con el objetivo de corroborar que ambos sensores
eran
capaces de medir cambios de los azúcares en las concentraciones en que se trabajaría, para lo que
se generó un protocolo simple de medición de glucosa o lactato y la respuesta a distintas
concentraciones de los azúcares. Para las mediciones de glucosa se utilizó un buffer de perfusión
suplementando con 2mM glucosa con lo que se logró una concentración intracelular de 0,7±0,3
mM glucosa (n=45), generando un estado dinámico que se denomina estacionario y que es
mantenido tanto por el transporte de glucosa en ambas direcciones y el metabolismo o consumo
intracelular de la glucosa. Luego se expuso las células a un buffer extracelular sin glucosa para
32
llevar a las neuronas a niveles de ausencia de glucosa intracelular y observar la capacidad celular
de recuperar el estado estacionario anteriormente logrado tras la exposición en una nueva
oportunidad a un buffer con 2mM glucosa. Estos experimentos demostraron que el sensor es
capaz de medir cambios intracelulares de glucosa producto de cambios en el medio extracelular y
que las mediciones realizadas son reversibles. Lo mismo se realizó con el sensor de lactato en
donde las células fueron expuestas a concentraciones extracelulares de 1mM lactato, luego a
0mM lactato y a continuación a 5mM lactato, resultados que al igual que los de glucosa, fueron
reversibles y representativos del sensing de lactato intracelular.
4.3 Efecto del lactato sobre el estado estacionario de glucosa
El lactato ha sido descrito como sustrato energético para el tejido nervioso (Schurr et al, 1988) a
la vez de observarse un incremento de este monocarboxilato durante actividad excitatoria
neuronal medido por NMR (Prichad et al., 1991) y a través de microsensores y estudios de
microdialisis (Hu y Wilson 1997). Por otra parte se ha observado que en neuronas en cultivo,
pese a haber
glucosa disponible, puede utilizarse el lactato eficientemente como sustrato
energético (Bouzier-Sore et al., 2003, 2006), e inclusive durante actividad sináptica y en ausencia
de glucosa, el lactato es también capaz de sustentar la actividad neuronal tanto in vivo como in
vitro (Wyss et al., 2011, Schurr y Gozal, 2012). Estos argumentos en conjunto con otros (Pellerin
et al., 2007, Barros y Deitmer, 2010) apoyan la hipótesis de la lanzadera de lactato astrocitoneurona (ANLS), en donde los incrementos de lactato a nivel cerebral son asociados a un
incremento en la glicolisis astrocitaria con la concomitante producción y exportación de lactato a
33
las neuronas quienes lo captan y utilizan preferentemente como sustrato energético (Pellerin y
Magistretti, 1994).
Midiendo la concentración intracelular de glucosa en neuronas de bulbo olfatorio, se observó un
aumento en el estado estacionario del nivel de glucosa al incrementar el lactato en el buffer
extracelular de 0 a 1 mM, proceso que además es reversible al eliminar nuevamente el lactato del
buffer y que se incrementa tras la adición de 5mM lactato al buffer extracelular (figura. 10 A),
con lo cual podemos inferir una cierta respuesta asociada a la concentración de lactato. Con el
fin de estar seguros de que el incremento del estado estacionario de la glucosa debido a los
cambios en el lactato extracelular fueron efectivamente por un aumento en el lactato intracelular,
se realizaron mediciones de lactato con un sensor para este monocarboxilato desarrollado por
nuestro laboratorio. Las mediciones demostraron de esta forma que el lactato es eficientemente
captado por las neuronas incrementando el estado estacionario para el monocarboxilato, al
aumentar la concentración en el buffer extracelular de 0 a 1 ó 5 mM (figura 10 B), nótese además
que el cambio de la glucosa intracelular es considerablemente más lento que el cambio de lactato
intracelular.
4.4 Efecto del lactato sobre células con estados estacionario cercanos a 0mM glucosa.
Cuatro tipos de estados estacionario de glucosa fueron observados en neuronas; unas con niveles
de glucosa intracelular alrededor de 0.7 mM, otras con niveles de glucosa muy bajos cercanos al
34
Figura 10. Efecto del lactato sobre el estado estacionario de glucosa. (A) Curso temporal
expresado en la razón de fluorescencia para el sensor de glucosa (verde oscuro) y lactato (verde
agua). (B) Cambio en los niveles de glucosa intracelular ante la presencia o ausencia de lactato en
concentraciones de 1 ó 5 mM (barras amarillas respectivamente) en el buffer de perfusión. (C)
Curso temporal en el que se observa el efecto de alto lactato (5 mM) sobre los niveles
intracelulares de glucosa en células que espontáneamente disminuyen la concentración
intracelular de la hexosa. (D) Efecto de 1 mM lactato (amarillo) sobre el pH intracelular. * p <
0,05 n=10 en 4 experimentos independientes. Las mediciones fueron pareadas en cada
experimento.
35
0,1 mM glucosa, un tercer grupo que caían espontáneamente a niveles de glucosa intracelular
más bajos y finalmente las que permanecían en una concentración de 0mM glucosa intracelular
independiente de la concentración de glucosa en el buffer extracelular. Estos últimos 3 grupos
neuronales solo fueron capaces de aumentar su estado estacionario o salir de la condición de
0mM glucosa una vez que fueron expuestas a un buffer extracelular suplementado con lactato (1
ó 5 mM) en conjunto con glucosa, lo que indica nuevamente un efecto del lactato sobre el
metabolismo inhibiéndole o sobre el transporte incrementándolo (figura 10 C)
4.5 Efecto del lactato sobre el pH intracelular
El MCT2 es un transportador que permite el paso de monocarboxilatos; piruvato y lactato entre
otros, a través de las membranas pero cotransportando un protón en cada ciclo, hecho por el que
el transporte de lactato afecta y al mismo tiempo es afectado por el pH. Este fenómeno podría ser
una posible razón por la cual el lactato pudiese generar un efecto sobre el metabolismo de
glucosa, lo que hace necesario evaluar el efecto del tránsito de lactato a través del transportador y
el efecto sobre el pH intracelular en neuronas. Al realizar un protocolo midiendo el pH
intracelular con la sonda BCECF en neuronas de 15 días de cultivo, se pudo observar que la
entrada o salida de lactato (1mM en el buffer de perfusión) en células mantenidas en un buffer
con 2mM glucosa o en ausencia de la hexosa, no genera cambios en el pH intracelular (figura 10
D).
36
Estos resultados nos llevaron a suponer cuatro posibles efectos del lactato sobre el estado
estacionario de la glucosa: 1) generar una activación en el transporte de glucosa (figura 11 A); 2)
generar una disminución de la glicólisis (figura 11 B); 3) generar una pequeña disminución sobre
el transporte y una gran disminución sobre la glicólisis (figura 11 C) ó 4) generar un gran
incremento sobre el transporte y un incremento menor a nivel del metabolismo (figura 11 D)
4.6 Efecto del Lactato sobre el transporte de glucosa
Para evaluar el efecto del lactato sobre el transporte se realizaron 5 protocolos o aproximaciones
diferentes ya que la manera convencional de medir el transporte de glucosa requiere someter a las
células a un periodo de deprivación de glucosa, sin embargo ello no es posible en neuronas pues
estas células sufren cambios importantes en su metabolismo cuando no tienen acceso a glucosa
(Gutiérrez et al., en preparación).
4.6.1 Captación glucosa.
La medición de captación de glucosa se realizó en neuronas con el protocolo cap2.rate detallado
más abajo, con lo cual se logró tener células con un estado estacionario de glucosa intracelular
de aproximadamente de 0,35 mM (figura 12 A-B). Esta aproximación se desarrolló así ya que
inicialmente el protocolo buscaba vaciar a las células de glucosa, para luego medir la tasa de
captación, pero se observó que al exponer las células a concentraciones extracelulares de glucosa
iguales a 0 mM, el transporte y/o el metabolismo se comportan de una manera compleja. De esta
37
Figura 11. Cuatro posibles explicaciones del efecto de lactato sobre la concentración de
glucosa en neuronas.
El lactato podría generar un efecto potenciador del transporte
incrementando el flujo de entrada de glucosa (A), generar una disminución a nivel del consumo
de la glucosa a través de la glicólisis (B), generar una combinación con una gran disminución del
consumo de glucosa a nivel glicolítico y una disminución menor a nivel del flujo del transporte
de glucosa (C) o incrementar fuertemente el transporte y solo parcialmente el metabolismo (D)
38
Figura 12. Medición del efecto del lactato sobre la captación de glucosa en el rango bajo.
(A) Diagrama que define las condiciones en que se realizaran los experimentos de captación con
una concentración de glucosa intracelular y una gradiente dada. (B) Diagrama que ilustra la
forma en que se calculó la tasa de captación de glucosa, tasa que se ha denominado cap2.rate. (C)
Grafico de la medida de las tasas de captación en presencia y ausencia de lactato en cada una de
las células medidas. En (D) se observa el curso temporal de un experimento representativo en
donde se midió la tasa de captación de glucosa en ausencia y presencia de lactato en la misma
célula (amarillo). (E) Barras de los valores de las tasas normalizadas con respecto a los valores de
presencia de 1mM lactato (amarillo). * p < 0.05 n=10 en 4 experimentos independientes. Las
mediciones fueron pareadas en cada experimento.
