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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA
CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA
EVALUACIÓN DE ENZIMA BIODEGRADADORA DE HAP`S OBTENIDA A PARTIR
DEL MICELIO DE HONGOS AGARICOIDES.
TRABAJO DE GRADO PARA LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERO QUÍMICO
AUTOR: JORGE ANDRÉ GORTAIRE OLEAS
TUTOR: ING. LORENA ELIZABETH VILLARREAL VILLOTA, M.Sc.
QUITO
2015
i
APROBACIÓN DEL TUTOR
Certifico
que
el
Trabajo
de
Grado
titulado
“EVALUACIÓN
DE
ENZIMA
BIODEGRADADORA DE HAP`S OBTENIDA A PARTIR DEL MICELIO DE HONGOS
AGARICOIDES.”, es original y ha sido desarrollada por el señor Jorge André Gortaire Oleas,
bajo mi dirección y conforme a todas las observaciones realizadas.
En la ciudad de Quito, a los 23 días del mes de enero de 2015.
Ing. Lorena Elizabeth Villarreal Villota, M.Sc.
PROFESOR TUTOR
ii
AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL
Yo, JORGE ANDRÉ GORTAIRE OLEAS, en calidad de autor del Trabajo de Grado titulado
EVALUACIÓN DE ENZIMA BIODEGRADADORA DE HAP`S OBTENIDA A PARTIR
DEL MICELIO DE HONGOS AGARICOIDES, por la presente autorizo a la UNIVERSIDAD
CENTRAL DEL ECUADOR, hacer uso de todos los contenidos que me pertenecen o de parte
de los que contiene esta obra, con fines estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente autorización,
seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los artículos 5, 6, 8, 19 y
demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su Reglamento.
Quito, 23 de enero de 2015.
Jorge André Gortaire Oleas
CI: 1718755075
jorge_jah316@hotmail.com
iii
A mi mami, hermanos,
amigos, profesores,
ayudantes y ayudados.
A todos quienes me brindaron
su apoyo durante
la realización de este trabajo.
Con mucho cariño
y respeto.
iv
AGRADECIMIENTOS
Mis sinceros agradecimientos a:
Mi madre y hermanos, por su apoyo durante mi carrera universitaria.
A la Ing. Lorena Villareal, tutora de mi trabajo de grado, por su guía durante el desarrollo de mi
tesis.
Al Dr. Paul Gamboa, por su apoyo mediante los proyectos de investigación.
Al Dr. Ullrich Stahl, Ing. Carlos Guepud y Bioq. Darwin Roldán, por la cooperación brindada
durante el desarrollo experimental.
A Ian Cortez y Pablo Londoño por sus ideas durante el desarrollo experimental.
A mis amigos, amigas y compañeros, por las experiencias vividas a lo largo de mi carrera
universitaria.
v
CONTENIDO
Pág.
LISTA DE FIGURAS .................................................................................................................. xii
LISTA DE GRÁFICOS .............................................................................................................. xiii
LISTA DE ANEXOS .................................................................................................................. xiv
LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS ........................................................................... xv
RESUMEN.................................................................................................................................. xvi
ABSTRACT ............................................................................................................................... xvii
INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 1
1. MARCO TEÓRICO ................................................................................................................. 2
1.1. Biorremediación. ................................................................................................................... 2
1.1.1. Definición............................................................................................................................ 2
1.1.2. Tipos de contaminantes....................................................................................................... 3
1.1.2.1. HAP’S. .............................................................................................................................. 3
1.1.3. Métodos tradicionales de remediación de suelo. ................................................................ 4
1.1.3.1. Incineración...................................................................................................................... 4
1.1.3.2. Solidificación/Estabilización (S/E). .................................................................................. 5
1.1.3.3. Extracción de vapores. ..................................................................................................... 5
1.1.3.4. Desorción Térmica. .......................................................................................................... 5
1.1.4. Micorremediación. .............................................................................................................. 5
1.2. Hongos................................................................................................................................... 6
1.2.1. Definición............................................................................................................................ 6
vi
1.2.2. Partes del hongo. ................................................................................................................ 6
1.2.3. Importancia de los hongos. ................................................................................................. 7
1.3. Enzimas. ................................................................................................................................ 7
1.3.1. Generalidades. .................................................................................................................... 7
1.3.2. Clasificación. ...................................................................................................................... 7
1.3.3. Mecanismo de reacción. ..................................................................................................... 8
1.3.4. Cofactores. .......................................................................................................................... 8
1.3.5. Centro Activo. ..................................................................................................................... 9
1.3.6. Complejo Enzima-Sustrato. ................................................................................................ 9