39
forma al exponer éstas neuronas con baja glucosa intracelular (0,35 mM) a un buffer extracelular
que poseía alrededor de 5 veces más glucosa (2 mM), el incremento en la concentración de
glucosa intracelular en los primeros minutos correspondería casi totalmente el producto del
transporte de la hexosa. Lo último porque incluso a esa baja concentración la hexoquinasa (Km
50 µM) está bastante saturada y el metabolismo de glucosa debiera ser insensible a aumentos de
la glucosa intracelular. Con este argumento se expuso consecutivamente a las neuronas a un
protocolo de captación de glucosa utilizando para esto un sistema de perfusión con el cual se pasó
de un buffer con una concentración de 0,7 mM a 2 mM glucosa, primero en presencia de 1mM
lactato y a continuación en ausencia del último (figura 12 D), con lo que se logró obtener dos
tasas de captación a partir de la grafica de los datos de concentración en función del tiempo. La
tasa promedio para la captación de glucosa en presencia de lactato fue de 0,9± 0,3μM/s y el valor
en ausencia de lactato fue de 0,7±0,2 μM/s (figura 12 C), lo que implica una disminución
estadísticamente significativa en la captación de 2 mM glucosa en ausencia de lactato de un 22%
(figura 12 E).
4.6.2 Captación de 6mM Glucosa
Este protocolo muy parecido en el argumento al anterior tiene como fin el de analizar si a altas
concentraciones de glucosa y con un estado estacionario cercano a 0,5mM glucosa intracelular la
exposición a 6mM glucosa en la perfusión generaría algún cambio en la tasa de captación en
neuronas en presencia o ausencia de lactato (figura 13 A-D). Se observó en el protocolo anterior
que la tasa de captación de glucosa en presencia y ausencia de lactato fueron similares y los
valores fueron de 9,1± 2,1 μM/s en presencia de lactato y de 9,5± 2,7 μM/s en ausencia de
40
Figura 13. Medición del efecto del lactato sobre la captación de glucosa en el rango alto. (A)
En el diagrama se definen las condiciones de glucosa intracelular y gradiente de glucosa en que
se realizaran los experimentos de captación de 6mM glucosa. (B) Diagrama que ilustra
teóricamente el cálculo, a través del cambio de la pendiente en el tiempo, de la tasa denominada
cap6.rate. (C) Grafico de la medida de las tasas de captación en presencia y ausencia de lactato en
cada una de las células medidas. En (D) se observa el curso temporal de un experimento
representativo en donde se midió la tasa de captación de glucosa en ausencia y presencia de
lactato (amarillo) en la misma célula. (E) Barras de los valores de las tasas normalizadas con
respecto a los valores de presencia de 1mM lactato (amarillo). ns= no significativo n=13 en 5
experimentos independientes. Las mediciones fueron pareadas en cada experimento.
41
lactato, lo que al normalizar con respecto al valor en presencia de lactato célula a célula se obtuvo
un cambio no significativo de un 4,9%.
42
4.6.3 Transporte de galactosa en presencia de glucosa
La galactosa es sensada por el nanosensor de glucosa, así también ya que la galactosa no es
metabolizada pero es sustrato del transportador su tasa depende únicamente del transporte. El
protocolo convencional de medición de la captación de galactosa requiere vaciar a las células de
glucosa intracelular de manera de no tener contaminación o mezcla de ambas hexosas en la
medición del sensor. Sin embargo la exposición a 0mM glucosa ha causado cambios
impredecibles en el metabolismo y/o transporte en algunas mediciones realizadas en este trabajo
y por el laboratorio (Gutiérrez et al., en preparación) por lo cual la ejecución de un protocolo en
ausencia de glucosa no es deseado. Además como el propósito es evaluar el efecto del lactato
sobre el transporte, en las mediciones de tasas de transporte en ausencia de lactato expondríamos
a las neuronas a un periodo sin ningún sustrato energético en el buffer lo que sería absolutamente
negativo para la célula. Con este problema en mente se decidió realizar un protocolo
de
transporte de galactosa pero en presencia de una concentración baja de glucosa que solo fuera
capaz de mantener un estado estacionario intracelular por sobre cero, el que se logró con una
concentración de 0,8 mM glucosa en el buffer de perfusión, y de esta manera cualquier aumento
en la fluorescencia sería producto de la entrada de galactosa, la que se utilizó a una concentración
de 5mM en el buffer de perfusión (figura 14 A).
Al lograr el estado estacionario indicado se expuso a las células a la galactosa y luego de 2
minutos de exposición se midió la tasa de transporte (figura 14 B) para ambas condiciones de
estudio (ausencia y presencia de lactato) (figura 14 D). Las mediciones de las tasas de transporte
fueron realizadas luego de 2 minutos de iniciada la exposición a la galactosa de manera de tener
la certeza de estar observando solo la señal de entrada de galactosa a la célula y no una mezcla
43
Figura 14. Medición del efecto del lactato sobre el transporte de galactosa en presencia de
glucosa. (A) Esquema que ilustra el argumento del experimento, en donde una concentración de
galactosa es transportada en conjunto con una concentración baja de glucosa encargada de
mantener un nivel basal de sustrato para la hexoquinasa. (B) Diagrama que ilustra la forma en
que expuso a las neuronas en baja concentración de glucosa, a 5mM galactosa (azul) para luego
medir la tasa de transporte de galactosa gal.rate, con un delay de 3 minutos. (C) Grafico de la
medida de las tasas de captación en presencia y auscencia de lactato en cada una de las células
medidas (D) ilustra el curso temporal de un experimento representativo en donde se midió la tasa
44
de transporte de galactosa en ausencia y presencia de lactato (amarillo) en la misma célula. (E)
Barras de los valores de las tasas normalizadas con respecto a los valores de presencia de 1mM
lactato (amarillo). ns= no significativo n=11 en 4 experimentos independientes. Las mediciones
fueron pareadas en cada experimento.
45
de glucosa y galactosa que se produce al iniciarse la entrada de la última. Los resultados arrojaron
resultados similares en ambos escenarios, con tasas para ausencia de lactato de 1,7± 0,3 µM/s y
de 1,7± 0,3 µM/s en presencia del monocarboxilato (figura 14 C).
4.6.4 Medición del transporte de galactosa en presencia de manosa
La manosa es una hexosa que es incorporada a la neurona a través del transportador GLUT3 al
igual que la glucosa, y a continuación es fosforilada por la hexoquinasa para formar manosa 6fosfato la que luego es isomerizada a fructosa 6-fosfato por la fosfomanosa isomerasa y con esta
configuración se incorpora a la vía glicolítica (figura 15 A). Con el argumento ya detallado y con
el objetivo de mejorar los datos de las tasas de transporte medidas con galactosa se decidió
utilizar la manosa para sostener la demanda energética celular en reemplazo de la glucosa, al no
ser sensado por el nanosensor FLII12glu700µΔ6.
4.6.4.1 La manosa es metabolizada y produce lactato intracelularmente
Para poder evaluar el transporte de galactosa siempre en presencia de sustrato energético para la
célula era necesario tener certeza que la manosa era incorporada a la vía glicolítica y de esta
forma estaba disponible para sostener la demanda energética neuronal. Para ello utilizando el
sensor LACONIC y el inhibidor del transportador de monocarboxilatos neuronal MCT2: ARC1555858, se midió la capacidad del metabolismo neuronal de producir lactato en neuronas
expuestas a un buffer que solo contenía manosa. Los resultados obtenidos demuestran que la
46
Figura 15. Manosa como sustrato energético y transacelerador del transportador GLUT3.
(A) Diagrama de la vía metabólica de la manosa, la que luego de dos procesos resulta en la
formación de fructosa 6-P con lo que es capaz de alimentar la glicólisis, situación medida como
el incremento de lactato a través de la inhibición del MCT con el bloqueador específico ARC1555858 (triangulo rojo) (B) Curso temporal en el que se demuestra la capacidad de
metabolizar la manosa (cian) y observado como el incremento en la producción de lactato,
medición lograda al bloquear por 3 minutos el transportador de monocarboxilatos con un
47
inhibidor específico (rojo). (C) Diagrama del proceso de transaceleración que produce el azúcar
presente en el lado trans, sobre el azúcar en cis, lo que configura una excelente estrategia para
rápidamente llevar la glucosa intracelular a niveles cercanos al cero. (D) Curso temporal para la
acción de la manosa (cian) sobre el estado estacionario de células mantenidas en todo momento
con 2mM glc. El fenómeno es observable tanto en células en presencia de lactato (amarillo) como
en ausencia de lactato.
48
manosa es efectivamente metabolizada glicolíticamente y es capaz de formar lactato (figura 15
B).
4.6.4.2 La manosa transacelera eficientemente el transportador de hexosas
El fenómeno de la transaceleración describe el efecto estimulante que la presencia de un azúcar
en el lado opuesto de la membrana o en el lado “trans” ejerce sobre la tasa de flujo unidireccional
de azúcar desde el lado cis al trans (figura 15 C). Aprovechando esta característica del
transportador en estudio, transaceleramos el GLUT3 con una concentración de 6mM manosa en
trans, siempre en presencia de 2mM glucosa en el buffer de perfusión, lo que resultó en una
eficiente metodología para disminuir la glucosa intracelular en cosa de segundos (figura 15 D).