1.3.7. Cinética Enzimática. ......................................................................................................... 10
1.4. Actividad Enzimática. ......................................................................................................... 10
1.4.1. Factores que afectan la actividad enzimática................................................................... 11
1.4.1.1. Efecto del pH. ................................................................................................................. 11
1.4.1.2. Efecto de la temperatura. ............................................................................................... 12
1.4.2. Rasgos característicos de las enzimas como catalizadores. ............................................. 12
1.5. Enzimas fúngicas. ................................................................................................................ 13
1.5.1. Hongos productores de enzimas. ...................................................................................... 13
1.5.2. Enzimas producidas. ......................................................................................................... 13
1.5.3. Clasificación de enzimas producidas................................................................................ 13
1.5.4. Lignino Peroxidasa. .......................................................................................................... 13
2. MARCO EXPERIMENTAL ................................................................................................. 15
2.1. Descripción del proceso. ..................................................................................................... 15
2.2. Proceso experimental seleccionado. .................................................................................... 17
2.3. Diseño Experimental. .......................................................................................................... 17
2.3.1. Parámetros fijos. ............................................................................................................... 20
2.3.2. Parámetros variables. ........................................................................................................ 21
2.3.3. Parámetro de evaluación y optimización. ......................................................................... 22
vii
2.4.
Materiales y Equipos......................................................................................................... 23
2.4.1. Reproducción de las cepas................................................................................................ 23
2.4.1.1. Preparación del agar papa dextrosa para el inóculo. ................................................... 23
2.4.1.2. Inoculación del hongo en el medio de cultivo agar papa dextrosa. ............................... 23
2.4.1.3. Crecimiento del hongo en el medio de cultivo agar papa dextrosa. .............................. 23
2.4.2. Determinación de la lignino peroxidasa en el medio contaminado.................................. 23
2.4.2.1. Preparación del agar papa dextrosa para el inóculo en el medio contaminado. .......... 23
2.4.2.2. Inoculación del hongo en el medio de cultivo agar papa dextrosa en conjunto con
el contaminante. .......................................................................................................................... 24
2.4.2.3. Crecimiento del hongo en el medio de cultivo agar papa dextrosa en conjunto con
el contaminante. .......................................................................................................................... 24
2.4.2.4. Muestreo para determinación de lignino peroxidasa..................................................... 24
2.4.2.5. Determinación de lignino peroxidasa por espectrofotometría....................................... 24
2.4.3. Cuantificación de HAP´s en el Crudo............................................................................... 24
2.5. Sustancias y Reactivos. ....................................................................................................... 25
2.5.1. Reproducción de las cepas................................................................................................ 25
2.5.2. Determinación de lignino peroxidasa. .............................................................................. 25
2.5.3. Cuantificación de HAP´s en el crudo. .............................................................................. 25
2.6. Procedimiento. ..................................................................................................................... 25
2.6.1. Reproducción de las cepas................................................................................................ 25
2.6.1.1. Preparación del agar papa dextrosa para el inóculo. ................................................... 25
2.6.1.2. Inoculación del hongo en el medio de cultivo agar papa dextrosa. ............................... 26
2.6.1.3. Crecimiento del hongo en el medio de cultivo agar papa dextrosa. .............................. 26
2.6.2. Determinación de la Lignino Peroxidasa en el medio contaminado. ............................... 26
2.6.2.1. Preparación del agar papa dextrosa para el inóculo en el medio contaminado. .......... 26
2.6.2.2. Inoculación del hongo en el medio de cultivo agar papa dextrosa. ............................... 27
2.6.2.3. Crecimiento del hongo en el medio de cultivo agar papa dextrosa en conjunto con
el contaminante. .......................................................................................................................... 27
viii
2.6.2.4. Muestreo para determinación de lignino peroxidasa..................................................... 27
2.6.2.5. Determinación de lignino peroxidasa por espectrofotometría....................................... 28
3. DATOS EXPERIMENTALES. ............................................................................................. 29
3.1. Actividad Enzimática de la Lignino Peroxidasa.................................................................. 29
3.1.1. Datos de absorbancias obtenidas. .................................................................................... 29
3.2.