49
4.6.4.3 El transporte de galactosa no varía en ausencia o presencia de lactato
Luego de haber demostrado que la manosa es un efectivo sustrato energético neuronal y que la
transaceleración de la glucosa resulta en un método eficiente para llevar los niveles de glucosa
intracelular a cero en cosa de segundos, se procedió a realizar las mediciones de transporte de
galactosa en presencia de manosa inmediatamente después de haber logrado llevar a cero los
niveles de glucosa intracelular y así evaluar el efecto del lactato sobre la capacidad del GLUT3
de incorporar galactosa (figura 16 A-B). Los resultados luego de efectuado ésta aproximación
una vez más estuvieron de acuerdo con lo observado con los otros métodos utilizados, mostrando
una tasa de transporte de galactosa similar en presencia y ausencia de lactato, lo que en función
de los valores normalizados representan un cambio no significativo de sólo un 2,5% (figura 16 CD).
4.6.5 Transporte de 6-NBDG
Para observar la influencia del lactato sobre el transporte de hexosas con un método distinto al
utilizado hasta ahora en base a la utilización del nanosensor basado en FRET, se elaboró un
protocolo de medición de transporte con el azúcar fluorescente 6-NBDG, sustrato de los
transportadores GLUT pero azúcar no metabolizado glicoliticamente por la imposibilidad de ser
fosforilado por las hexoquinasa.
Las neuronas fueron expuestas a 150μM de 6-NBDG por un periodo de 2 minutos, obteniéndose
imágenes cada 10 segundos con un setting para el microscopio confocal como fue descrito
50
Figura 16. Medición del efecto del lactato sobre el transporte de galactosa en presencia de
manosa. (A) Esquema del argumento del experimento en el cual las células se exponen a 6mM
manosa para de esta forma mantener la glicólisis funcional y el transporte es medido por medio
de la galactosa. (B) Curso temporal que representa la medición de las tasas de transporte de
galactosa (violeta) en ausencia o presencia de lactato (amarillo), en células mantenidas en todo
momento con 6mM manosa en el buffer de perfusión. (C) Valores para las tasas de transporte de
galactosa en presencia de manosa (galman.rate), tanto en ausencia o presencia de lactato
(amarillo). (E) Valores normalizados de galman.rate para el transporte de galactosa. ns= no
significativo n=10 en 5 experimentos independientes. Las mediciones fueron pareadas en cada
experimento.
51
en el apartado de materiales y métodos. Luego de generar una tasa inicial de transporte de 6NBDG en presencia de 1mM lactato en el buffer extracelular, se procedió a medir la tasa de
transporte en deprivación de lactato en el buffer por un periodo de 5 minutos, para luego realizar
un nuevo cambio al buffer referencial con una concentración de 1mM lactato para observar la
reversibilidad de la respuesta si esta existiese (figura 17 A-B). Considerando la sensibilidad del
sistema a la deprivación de glucosa, se decidió mantener en todo momento a las neuronas en un
buffer de 2mM glucosa en el cual se adicionó el azúcar fluorescente, de esta manera si el sistema
necesitase de un sustrato metabolizable a nivel glicolítico para ejercer cambios a nivel del
transporte en respuesta a la ausencia o presencia de lactato, esto quedaría de manifiesto en las
tasas medidas de transporte de 6-NBDG.
El resultado de esta medición mostró un incremento significativo en la captación de 6-NBDG en
ausencia de lactato de un 13,5% (figura 17 B-C).
52
Figura 17. Medición del efecto del lactato sobre el transporte de 6-NBDG. (A) Esquema en
que se demuestra como el azúcar fluorescente hace ingreso a la célula a través del transportador
de glucosa con lo que incrementará la fluorescencia intracelular en el tiempo, lo que es la medida
del transporte. (B) Tasa de transporte de 6-NBDG célula a célula en presencia de lactato
(amarillo) y ausencia del monocarboxilato. (C) Barras representativas de las tasas de transporte
de 6-NBDG normalizadas en los valores en 1mM lactato). * p < 0.05 n=37 en 3 experimentos
independientes. Las mediciones fueron pareadas en cada experimento.
53
4.7 Metabolismo de glucosa
Teniendo como antecedentes que en neuronas en cultivo la presencia de lactato aumenta el estado
estacionario de glucosa y que el transporte a través del GLUT3 no se vio modificado por lactato,
debiéramos esperar a nivel del metabolismo una disminución
acontecimientos descritos anteriormente.
para así explicar los dos
Con el fin de estudiar si el lactato afecta el
metabolismo de la glucosa, se realizaron los dos protocolos que se describen a continuación.
4.7.1 Metabolismo de glucosa medido con citocalasina-B
La citocalasina-B inhibe de manera reversible los transportadores de glucosa (GLUT) y ha sido
ampliamente utilizada para realizar mediciones de metabolismo en diversos tipos de células.
Bittner y colaboradores
(Bittner et al, 2010) describieron un método para calcular la tasa
metabólica instantánea en células en cultivo al realizar un protocolo de exposición a citocalasinaB (figura18 A-B), por lo que utilizando el mismo método, las neuronas fueron expuestas a un
protocolo de exposición a citocalasina-B por 3 minutos en presencia y ausencia de lactato en un
buffer que siempre tuvo una concentración de 2mM glucosa. Los resultados arrojaron un
porcentaje de células que presentaron tasas metabólicas iguales (no mostrado) y otras células en
que se observó un incremento en la tasa metabólica en células en ausencia de lactato, lo que
determinó el análisis de estas dos poblaciones de forma independiente (figura 18 C-E).
54
Figura 18. Medición del efecto del lactato sobre el metabolismo con citocalasina-B. (A)
Diagrama que muestra como el bloqueo del transporte de glucosa por medio de la citocalasina-B
puede ser utilizado como estrategia para medir la tasa metabólica. (B) Esquema de la
metodología utilizada para la medición de la tasa metabólica en función del tiempo. (C) Grafico
de barras con las tasas metabólicas normalizadas representando el total de neuronas (n=16 en 8
experimentos independientes) (D) Valores para la tasa metabólica (citoB rate) para cada una de
las células medidas en ausencia y presencia de lactato (amarillo). A la derecha un aumento a las
células con tasas menores a 3 µM/s en presencia de lactato (líneas azules). (E) Grafico de barras
representativas de los valores normalizados de las tasas metabólicas para las células con tasas
55
metabólicas menores a 3µM/s. n=8 en 8 experimentos independientes. Las mediciones fueron
pareadas en cada experimento. * p < 0,05
56
4.7.2 Medición del metabolismo de glucosa con el método de la tasa de relajación
Definiremos como tasa de relajación a la medida de la tasa de disminución de glucosa que se
produce al exponer a neuronas, que permanecen en estado estacionario para glucosa producto de
un buffer con 2mM de la hexosa, a un buffer con una concentración menor de glucosa y que
para este protocolo se estandarizó en 0,7mM en el buffer de perfusión (figura 19 A-B). Luego
las tasas de relajación en presencia y ausencia de lactato (figura 19 C) fueron comparadas en una
razón donde se dividió el valor de la tasa en presencia de 1mM lactato por la tasa en ausencia de
lactato, valor que se denominó razón de relajación y que representa el valor de veces en que la
tasa se incrementó o disminuyó. Con el objetivo de tener un control de que los resultados
obtenidos consecutivamente con este protocolo no fueron producto del acontecimiento
inmediatamente anterior, se realizó en cada uno de ellos un control con la misma condición
inicial y se midió nuevamente la tasa de relajación, en experimentos denominados de
reversibilidad del efecto.
Dado que los resultados de la evaluación del efecto del lactato sobre el transportador de glucosa
neuronal demostraron que no existe una influencia del monocarboxilato sobre éste, hemos
simplificado las ecuaciones diferenciales que expresan los flujos de glucosa responsables del
mantenimiento del estado estacionario intracelular. Esta simplificación está dada por el hecho
que el transporte se mantiene constante en ausencia o presencia de lactato y la apreciación que al
medir ambas tasas a una misma gradiente de concentración de glucosa y asumiendo que en este
punto la permeabilidad a glucosa son iguales en ambas condiciones, sólo los valores relacionados
al metabolismo son los importantes para la mantención del estado estacionario. Estos valores de
57
Figura 19. Medición del efecto del lactato sobre la tasa de relajación. (A) Diagrama de la
estrategia para realizar la medición de la tasa de relajación a gradiente de glucosa constante. (B)
Representación del punto de medición de la tasa de relajación (rel.rate) a gradiente fija. (C)
Representación célula a célula de las tasas de relajación en ausencia y presencia de lactato
(amarillo) (D) Curso temporal de la medición de la tasa de la tasa de relajación en ausencia y
presencia de lactato. (E) Gráfico de barras de los valores de las tasas de relajación * p < 0.05
n=16 en 5 experimentos independientes. Las mediciones fueron pareadas en cada experimento.
58
relajación, si bien es cierto, no son tasas reales del metabolismo, al compararlas una con respecto
a la otra, sí nos entregan el valor de incremento o disminución en cantidad de veces de la tasa
metabólica.
Los resultados obtenidos producto de este protocolo mostraron como el efecto del lactato sobre el
metabolismo tiene características inhibitorias, con el lactato a una concentración de 1mM en el
buffer de perfusión generando una inhibición de 2,5 veces en el metabolismo comparado con los
valores de relajación medidos para la ausencia de lactato (figura 19 C-E).