Reducción de HAP’s en las muestras. .............................................................................. 31
3.2.1. Datos iniciales de los HAP’s en las muestras................................................................... 31
3.2.2. Datos finales de HAP’s posterior al tratamiento con los hongos. .................................... 32
3.3.
Optimización. .................................................................................................................... 32
4. CÁLCULOS........................................................................................................................... 33
4.1. Cálculo de la actividad enzimática de lignino peroxidasa. .................................................. 33
4.2. Cálculo de la reducción de HAP’s en las muestras. ............................................................ 33
4.3. Cálculo de la optimización. ................................................................................................. 33
5. RESULTADOS ...................................................................................................................... 34
5.1. Resultados de la actividad enzimática de lignino peroxidasa.............................................. 34
5.2. Resultados de la reducción de HAP’s en las muestras. ....................................................... 37
5.3. Resultados de la optimización. ............................................................................................ 41
5.3.1. Efectos principales de variables sobre la variable respuesta. ............................................ 41
5.3.1.1. Efectos principales sobre la actividad enzimática para el Aspergillus terreus. .............. 41
5.3.1.2. Efectos principales sobre la actividad enzimática para el Penicillium corylophilum. .... 42
5.3.2. Optimización. .................................................................................................................... 42
5.3.2.1. Superficie de Respuesta para el Aspergillus en el día de ensayo 15. ............................. 43
5.3.2.2. Superficie de Respuesta para el Penicillium en el día de ensayo 13. ............................. 44
6. DISCUSIÓN .......................................................................................................................... 45
ix
7. CONCLUSIONES ................................................................................................................. 48
8. RECOMENDACIONES ........................................................................................................ 50
CITAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................................................... 51
BIBLIOGRAFÍA......................................................................................................................... 54
ANEXOS..................................................................................................................................... 55
x
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Parámetros fijos definidos para la experimentación...................................................... 20
Tabla 2. Valores considerados para experimentación de los parámetros variables..................... 21
Tabla 3. Codificación de las mezclas durante la experimentación.............................................. 21
Tabla 4. Absorbancias obtenidas para el Aspergillius en sus diferentes condiciones. ................ 29
Tabla 5. Absorbancias obtenidas para el Penicillium en sus diferentes condiciones. ................. 30
Tabla 6. Valores iniciales de HAP’s en las muestras. ................................................................. 31
Tabla 7. Valores de HAP´s posterior al tratamiento en las muestras .......................................... 32
Tabla 8. Resultados de la actividad enzimática para el Aspergillius en sus diferentes
condiciones.................................................................................................................................. 34
Tabla 9. Resultados de la actividad enzimática para el Penicillium en sus diferentes
condiciones.................................................................................................................................. 35
Tabla 10. Porcentaje de Reducción de HAP's en las muestras. ................................................... 37
Tabla 11. Resultados de maximización de la actividad enzimática de LiP para el
Aspergillius. ................................................................................................................................ 43
Tabla 12. Resultados de maximización de la actividad enzimática de LiP para el
Penicillium. ................................................................................................................................. 44
xi
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Parámetros implicados en la biorremediación. ............................................................. 2
Figura 2. Estructura de los 16 HAP’s con alto potencial cancerígeno o mutagénico.................... 4
Figura 3. Representación de un hongo con las partes que lo constituyen. .................................... 6
Figura 4. Ubicación esquemática del centro activo de la enzima................................................. 9
Figura 5. Formación del Complejo Enzima – Sustrato ................................................................ 9
Figura 6. Representación del efecto del pH sobre la actividad enzimática. ................................ 11
Figura 7. Representación del efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática. ............... 12
Figura 8. Secuencia de reacciones de las Lignino Peroxidasas. ................................................. 14
Figura 9. Diagrama de flujo con la descripción del proceso. ...................................................... 16
Figura 10. Diseño Experimental para determinación de la Lignino Peroxidasa en
Aspergillus................................................................................................................................... 18
Figura 11. Diseño Experimental para determinación de la Lignino Peroxidasa en
Penicillium. ................................................................................................................................. 19
Figura 12. Diseño factorial de 22. ................................................................................................ 20
Figura 13. Diseño factorial 22 con nomenclatura y valores......................................................... 22
xii
LISTA DE GRÁFICOS
Pág.