4.8 El transporte no influye sobre el metabolismo neuronal
Finalmente se estudió el efecto del incremento de glucosa extracelular sobre el metabolismo
midiendo la producción de lactato con el nanosensor basado en FRET denominado LACONIC.
Como se había observado anteriormente, el incremento de la gradiente de glucosa aumentó la tasa
de transporte de hexosas y elevó el nivel del estado estacionario de glucosa. Este incremento
podría también generar un aumento en el metabolismo glicolítico con lo cual se produciría un
alza en los niveles de lactato intracelular. Para observar si es que cambios en la gradiente de
glucosa podían generar cambios a nivel del metabolismo glicolítico se expusieron a células
mantenidas en un buffer con una concentración de 2mM glucosa a concentraciones menores y
mayores de glucosa extracelular (0,7mM y 6mM) con el fin de evaluar la concentración de
lactato intracelular (figura 20 A-B). Los resultados mostraron que no existen cambios a nivel del
estado estacionario de lactato intracelular como respuesta a los cambios de gradiente de glucosa,
con lo que queda demostrado que el transporte no ejerce un control por sobre el metabolismo, al
menos bajo las condiciones estudiadas en este trabajo.
59
Figura 20. Cambios extracelulares de glucosa no afectan el metabolismo. (A) Curso temporal
del efecto de protocolo de relajación y captación de 2mM glucosa visto con el sensor de lactato
(n=4 en 2 experimentos independientes). (B) Curso temporal del efecto de la exposición a 6mM
glucosa en el medio extracelular sobre la medición de lactato intracelular. (n=2 en 2 experimentos
independientes)
60
4.9 Evaluación de la producción de lactato de origen glicolítico
Con el propósito de evaluar si la glucosa es eficientemente metabolizada a través de la glicólisis
se evaluó a través de un protocolo de inhibición del transportador de monocarboxilatos neuronal
(MCT2) la existencia o inexistencia de producción de lactato proveniente del metabolismo
glicolítico de la glucosa. La lógica del protocolo es la exposición de células mantenidas en un
buffer que solo posee glucosa, al bloqueo temporal del transportador de monocarboxilatos y
evaluar si se produce un incremento del lactato intracelular debido al impedimento de exportarlo
hacia el medio extracelular. La exposición por un lapso de 3 minutos al bloqueador del MCT2,
AR-C1555858 efectivamente mostró un incremento rápido del lactato intracelular debido a la
actividad de la lactado deshidrogenasa 1 que produce lactato a partir del piruvato proveniente del
metabolismo glicolítico de la glucosa (figura 21 B).
4.10 La transaceleración con piruvato produce una respuesta bifásica en el estado
estacionario de glucosa
Durante el desarrollo de este trabajo se determinó que el metabolismo glicolítico de la glucosa
mantiene un nivel de lactato intracelular que se ha denominado lactato glicolítico. Habiendo
evaluado el efecto de la presencia y ausencia de lactato en el buffer de perfusión sobre el estado
estacionario de glucosa, se decidió evaluar el efecto que tiene sobre este estado estacionario la
eliminación casi a 0 mM de lactato intracelular, para lo que se aprovechó de la capacidad de
transacelerar el transportador de monocarboxilatos neuronal (MCT2), exponiendo a las neuronas
a un buffer con una concentración de 10mM piruvato. Realizando mediciones de lactato con el
sensor LACONIC, en células mantenidas solo con 2mM glucosa en el buffer de perfusión se
61
Figura 21.Consumo y producción de lactato. (A) Las neuronas al estar suplementadas solo con
lactato en el buffer de perfusión están captando y utilizando el lactato, lo que queda de manifiesto
al realizar un protocolo de inhibición del MCT2 con un inhibidor específico. (B) Las neuronas al
ser suplementadas solo con glucosa están produciendo lactato observable aquí como una
acumulación de lactato producto de la inhibición del transportador MCT2.
62
observó que efectivamente el piruvato disminuye la concentración de lactato glicolítico en
segundos con una reversibilidad del efecto dentro del mismo periodo de tiempo y sin existir un
incremento del lactato en ningún momento durante la exposición a piruvato (figura 22 A). A
nivel de la glucosa, la transaceleración con piruvato provoca una respuesta bifásica constituida
inicialmente por una disminución de la glucosa en minutos que luego gatilla un incremento de la
hexosa que se extiende durante todo el periodo de exposición (figura 22 B) y se mantiene por
unos minutos luego de ser retirado el piruvato del buffer de perfusión, para luego regresar al
estado estacionario anterior de glucosa. Este efecto inicial del piruvato es consistente con la
remoción del efecto inhibitorio del lactato sobre la glicólisis.
63
Figura 22.Efecto del piruvato sobre el estado estacionario de lactato y glucosa. (A) Curso
temporal de la medición de lactato en donde el piruvato genera una transaceleración del lactato la
que es rápidamente revertida una vez eliminado el piruvato del buffer de perfusión. (B) Efecto
del piruvato sobre el estado estacionario de glucosa. Se puede observar una respuesta rápida de
decaimiento de la glucosa seguida de un incremento que se mantiene durante el periodo de
exposición a piruvato.
64
5. DISCUSIÓN
La glucosa sostiene la demanda energética tanto en estado estacionario como durante activación,
pero no ha sido posible definir qué tipo celular es el responsable principal de su utilización
(Pellerin y Magestretti, 1994, Aubert et al, 2006, Mangia et al., 2009, Barros y Deitmer, 2010).
Por otro lado, en los últimos años se ha considerado al lactato como un protagonista importante
en la mantención del estado energético a nivel cerebral (Bouzier-Sore et al. 2003, Schurr y Payne,
2007, Schurr y Gozal, 2012), además de sus funciones neuroprotectoras y rescate de actividad
neuronal durante deprivación de glucosa (Rouach et al, 2008, Schurr y Gozal, 2012). Esto hace
que el estudio y compresión de los fenómenos relacionados a la utilización de glucosa y/o lactato
por el sistema nervioso central, y en particular por astrocitos y neuronas, se ha transformado en el
punto fundamental de desarrollo tanto de técnicas y métodos para estudiar los fenómenos, como
de datos y resultados con el fin de mejorar la compresión de este sistema.
Tradicionalmente las técnicas utilizadas para el estudio del metabolismo de la glucosa y el lactato
tienen en su mayoría el inconveniente de no poseer una alta capacidad de resolución espacial y
temporal, por lo cual las mediciones si bien es cierto pueden responder algunas preguntas, no son
capaces en muchas oportunidades de discriminar entre tipos celulares ni tampoco ser precisas
temporalmente en los distintos eventos que se gatillan como respuesta a los distintos estímulos o
manipulaciones. Con el propósito de superar estos problemas, nuestro laboratorio ha estado
utilizando nanosensores basados en FRET, con la capacidad de sensar intracelularmente la
glucosa y el lactato, entregando así la capacidad de realizar las mediciones en célula única y con
una alta resolución temporal. A esta capacidad de registro de datos se suman las distintas
65
estrategias que se han desarrollado para utilizar y sacar el máximo provecho a los sensores y el
conocimiento que se tiene de las vías metabólicas, con lo que la utilización de epímeros de la
glucosa, algunos sensados y otros no por el sensor y la utilización de piruvato como molécula
capaz de tranasacelerar el MCT2, han formado parte del set de herramientas disponibles para
recabar la información deseada para contestar nuestras preguntas (Tabla I).
El sensor denominado FLIIPglu700µΔ6, desarrollado por Takanaga y colaboradores (Takanaga
et al., 2007) tiene una Km cercana a los 700 µM, por lo que es capaz de medir concentraciones
intracelulares en el rango fisiológico, parámetro importante a considerar en las mediciones
realizadas en este trabajo y con lo que hemos logrado medir concentraciones de glucosa en estado
estacionario, en donde el nivel de glucosa intracelular esta mantenido tanto por el transporte
bidireccional y el metabolismo de la hexosa (figura 6 A) de 0,7± 0,3 mM, al perfundir las células
con un buffer con una concentración de 2 mM glucosa y 1mM lactato. Este estado estacionario de
glucosa se ve modificado al eliminar el lactato del buffer de perfusión en aproximadamente un
15 ± 5% con respecto a la medición en presencia de lactato. Adicionalmente el incremento
extracelular del lactato de 1 mM a 5 mM genera un incremento de un 30 ± 10% en el estado
estacionario (figura 11 A -B), efecto que es muchísimo más dramático en neuronas que
espontáneamente caen a niveles de 0 mM glucosa intracelular o que tienen un estado estacionario
de glucosa muy bajo (cercano a 0,1 mM). En estas neuronas la única forma de incrementar el
nivel de glucosa es la exposición a concentraciones elevadas de lactato (figura 11 C), con lo que a
partir de
estas observaciones se deduce que el lactato juega un papel importante en la
mantención de la glucosa en estado estacionario producto de tener un grado de implicancia sobre
el metabolismo energético
neuronal. Esto tambien ha sido
demostrado en otros trabajos
publicados al observar la capacidad de soportar la respiración, mantener los niveles de ATP y
66
Tabla I. Resumen de las propiedades de los azucares utilizados durante la experimentación.