Gráfico 1. Aspergillius - Actividad Enzimática = f (Días de ensayo) ......................................... 36
Gráfico 2. Penicillium - Actividad Enzimática = f (Días de ensayo) .......................................... 36
Gráfico 3. Concentración de HAP’s antes y después del tratamiento para el caso del
Penicilliuma las condiciones de E. .............................................................................................. 38
Gráfico 4. Concentración de HAP’s antes y después del tratamiento para el caso del
Penicillium a las condiciones de C. ............................................................................................. 39
Gráfico 5. Concentración de HAP’s antes y después del tratamiento para el caso del
Aspergillius a las condiciones de I. ............................................................................................. 39
Gráfico 6. Concentración de HAP’s antes y después del tratamiento para el caso del
Penicillium a las condiciones de I. .............................................................................................. 40
Gráfico 7. Concentración de HAP’s antes y después del tratamiento para el caso del
Penicilliuma las condiciones de I. ............................................................................................... 40
Gráfico 8. Efectos principales para la actividad enzimática del Aspergillius en el día de
ensayo 15..................................................................................................................................... 41
Gráfico 9. Efectos principales para la actividad enzimática del Penicillium en el día de
ensayo 13..................................................................................................................................... 42
Gráfico 10. Superficie de respuesta para el Aspergillius en el día de ensayo 15. ....................... 43
Gráfico 11. Superficie de Respuesta para el Penicillium en el día de ensayo 13 ........................ 44
xiii
LISTA DE ANEXOS
Pág.
ANEXO A. Materiales utilizados para la reproducción de las cepas. ......................................... 56
ANEXO B. Visualización de las placas con los diferentes hongos. ........................................... 57
ANEXO C. Extracción de las muestras para la posterior medición de actividad enzimática. .... 58
ANEXO D. Equipo utilizados en la medición de la actividad enzimática de
Lignino Peroxidasa...................................................................................................................... 60
xiv
LISTA DE ABREVIATURAS Y SÍMBOLOS
ULiP/L
Unidades de actividad Lignino Peroxidasa por litro de muestra.
Abs
Absorbancia.
Vt
Volumen total.
Fd
Factor de dilución.
t
Tiempo de ensayo.
ɛ
Factor de extracción.
Vm
Volumen de muestra.
%vc/vm
Porcentaje de volumen de contaminante en relación al volumen de medio de
cultivo.
A
Condiciones de la muestra pH 3,5 y concentración de contaminante 0,5%.
B
Condiciones de la muestra pH 5 y concentración de contaminante 0,5%.
C
Condiciones de la muestra pH 6,5 y concentración de contaminante 0,5%.
D
Condiciones de la muestra pH 3,5 y concentración de contaminante 1%.
E
Condiciones de la muestra pH 5 y concentración de contaminante 1%.
F
Condiciones de la muestra pH 6,5 y concentración de contaminante 1%.
G
Condiciones de la muestra pH 3,5 y concentración de contaminante 1,5%.
H
Condiciones de la muestra pH 5 y concentración de contaminante 1,5%
I
Condiciones de la muestra pH 6,5 y concentración de contaminante 1,5%
P–C
Penicillium a las condiciones de C.
P–E
Penicillium a las condiciones de E.
P–I
Penicillium a las condiciones de I.
A–C
Aspergillus a las condiciones de C.
A–I
Aspergillus a las condiciones de I.
xv
EVALUACIÓN DE ENZIMA BIODEGRADADORA DE HAP’S OBTENIDA A PARTIR
DEL MICELIO DE HONGOS AGARICOIDES.
RESUMEN
Evaluación de la producción de la enzima lignino peroxidasa obtenida a partir del micelio de
hongos agaricoides y de su capacidad de biorremediación de suelos contaminados con
hidrocarburos aromáticos policíclicos, HAP’s.
La experimentación se realizó en tres etapas: 1) Identificación, obtención y reproducción de las
cepas de Aspergillus terreus y Penicillium corylophilum; 2) Inoculación de las cepas en el
medio de cultivo al que se adiciona el contaminante (petróleo crudo) y cuantificación de la
enzima lignino peroxidasa mediante el método de Kirk & Farrel. Se trabajó con tres valores de
pH: 3,5; 5 y 6,5 y de concentración de crudo: 0,5; 1 y 1,5%v / v. 3) Cuantificación de los HAP’s
mediante el método ASTM D7363-07 antes y después de la inoculación de las cepas en los
medios de cultivo con crudo.
Mediante el método estadístico de superficie de respuesta se encontraron las condiciones
óptimas para la máxima producción de la enzima, así para el hongo Aspergillus terreus fue en el
día de ensayo 15, a un pH de 6,2 y una concentración de 0,5%, y para el otro fue en el día 13, a
un pH de 5,2 y una concentración de 0,88%. Se concluyó que la máxima reducción de HAP’s
para el hongo Aspergillus terreus fue de 98,13% a un pH de 6,5 y una concentración de 0,5%, y
para el otro fue de 98,98% a un pH de 5 y una concentración de 1%.
PALABRAS
CLAVES:
/
ENZIMAS
/
BIORREMEDIACIÓN
/
HONGOS
/
MICROMYCETOS / ASPERGILLUS TERREUS / PENICILLIUM CORYLOPHILUM /
HIDROCARBUROS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS / PRODUCCIÓN /
xvi
EVALUATION OF THE BIODEGRADING ENZYME OF POLYCICLIC AROMATIC
HYDROCARBONS, OBTAINED FROM MYCELIUM OF AGARICOID FUNGI
ABSTRACT
Evaluation in the production of enzyme denominated lignin peroxidase that was obtained from
the mycelium of the agaricoid fungi and evaluation of its capacity for bioremediation in soils
that have been contaminated with polycyclic aromatic hydrocarbons, the PAH’s.
The experiment was conducted in three stages: 1) Identification, obtaining and reproduction of
Aspergillus terreus strains and Penicillium corylophilum strains; 2) inoculation of the strains in
the growing environment which was contaminated with (crude oil) and with a quantification of
lignin peroxidase enzyme using the Kirk & Farrel method. It was worked with three pH values:
3.5, 5 and 6.5 and with oil concentration of: 0.5, 1 to 1.5 % v/v. 3) Quantitation of the PAH’s
using the method ASTM D7363-07 before and after the inoculation of the strains in the
environment contaminated with crude oil.
Optimum conditions for maximum production of the enzyme were found using the statistical
method for response of the surface; in the case of fungus Aspergillus terreus occurred on the
trial day 15, with pH 6.2 and concentration of 0.5 %; in the other strain occurred on, the 13th trial
day, with pH 5.2 and concentration of 0.88%. In conclusion the maximum reduction for the
fungus Aspergillus terreus in the polycyclic aromatic hydrocarbons was 98.13% with pH 6.5
and concentration 0.5%; and for the other strain was 98.98% at a pH 5 and concentration of 1%.
KEYWORDS:
/ ENZYMES / BIOREMEDIATION / FUNGI / MICROMYCETOS /
ASPERGILLUS TERREUS / PENICILLIUM CORYLOPHILUM / POLYCYCLIC
AROMATIC HYDROCARBONS / PRODUCTION /
xvii
INTRODUCCIÓN
Los procesos productivos relacionados a la actividad humana, dejan como resultado una
contaminación hacia el ambiente, las tendencias a nivel mundial se orientan hacia la
disminución de espacios contaminados, sea esto mediante técnicas de prevención o bien de
remediación.