Azucar
Sensor
Transportado
Metabolizado
Transacelera
Glucosa
FLIIPglu700µΔ6
GLUT3
Hexoquinasa
man y gal
Galactosa
FLIIPglu700µΔ6
GLUT3
-
-
Manosa
-
GLUT3
Hexoquinasa
glc y gal
Lactato
LACONIC
MCT2
LDH
-
Piruvato
LACONIC
MCT2
LDH
lac
6-NBDG
-
GLUT3
-
-
67
reducir los niveles de consumo de glucosa en rebanadas y en neuronas en cultivo (Tabernero et
al, 1996, Wada et al, 1997). Bouzier-Sore y colaboradores (Bouzier-Sore et al, 2003) por su parte,
utilizando espectroscopia NMR para C13 y H1 en estudios en neuronas en cultivo, determinaron
que cuando las concentraciones de glucosa y lactato son idénticas, la contribución relativa de
glucosa y lactato al metabolismo oxidativo eran de 21% y 79% respectivamente. Además ellos
concluyen que las neuronas tienen la necesidad de producir lactato, pero al mismo tiempo de
consumirlo, situación que Schurr y colaboradores, interpretan como la existencia de una
lanzadera intracelular de lactato y que éste último, y no el piruvato, sería el producto final de la
glicolisis en neuronas (Schurr y Gozal, 2012).
5.1 El lactato es eficientemente captado por las neuronas
Con el fin de tener certeza que el lactato está siendo realmente transportado y consumido por las
neuronas, se utilizó el nanosensor basado en FRET LACONIC (San Martin et al, en revisión) el
que específicamente sensa la concentración intracelular del monocarboxilato al poseer un sitio
de unión a lactato flanqueado de las proteínas fluorescentes mTFP y Venus (Figura 7 C). A
través de un protocolo simple de exposición a concentraciones de 1, 0 y 5 mM lactato en el buffer
de perfusión, pudimos demostrar que el lactato está siendo realmente transportado a través del
MCT y que este incremento en el lactato con una cinética bastante rápida, va acompañado de
cambios similares en el nivel de la glucosa intracelular pero con una cinética más lenta (figura 11
A). Además al exponer a células que permanecían solo en un buffer suplementado con lactato, la
inhibición del transportador de monocarboxilatos neuronal mostró como el lactato disminuyó en
función del tiempo, indicando que éste está siendo consumido intracelularmente (figura 21 A).
68
El transporte de lactato no solo depende de la gradiente de concentración que se forma entre el
medio extra e intracelular, sino que es dependiente también de la gradiente de protones existente
y además afecta al pH intracelular, dado que el transportador de monocarboxilatos (MCT) cotransporta un H+ por cada lactato. Esto inmediatamente implica que el efecto del lactato podría
ser mediado por cambios en el pH intracelular producto del fenómeno descrito, por lo cual fue
fundamental realizar mediciones de la concentración de protones intracelular, lo cual se llevó a
cabo con la sonda sensible a H+, BCECF. Las mediciones que se realizaron con un buffer KRHBicarbonato ajustado a pH 7,4 entregaron lecturas intracelulares de 7,2 unidades de pH, las que
no tuvieron variación durante la exposición transitoria de las neuronas en cultivo a cambios entre
1 y 0 mM lactato en el buffer de perfusión (figura 11 D). Este resultado no esperado en función
del fenómeno de cotransporte del MCT junto a un H+ por cada lactato translocado, pone de
manifiesto que; primero el pH no es el responsable en los cambios del nivel de glucosa por la
presencia o ausencia de lactato en el buffer extracelular, y segundo que un eficiente sistema de
regulación de pH a nivel neuronal que debe estar operando posiblemente ligado al intercambiador
de Na+/H+ y/o al intercambiador Na+/HCO3- (Chesler, 2003)
5.2 El estado estacionario de glucosa puede ser modificado por cambios a nivel del
transporte o el metabolismo
El cambio observado en el estado estacionario de glucosa producto de cambios en el lactato
puede deberse fundamentalmente a dos fenómenos: el transporte de la glucosa por el
transportador GLUT3 o metabolismo/fosforilación de la hexosa por la hexoquinasa, o una
combinación de ambos como se ilustra en la figura 12. En el primero, a nivel del GLUT3, el
69
lactato podría ejercer un incremento del transporte de glucosa, con lo que manteniendo un
metabolismo constante podríamos observar un incremento de la glucosa en el estado estacionario.
En el segundo, a nivel del metabolismo de la glucosa ejercido por cambios a nivel de la enzimas
reguladoras de la glicolisis: hexoquinasa, fosfofructoquinasa o piruvato quinasa u otro
mecanismo asociado a la utilización de agentes oxidantes (figura 1), inhibiría la fosforilación de
la glucosa por la hexoquinasa, fenómeno que también se observaría a través del sensor de
glucosa, como un incremento en el estado estacionario de la glucosa libre no fosforilada. Además
de estas dos posibilidad estrictas, podría generar una combinación de ellas, en donde el lactato
podría disminuir de forma importante el metabolismo y solo disminuir en una pequeña
proporción del transporte o finalmente una posibilidad en donde el lactato podría incrementar
considerablemente el transporte de glucosa y aumentar el metabolismo solo en una proporción
menor (figura 11 D-E).
5.3 La tasa de transporte de glucosa no es afectado por el lactato
Tradicionalmente la medición del transporte de glucosa utilizando la técnica basada en FRET con
el sensor FLIIPglu700µΔ6 se realiza depletando a las células del azúcar mencionado y a
continuación se observa la tasa de captación de glucosa con la configuración del transportador de
glucosa neuronal en cero-trans o se utiliza la técnica de medición del transporte de galactosa.
Este protocolo que ha sido utilizado en la medición de tasas de transporte en otros trabajos, tiene
el inconveniente de llevar las concentraciones de glucosa intracelular a cero, lo que para muchos
tipos celulares no es trascendental, pero que para las neuronas se transforma en un gatillador de
70
reacciones posiblemente asociadas a estrés metabólico que alteran los valores en nuestras
mediciones con el sensor o al funcionamiento en una configuración cero-trans del transportador
que le confiere una capacidad distinta para realizar el transporte en aquella conformación. Con
este antecedente en mente, se generaron 5 aproximaciones o protocolos distintos con los cuales
se midió directamente el transporte o se observaron captaciones de glucosa a distintas
concentraciones, pero siempre teniendo en cuenta que el metabolismo glicolítico debía
permanecer funcionando y alimentando constantemente la demanda energética neuronal. Además
y como resultado del análisis de cada una de las aproximaciones independientes, las conclusiones
se harían más robustas.
En la
primera aproximación se midió la tasa denominada cap2.rate que corresponde al
incremento de glucosa intracelular afectado por los dos flujos que comandan el nivel de glucosa
intracelular: el metabolismo y el transporte, por lo cual no es una medición precisa del transporte,
pero si una aproximación al efecto que se produce cuando las neuronas con un nivel de glucosa
de aproximadamente 0,35 mM glucosa son expuestas a concentraciones extracelulares de 2 mM,
generando una gradiente de concentración favorable para la entrada con un valor de 1,65 (figura
12 A-B). Las mediciones arrojaron resultados en donde la tasa de captación de glucosa en
ausencia de lactato es estadísticamente menor que su contraparte en presencia de 1mM lactato en
el buffer de perfusión, con una disminución de un 23 ± 9% con respecto a las mediciones en
lactato. Un cambio de todas formas pequeño al observar los valores célula a célula de las 10
neuronas que se evaluaron (figura 12 D-E). Como se había mencionado esta medida no es un
representación sólo del transportador sino que una medida del transporte y el metabolismo de la
glucosa, por lo que la disminución en la captación en ausencia de lactato podría deberse a que el
transportador ha disminuido el transporte de glucosa al mismo tiempo que el metabolismo ha
71
disminuido pero en menor proporción que el transporte (figura 11 D), o que el transporte se ha
mantenido sin cambio y el metabolismo se ha incrementado por la ausencia de lactato (figura 11
B).
A continuación se utilizó el protocolo en que se midió la tasa de captación de glucosa
denominada cap6.rate, con lo que sin variar el estado estacionario de 0,7 mM glucosa
intracelular, se expusieron las neuronas a una concentración de 6 mM en el buffer de perfusión,
generando de esta manera una gradiente de concentración favorable para la entrada de glucosa de
5.3 (figura 13 A-B). En este caso no se observó un cambio significativo en el transporte de
glucosa en ausencia o presencia de lactato. Esto debido a que a esta concentración la hexoquinasa
está con una alta disponibilidad de sustrato en una configuración muy probablemente saturada
por lo que la medida de esta captación sería una aproximación más cercana del transporte, aún
cuando no debemos olvidar que continúa siendo un medida tanto del metabolismo y transporte.