En el pasado se utilizaban técnicas de remediación físicas o fisicoquímicas, las mismas que han
sido probadas extensamente y son conocidas por su efectividad, estos procesos necesitan de la
dosificación de aditivos encapsulantes o de elevadas temperaturas, por lo que aquellas técnicas
tienen la desventaja de generar un tipo diferente de contaminación como pueden ser físicas o
químicas, además de sus costos elevados de operación. Por lo que se han evaluado diferentes
técnicas innovadoras con la finalidad de alcanzar aquella efectividad, pero logrando la
disminución de sus costos. Entre las técnicas innovadoras para lograr estos objetivos se evaluó a
la biorremediación con hongos como una posible solución, debido a que esta técnica ofrece la
ventaja de tener un bajo costo de operación, y no deja una contaminación diferente en el sitio de
remediación, por el uso de organismos endémicos; además reemplaza en su totalidad a las
técnicas en las que se utiliza aditivos encapsulantes o elevadas temperaturas con la obtención
de resultados similares.
En el presente trabajo se evaluó el desempeño de producción de la enzima lignino peroxidasa,
trabajos anteriores verifican la oxidación de los HAP’s, así como también el impacto que tiene
en la remediación de suelos contaminados con hidrocarburos. El trabajo se desarrolló con la
utilización de muestras de crudo procedentes de los pozos petroleros de la Amazonía, además
se constataron las condiciones en las que se presentó una mayor cantidad de producción de
enzima.
Los resultados obtenidos fueron analizados mediante técnicas de absorbancia para cuantificar la
actividad enzimática, con el fin de contar con suficiente información para evidenciar si existe la
producción de enzima en los diferentes medios de cultivo. Después de dar un tratamiento
estadístico a los resultados obtenidos, se definieron las mejores condiciones de experimentación,
además de la muestra en la que ocurrió la mayor oxidación de los hidrocarburos aromáticos
policíclicos, conociendo que mediante reacciones enzimáticas llegan a ser una fuente de
nutrientes para la alimentación del hongo.
1
1. MARCO TEÓRICO
1.1. Biorremediación.
1.1.1. Definición. La biorremediación es el proceso mediante el cual diferentes tipos de seres
vivos con la capacidad de transformar compuestos orgánicos peligrosos a compuestos menos
peligrosos realizan este proceso. Todo esto lo hacen mediante la capacidad de producción de
enzimas específicas para la degradación o por medio de su potencial metabólico [1]. La
tecnología empleada en la biorremediación puede ser utilizada para limpiar terrenos o aguas
contaminadas [2].
La biorremediación tiene un ámbito de aplicabilidad muy amplio, por lo que se ha clasificado en
función de los estados de la materia en los que se puede emplear [3]:
• Sólido: sus principales aplicaciones se dan sobre medios contaminados como suelos o
sedimentos, o bien directamente en lodos, residuos, etc.
• Líquido: Se ha aplicado esta tecnología en aguas superficiales, subterráneas y residuales.
• Gases: se emplea en emisiones industriales, además de productos derivados del tratamiento
de aguas o suelos.
Figura 1. Parámetros implicados en la biorremediación.
Fuente: Walter, M, Manual of Environmental Microbiology, Washington DC, ASM, 1997,
pp. 753. [Fecha de consulta: 23 Agosto 2014]. Disponible en:
<http://ingenierosdeminas.org/docu/documentos/fundamentos_%20biorremediacion.pdf.>.
2
1.1.2.