La siguiente aproximación para estudiar el transporte es la tasa denominada gal.rate y que fue
lograda tras la disminución del estado estacionario de glucosa con un buffer de perfusión con una
concentración de 0,8 mM y con el que se logró una concentración intracelular de 0,3 mM,
momento en el que se expuso a las neuronas a una concentración de 5 mM galactosa (siempre en
presencia de glucosa) y la tasa de transporte se comenzó a medir luego de 3 minutos, ya que
durante este periodo la medición es una suma del sensing de ambos azucares por el sensor (figura
14 A-C). El elemento positivo de este protocolo es la constante alimentación de la vía glicolítica
con glucosa por lo cual hemos resuelto el problema de la exposición a las células a periodos de
estrés producto de la nula disponibilidad de sustratos energéticos a nivel glicolítico, pero por otro
lado hemos realizado un protocolo en que existe una mezcla de la medición de glucosa y
72
galactosa por parte del nanosensor lo cual complejiza de cierta forma nuestras mediciones. De
todas formas, e independiente de lo antes planteado, el incremento en la señal sea que es pura
señal de galactosa o una mezcla de ambas si es que el transporte fuese sensible al lactato, la tasa
de transporte debiera verse influenciada, situación que no es observable en las 11 células medidas
en 4 experimentos independientes (figura 14 D-E)
Continuando con el desarrollo de nueva estrategias para poder realizar mediciones más precisas
del transporte y siempre teniendo en cuenta la necesidad imperativa de mantener el metabolismo
glicolítico funcional, se decidió utilizar manosa con la idea de mantener constante un sustrato
para la vía glicolítica. La manosa es transportada por el transportador GLUT3 y fosforilada por la
hexoquinasa a manosa 6-fosfato para que luego por acción de la fosfomanosa isomerasa se forme
fructosa 6-fosfato la que ingresa a la glicoólisis (figura 15 A). Esto fue demostrado al realizar
mediciones de lactato con un protocolo de inhibición del MCT2 con el bloqueador AR-C1555858
en donde se observó una acumulación de lactato durante la exposición al bloqueador, la que se
mantuvo en aumento luego de dar termino a la exposición y con lo que se logró un estado
estacionario para el lactato intracelular en presencia de manosa, similar al logrado con glucosa
(figura 15 B). Otra propiedad importante que suministra la manosa es la rápida transaceleración
de la glucosa intracelular, con lo que en un minuto es posible disminuir notablemente la
concentración de glucosa intracelular (figura 15 C-D). Así el intercambio de glucosa por manosa
en el buffer intracelular lleva rápidamente a la célula a una concentración muy cercana a 0 mM
glucosa. En estas condiciones la exposición a galactosa entrega una tasa pura de transporte, sin
contaminación de glucosa, en células con la actividad glicolítica mantenida por manosa (figura
16 A-B).
73
Aún con 4 aproximaciones con resultados apuntando a la inexistencia de cambios a nivel del
transporte por la presencia del lactato, se decidió realizar una medición extra y que fuese
independiente a las mediciones con el sensor de glucosa, para lo que se utilizó el azúcar
fluorescente 6-NBDG tal y como fue descrito por Porras y colaboradores (Porras et al., 2007).
Esta aproximación tiene a su favor que las células en todo momento están en presencia de
glucosa además del 6-NBDG (figura 17 A), por lo que el metabolismo glicolítico está mantenido
durante todo el experimento. Los resultados muestran un grupo minoritario de células con tasas
de transporte superiores a 20 nM/s, en las que la medición para el transporte de 6-NBDG fue
mayor en ausencia de lactato (figura 17 B), pero que no es un fenómeno común ya que en
general se observa que el transporte en ausencia de lactato se mantiene casi sin cambio al utilizar
al 6-NBDG como medición para el transporte. Este fenómeno puede deberse a la existencia de
un grupo muy minoritario de células en las que el transporte si es de alguna forma influenciado
por el lactato o algún efecto del mismo 6-NBDG sobre células muy permeables al azúcar
fluorescente.
Al evaluar la acción del lactato sobre el transportador de glucosa se puede finalmente concluir
que si bien es cierto en 2 (cap2.rate y 6-nbdg rate) de los 5 protocolos efectuados se observo una
diferencia estadísticamente significativa, esta diferencia es muy pequeña para interpretarlas como
cambios importantes a nivel del transporte de glucosa por efecto del lactato (Tabla II).
74
Tabla II. Resumen de los resultados para las tasas de transporte y metabolismo en cada
protocolo realizado.
Tasa
Tipo protocolo
0mM lac
1mM lac
%Δ 0lac vs 1lac
cap2.rate
captación glc
0,7±0,2
0,9±0,3
-22
captación glc
9,5±2,7
9,1±2,1
n.s
transporte gal + glc
1,7±0,3
1,7±0,3
n.s
transporte gal + man
0.8±0,4
0.8±0,4
n.s
transporte 6-NBDG
13±5
11±6
+15
relajación
6,4±1,2
3.2±0,4
+100
bloqueo transporte
1,4±0,3
0.7±0,2
+100
(µM/s)
cap6.rate
(µM/s)
gal.rate
(µM/s)
galman.rate
(µM/s)
6-nbdg.rate
(nM/s)
rel.rate
(µM/s)
citoB.rate
(µM/s)
n.s: no significativo
75
5.4 La tasa de metabolismo de glucosa es sensible a la presencia de lactato
Inicialmente se fijaron 4 posibilidades para el cambio del estado estacionario de glucosa en
neuronas del bulbo olfatorio y con los análisis realizados fue posible descartar que el transporte
pudiese tener alguna influencia en el incremento del nivel de la glucosa intracelular en presencia
de lactato. Por lo tanto, el cambio del nivel de glucosa intracelular que hemos detectado debiera
explicarse a nivel de su metabolismo para lo cual se desarrollaron dos métodos para evaluar el
efecto del lactato.
En primer lugar se confeccionó el protocolo de relajación, el que se denominó así por exponer a
células con un estado estacionario de 0,5 mM glucosa intracelular a un buffer de perfusión con
0,7 mM glucosa, y en donde la tasa de disminución de la glucosa, determinada por el transporte y
el metabolismo, se le denominó tasa de relajación o rel.rate y fue medida a la misma gradiente de
concentración (figura 18 A-C), para así apoyado en los resultados anteriores en los que el
transporte no cambio, podemos estimar que esta disminución es fundamentalmente metabólica,
con valores para la tasa en ausencia de lactato de 6,4 µM/s y de 3,2 µM/s para la presencia de
1mM lactato, lo que confiere un 100± 39% de incremento de la tasa metabólica en ausencia de
lactato (figura 18 D-E).
Adicionalmente se midió el metabolismo de la manera convencional utilizando un protocolo de
bloqueo del transportador con citocalasina-B, molécula que al unirse específicamente por la cara
interna del transportador de glucosa bloquea el transporte de los azucares a través de él. Con este
procedimiento descrito en Bittner y colaboradores (Bittner et al., 2010), se ha medido la tasa
metabólica de astrocitos, miocitos, fibroblastos, líneas celulares y neuronas de 7 días in vitro,
pero nunca en neuronas bien desarrolladas de 14 días in vitro como fue realizado en este trabajo.
76
Esta aproximación en neuronas pudiera ser objetada ya que expone a neuronas a posibles efectos
de la citocalasina sobre los filamentos de actina lo que podría generar estrés celular con la
consecuente modificación metabólica. Para tener certeza de si la citocalasina pudiese generar
realmente una modificación mayor intracelular visible a nivel del metabolismo de glucosa, se
realizaron en el laboratorio controles con citocalasina-D, molécula similar a la citocalasina-B
pero que no se une al transportador de hexosas pero que afecta a los filamentos de actina. Como
la citocalasina-D no generó cambios a nivel metabólico, podemos concluir que el protocolo de
exposición a citocalasina-B y la estimación de la tasa metabólica a través del bloqueo del
transportador, resulta ser una buena estrategia para estimar la tasa metabólica. A esta
determinación se le denominó citoB.rate (figura 19A-B). Dentro de las mediciones realizadas se
pudieron distinguir dos poblaciones de neuronas en función de sus tasas metabólicas claramente
diferenciables: unas con tasas superiores a 3 µM/s tanto para las mediciones en presencia y
ausencia de lactato y las que tenían tasas menores al 3 µM/s para el consumo de glucosa (figura
19 D). Al analizar el total de las neuronas se observó un incremento del metabolismo en ausencia
de lactato, el cual está notoriamente incrementado en un 100± 15% al no considerar la población
celular con tasas altas. Una explicación para este fenómeno de existencia de dos poblaciones con
características dispares, pudiese estar relacionado a que las células rápidas, con tasas mayores a 3
µM/s, tienen tasas metabólicas muy similares a las tasas de clearence de glucosa (medida de la
disminución de glucosa cuando la hexosa es retirada del buffer de perfusión), por lo que en estas
células el metabolismo podría estar muy incrementando y ser insensible al lactato (tabla II).
77
5.5 El estado estacionario de glucosa responde de forma bifásica a la perturbación con
piruvato
Un antecedente más, que en base a los resultados obtenidos durante este trabajo, apoya la
estimulación aguda del metabolismo de glucosa en ausencia de lactato, es la verificación de una
respuesta bifásica observable en el estado estacionario de la glucosa en neuronas que están
activamente produciendo lactato (situación que sucede cuando hay ausencia de lactato en la
perfusión) y no consumiendo lactato (situación que sucede cuando se suplementa el lactato en la
perfusión) (figura 21) y son expuestas a un buffer adicionado con 10mM piruvato. El piruvato
es transportado por el transportador de monocarboxilato neuronal (MCT2) al igual que el lactato,
por lo que este protocolo produce en primera instancia la transaceleración del MCT2,
produciendo una disminución muy rápida del lactato glicolítico intracelular hasta niveles muy
cercanos a un valor de 0 mM lactato, generando así una activación mayor del metabolismo de la
glucosa (figura 22 A). A continuación genera un incremento de la glucosa el que es continuo por
todo el periodo de exposición a piruvato, para luego volver al estado estacionario con un pequeño
retraso atribuible a la gran concentración de piruvato aún presente intracelularmente y que estaría
satisfaciendo la demanda energética durante ese periodo (figura 22 B).
La inhibición metabólica por lactato ha sido informada por algunos autores atribuyéndola a
diferentes efectos del monocarboxilato sobre distintas enzimas del metabolismo de la glucosa, en
donde en primer lugar tenemos la demostración de la inhibición in vitro de la fosfofructoquinasa
1 por el desacoplamiento de sus monómeros constituyentes producto del lactato (Leite et
al.,2007,Leite et al., 2010). Estos resultados han sido demostrados en distintos tejidos tales
como corazón, hígado, riñón, pero no para neuronas, aún cuando no debiera generar un resultado
78
sino que similar al de los otros tejidos al tratarse de la misma isoforma enzimática, generandose
así una inhibición del metabolismo de la glucosa a nivel de la principal enzima reguladora de la
glicólisis. Estos resultados obtenidos a partir de tejidos fraccionados y a través de ensayos de
actividad enzimática en los homogeneizados, podrían realmente representar un efecto del lactato
sobre la PFK1 solo en las condiciones de experimentación, pero quizás no son representativos
de la fisiología celular, en donde un sinfín de vías metabólicas o metabolitos podrían ser los
responsables directos de la inhibición y no el lactato directamente sobre la enzima en cuestión o
como única señal asociada a la modulación metabólica observada.
Otra posibilidad propuesta a través de un modelo de experimentación menos invasivo, propone
la hipótesis del switch redox (Cerdán et al., 2006), en donde la presencia de un pool diferencial
de piruvato; uno glicolítico y otro producto de la conversión de lactato extracelular a piruvato
por la lactato deshidrogenasa 1 (LDH1), competiría con la gliceraldehido 3- fosfato
deshidrogenasa (GAPDH) por los equivalentes oxidativos o NAD+, inhibiendo de esta forma la
glicolisis y la formación y mantención del pool de piruvato glicolítico. Bajo este argumento, el
piruvato generado por la LDH1, nutriría a la mitocondria como sustrato para ser oxidado en el
ciclo de la ácidos tricarboxílicos y de esta forma mantener el estado energético celular. Galeffi
(Galeffi et al., 2007), aprovechando la posibilidad de medir la autofluorescencia del NAD(P)H a
360nm, ha observado como con concentraciones de glucosa similares a las utilizadas en este
trabajo de tesis, la presencia de lactato produce una respuesta bifásica a nivel del NAD(P)H,
favoreciendo el incremento de la fase reductora de la respuesta y disminuyendo la fase oxidativa,
lo que a la luz de nuestro resultados y los trabajos ya citados, podría deberse a la inhibición del
metabolismo glicolítico de la glucosa y un direccionamiento de glucosa hacia la vía de las
pentosas fosfato. En nuestra mediciones de metabolismo ésta fue observado con una
79
concentración de 1mM lactato en el buffer extracelular lo que haga suponer que el
direccionamiento hacia la via de las pentosas fosfato sea dependiente de la concentración de
lactato, observación que se deduce del aumento aún mayor observado en el nivel de glucosa en
estado estacionario al exponer a las neuronas a un buffer extracelular con 5 mM lactato o el inicio
de la acumulación de glucosa en células con un metabolismo muy alto como se observa en la
figura 11 C.
La pregunta que inmediatamente se produce es por qué si se está direccionando glucosa desde la
vía glicolítica a la de las pentosas fosfatos, se observa un incremento en la glucosa en estado
estacionario, aun cuando este direccionamiento se hace efectivo a partir de la glucosa 6-fosfato
momento en el cual el sensor FLIIPglu700µΔ6 ya no es capaz de sensar glucosa libre. Una
posible respuesta es que nuestras mediciones han sido realizadas en células en reposo no
estimuladas y sólo se ha evaluado el efecto del lactato sobre el metabolismo de la glucosa sin
evaluar cual es el efecto del glutamato, ni la estimulación eléctrica en conjunto con el lactato.
Shurr y Gozal han descrito la capacidad del lactato y no del piruvato, de proteger a las neuronas
del daño producto de la exposición a glutamato en experimentos en donde midieron el nivel de
especies reactivas de oxígeno (ROS) como consecuencia a la exposición de los dos
monocarboxilatos en rebanadas hipocampales (Schurr y Gozal, 2012). La explicación para estos
resultados pudiese radicar en que el lactato deriva la glucosa hacia la vía de las pentosas fosfato y
de esta forma se incrementa el NAD(P)H, con el cual se incrementa la reducción de glutatión
que serviría como atrapador de ROS. Bajo este modelo posiblemente, el incremento observado en
el nivel de la glucosa en estado estacionario en neuronas no estimuladas debido a la exposición a
lactato, podría deberse a que es el glutamato el encargado de la activación de la vía de las
pentosas fosfatos, de manera de controlar la citotoxicidad producto del neurotransmisor. Durante
80
actividad sináptica, se produce la liberación de glutamato al mismo tiempo que se observa un
incremento del lactato en el medio, el glutamato es captado por las neuronas post-sinápticas y
éstas generan una respuesta inmediata que en los primeros segundos es satisfecha
energéticamente por el consumo glicolítico de glucosa favoreciendo una fase oxidativa. Esta se
revierte rápidamente a una fase reductora con la llegada del lactato desde el medio extracelular re
direccionando así la glucosa hacia la vía de las pentosas fosfato de manera de incrementar el
poder reductor celular y ayudar al control del estrés oxidativo y la síntesis de moléculas
necesarias para la actividad neuronal. Con este argumento el lactato se encargaría de inhibir
parcial o totalmente la glicolisis al utilizar los equivalentes oxidativos para formar piruvato a
través de la LDH1 y de esta forma indirectamente inhibir la GAPDH, re direccionando y dejando
disponible glucosa para ser oxidada en la via de las pentosas fosfato (figura 23 A).
Por otro lado, teniendo en cuenta el efecto del lactato a nivel cerebral en una configuración más
lejana y no sólo considerando la hendidura sináptica como se discutió anteriormente, se debe
considerar que al generarse la estimulación en una zona del cerebro se liberan neurotransmisores
que generan una acción local, algunos iones que difunden distancias pequeñas y el lactato que es
capaz de difundir a través del tejido cerebral. Esta situación genera que neuronas muy lejanas al
punto donde se generó la estimulación, sí se enfrenten a una oleada de lactato sin necesidad de
ser excitadas con glutamato. Dado este fenómeno el lactato por si solo ejercería un efecto
inhibitorio sobre la glicolisis dejando disponible de esta manera la glucosa para ser redistribuida
hacia zonas de mayor actividad sináptica (figura 23 B).
Analizando el sistema en conjunto podemos proponer que el lactato genera una inhibición a nivel
glicolítico del metabolismo de la glucosa, re direccionando ésta hacia la vía de las pentosas
81
Figura 23. Modelo propuesto para el efecto del lactato. Se observa en el centro un diagrama
del cerebro en donde en el punto central de los círculos se produce una activación cerebral la cual
82
genera una oleada de lactato que difunde hacia la periferia. La respuesta para las neuronas en
ambos lugares: zona inmediata de activación (A) y periferia (B), frente al lactato es propuesta de
la siguiente manera. En la opción (A), que diagrama la situación que se produce en los
alrededores de la hendidura sináptica, el glutamato liberado por la neurona pre-sináptica estimula
la captación de glucosa por los astrocitos, los que incrementan su glicólisis y exportan lactato que
es captado por las neuronas a través del MCT2. Lo que se produce a continuación es que la
LDH1 compite con la GAPDH por el NAD+ disponible con lo que la glicólisis neuronal
disminuye y la glucosa queda así disponible para ir hacia la vía de las pentosas fosfato para
disminuir el estrés oxidativo producto de la exposición a glutamato. En (B), el lactato al inhibir la
glicólisis neuronal y utilizar lactato como mantenededor de la demanda energética, libera la
glucosa de ser utilizada en esa área y ésta queda disponible para ser re distribuida a áreas de
mayor necesidad energética como lo es el punto de activación.
83
fosfato para así incrementar el poder reductor necesario para proteger a las neuronas frente al
estrés oxidativo producto de la actividad sináptica y en neuronas alejadas del punto de liberación
de glutamato, re direcciona la glucosa hacia zonas de mayor actividad. Por su parte en este
proceso, al menos solo con la presencia de lactato y en ausencia de glutamato, el transporte se
mantendría constante y el lactato presente satisfacería la demanda energética celular a través de la
entrada a la mitocondria como piruvato, de manera de así generar la inhibición de la glicólisis a
nivel de la gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, al utilizar los equivalentes oxidantes en el
procesamiento del lactato.
84
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brain. Annu Rev Neurosci 2011; 34:467-469
29.-Pellerin L, Magistretti PJ. Glutamate uptake into astrocytes stimulates aerobic glycolisis: a
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30.- Pellerin, L., Pellegri, G., Bittar, P.G., Charnay, Y., Bouras, C.,Martin J.L., Stella, N.,
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lactate shuttle. Dev.Neurosci. 1998; 20,291-299
31.- Pellerin L, Bouzier-Sore AK, Aubert A, Serres S, Merle M, Costalat R, Magistretti PJ.
Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update. Glia. 2007;
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32.- Pinching AJ, Powell TP. The neuron types of the glomerular layer of the olfactory bulb. J
Cell Sci. 1971; 9(2):305-45.
90
33.-Porras OH, Loaiza A, Barros LF. Glutamate mediates acute glucose transport inhibition in
hippocampal neurons. J Neurosci 2004; 24:9669-9673.
34.-Prichard J, Rothman
D, Novotny
E, Petroff
O, Kuwabara
T, Avison
M, Howseman
A, Hanstock C, Shulman R. Lactate rise detected by 1H NMR in human visual cortex during
physiologic stimulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991; 88(13):5829-31.
35.- Ruminot I, Gutierrez R, Peña-Munzenmayer G, Añazco C, Sotelo-Hitschfeld T, Lerchundi
R, Niemeyer MI, Shull G, Barros LF. Opposite modulation of astrocytic and neuronal glycolysis
by extracellular potassium: commanding roles for the NBCe and intracellular pH. J.Neurosci,
2011; 31: 14264-14271
36.- Schurr A., Gozal E (2012). Aerobic production and utilization of lactate satisfy increased
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against oxidative stress. Front Pharmacol.
37.- Schurr A, West CA, Rigor BM . Lactate-supported synaptic function in the rat hippocampal
slice preparation. Science. 1988; 240(4857):1326-8.
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38.- Smith D, Pernet A, Hallet WA, Bingham E, Marsden PK, Amiel SA. Lactate: A preferred
fuel for human brain metabolism in vivo. J Cereb Bood Flow Metab 2003; 23:658-664.
39.- Svichar N, Esquenazi S, Chen H, Chesler M. Preemptive regulation of intracellular pH in
hippocampal neurons by a dual mechanism of depolarization-induced alkalinization. J Neurosci
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40.- Tabernero A, Vicario C, Medina JM . Lactate spares glucose as a metabolic fuel in neurons
and astrocytes from primary culture. Neurosci Res. 1996; 26(4):369-76.
41.- Wada H, Okada Y, Nabetani M, Nakamura H. The effects of lactate and betahydroxybutyrate on the energy metabolism and neural activity of hippocampal slices from adult
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neuronal energy source. JNeurosci. 2011 18;31(20):7477-85.
92
7. ANEXO
7.1 Activaciones oscilatorias a nivel glicolítico en neuronas
La glucosa y el lactato son los combustibles disponibles para las neuronas, además es de
conocimiento común que la demanda energética de la señalización neuronal es alta y a menudo
no es predecible, pero esto genera una combinación peligrosa para una célula con sus niveles
energéticos depletados. Por esta razón parece razonable esperar que las neuronas puedan contar
con mecanismos fácilmente capaces de ajustar su producción de energía a partir de glucosa o
lactato para satisfacer la demanda urgente impuesta por los potenciales post-sinápticos y los
potenciales de acción.
7.1.1 Oscilaciones espontáneas en los niveles de glucosa en neuronas
Ha sido observado en algunas neuronas en cultivo la aparición de oscilaciones espontaneas en los
niveles de glucosa intracelular medidos con el sensor FLIIPglu700µΔ6, fenómeno que no había
sido observado en astrocitos luego de varios años de estudio en este laboratorio. Las oscilaciones
van desde niveles mínimos de alrededor de 0,2mM glucosa hasta máximos de 0,8mM utilizando
un buffer de perfusión con una concentración de 2mM glucosa y 1mM lactato. La frecuencia de
cada una de estas oscilaciones es de alrededor de 5 minutos entre pico y pico y desaparece
transitoriamente durante la exposición de las células a concentraciones de 0mM glucosa y 1mM
lactato en el buffer de perfusión, para reanudar el fenómeno oscilatorio inmediatamente ante la
reposición del buffer suplementando con glucosa y lactato en las concentraciones mencionadas
93
anteriormente. Al exponerlas luego a un buffer solo suplementado con glucosa, las oscilaciones
se mantienen en el tiempo con una frecuencia similar pero con picos de glucosa de solo 0.5mM
glucosa (figura A1 A).
Este fenómeno se pudiese producir por dos situaciones en relación a los flujos de glucosa que
existen celularmente: transporte o metabolismo. Por una parte una ciclación de la capacidad de
translocación de hexosas del GLUT3 podría generar los incrementos instantáneos de glucosa en
cada evento de activación y a continuación el metabolismo se encargaría de llevar la glucosa a
concentraciones menores. Otra posibilidad podría generar una ciclación del transportador de
glucosa, el que instantáneamente exportara glucosa desde el medio intracelular al extracelular,
condición que se generaría en contra una gradiente de concentración, lo cual parece poco
probable puesto que el transportador ha sido reportado ser pasivo y no concentrativo. Desde la
perspectiva del metabolismo cada disminución pudiese deberse a un incremento instantáneo del
metabolismo o una disminución de este la cual estaría ciclando cada 5 minutos.
7.1.2 Oscilaciones espontáneas en los niveles de lactato en neuronas
Con la capacidad de sensar lactato intracelular que nos otorga el sensor de lactato LACONIC, se
realizaron mediciones de lactato intracelular en neuronas y el fenómeno de las oscilaciones
también pudo ser observado en un grupo menor de células.
A nivel de las mediciones de lactato existen 3 flujos que alimentan este pool: el lactato
extracelular que es importado y exportado a través del transportador de monocarboxilatos
94
Figura A1. Oscilaciones metabólicas espontaneas en neuronas. (A) Curso temporal de una
medición de glucosa en donde se observan las oscilaciones tanto en presencia de lactato
(amarillo) como en su ausencia (B) Oscilaciones a nivel del lactato intracelular. Se observan dos
exposiciones al inhibidor del MCT2 (rojo). La continuidad del ciclo es eliminada al suplementar
la célula sólo con lactato en el buffer de perfusión. (C) Medición de Ca2+ intracelular en donde
se observa un patrón ciclador en minutos.
95
neuronal MCT2 en un estado dinámico de captación y exportación, un lactato de origen
glicolítico proveniente de la oxidación de la glucosa, y un flujo que consume el lactato como
sustrato energético de las mitocondrias, a través de la formación de piruvato producto de la
enzima lactato deshidrogenasa 1, o directamente como lactato tal y como lo expone la teoría de la
lanzadera de lactato intracelular.
En células expuestas a un buffer de perfusión suplementando con 2mM glucosa y 1mM lactato
las oscilaciones no se manifestaron a niveles de las mediciones de lactato intracelular, pero si
fueron visibles inmediatamente después de haber sacado el lactato del buffer de perfusión. Esta
oscilación en función de los flujos antes planteados pudiese deberse por tanto a la exportación de
lactato a través del MCT2 en una configuración cicladora. Para poder determinar si esta era la
situación que se observaba, se realizó una exposición de 5 minutos al inhibidor del transportador
de monocarboxilatos neuronal AR-C1555858, con lo cual si la oscilación de lactato era eliminada
este ciclo sería respuesta a la ciclación del MCT2. Sin embargo, lo que se observó fue que la
situación no cambió y las oscilaciones se mantuvieron durante la exposición al inhibidor.
La siguiente posibilidad a nivel de los cambios oscilatorios a nivel de lactato podía deberse a la
capacidad de la mitocondria de estar ciclando y en periodos de 5 minutos incrementar y disminuir
sus necesidades energéticas. Para evaluar esta posibilidad suplementamos a las neuronas sólo con
un buffer con una concentración de 1mM lactato. Lo esperado frente a esta opción es que si la
mitocondria efectivamente fuese la responsable del fenómeno oscilatorio, el lactato debiera
continuar oscilando con el mismo periodo, pero por el contrario, una vez que las neuronas fueron
suplementadas solo con lactato y ausencia de glucosa, las oscilaciones no fueron observables.
96
Bajo esta perspectiva y en función del único flujo que quedaba por evaluar y además el que
genera el vinculo entre las oscilaciones observadas tanto a nivel de glucosa como de lactato, la
conclusión es que la oscilación es gatillada a nivel glicolítico, de forma muy rápida y en respuesta
a una señal hasta ahora no conocida. Las implicancias de este hallazgo, más allá de ser una
situación fisiológica o patológica gatillada en neuronas con altos niveles de estrés metabólico o
estimulada en respuesta a cambios a nivel redox, presenta por primera vez una situación en donde
las neuronas son capaces generar un cambio metabólico a nivel de la glicólisis en cosa de
segundos (figura A1 B).
En las primeras aproximaciones realizadas para poder desenmascarar este fenómeno, se
realizaron mediciones de calcio intracelular con la sonda Fluo-4. Observamos que de manera
espontanea una población de las células registradas presentaba oscilaciones de calcio en minutos
y no como comúnmente una neurona presentaría las oscilaciones de este catión en segundos. Esta
observación de todas formas pudiese o no ser parte del fenómeno, pero es la primera evaluación
que se ha realizado con el propósito de entender lo que sucede. Las próximas mediciones se
realizarán en buffer sin calcio o con bloqueadores para los canales de calcio de manera de
determinar si las oscilaciones permanecen o no bajo estas condiciones y a continuación afirmar o
descartar una conexión entre el calcio y las oscilaciones glicolíticas (figura A1 C).