Tipos de contaminantes. Al seleccionar una tecnología de remediación, es esencial
contar con la información del tipo de contaminante presente, principalmente se debe conocer el
tipo de compuesto y su origen, además de su concentración. Los compuestos químicos se
clasifican en orgánicos e inorgánicos. La característica de los primeros es el estar compuestos de
carbono y tienen un origen antropogénico o natural. A diferencia de los compuestos orgánicos,
los compuestos inorgánicos no contienen en su estructura átomos de carbono e incluyen a los
metales y los compuestos organometálicos. Se ha dividido a su vez a los compuestos orgánicos
es seis grupos [4]:
• Compuestos orgánicos volátiles (COV) no halogenados.
• Compuestos orgánicos volátiles halogenados.
• Compuestos orgánicos semivolátiles (COS) no halogenados.
• Compuestos orgánicos semivolátiles halogenados.
• Combustibles.
• Explosivos.
Se ha realizado una clasificación en función de los contaminantes que pueden ser tratados
mediante la biorremediación [5][6]:
• Hidrocarburos de todo tipo (alifáticos, aromáticos, BTEX, HAP’s,…).
• Hidrocarburos clorados (PCB’s, TCE, PCE, pesticidas, herbicidas,…).
• Compuestos nitroaromáticos (TNT y otros).
• Metales pesados: Estos no se metabolizan por los microorganismos de manera apreciable,
pero pueden ser inmovilizados o precipitados.
• Otros contaminantes: Compuestos organofosforados, cianuros, fenoles, etc.
1.1.2.1. HAP’S. Los hidrocarburos aromáticos policíclicos han llamado la atención últimamente
debido a que según estudios se ha determinado que dichos compuestos son altamente
cancerígenos e incluso mutagénicos, por lo que se ha estudiado casos en los que se podría dar
este tipo de contaminación hacia el ambiente y se ha llegado a la conclusión que estos
compuestos son generalmente formados por la combustión incompleta o la pirólisis de material
orgánico como son el petróleo, gas de petróleo, carbón y madera [7].
3
La EPA (Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos) ha clasificado a estos
compuestos como contaminantes prioritarios, entre los que se destacan 16 HAP’s
(Véase Figura 2) debido a su alto potencial cancerígeno o mutagénico [8][9][10].
Figura 2. Estructura de los 16 HAP’s con alto potencial cancerígeno o mutagénico.
Fuente: Villanyi, Vanda, “Air Pollution”, BYNC 3.0, 2010. [Fecha de consulta: 18 Noviembre
2014]. Disponible en: <http://www.scielo.br/img/revistas/jbchs/v19n6/a06fig01.gif.>.
1.1.3. Métodos tradicionales de remediación de suelo. Se conocen como tecnologías
tradicionales a las que se utilizan comúnmente a gran escala y ha sido probada su efectividad.
Además la información sobre aquellas tecnologías es de fácil acceso. Entre las tecnologías
tradicionales se tiene a la incineración, la solidificación/estabilización (S/E), la extracción de
vapores y la desorción térmica.
1.1.3.1. Incineración. En este tipo de operación se utilizan muy altas temperaturas las mismas
que llegan hasta los 1200 ºC, con el objetivo de lograr quemar compuestos orgánicos y
halogenados en presencia de oxigeno o volatilizarlos. Este tipo de tecnología tiene una alta
eficiencia en cuanto a la remoción de contaminantes, pero tiene la problemática de la
degeneración de gases de combustión los mismos que deberán ser tratados posteriormente.
4
1.1.3.2. Solidificación/Estabilización (S/E). Es el proceso mediante el cual se inmovilizan los
contaminantes del suelo por medio de la adición de aditivos, reduciendo su tendencia hacia la
lixiviación. Se dice que el proceso se divide en dos partes: 1) La solidificación, en la misma se
tiene como objetivo el encapsulamiento del contaminante, conformando un material sólido, sin
la necesidad de que exista una interacción química entre el contaminante y el solidificante. En la
estabilización se adicionan materiales como cemento Portland para limitar la solubilidad y
movilidad de los contaminantes, teniéndolos así en una forma menos móvil o tóxica.
1.1.3.3. Extracción de vapores. En dicha tecnología se aplica un vacío al suelo, con el fin de
que los compuestos logren volatilizarse y vaporizarse, mediante la inducción de un flujo de aire.
Es un tipo de tecnología generalmente in situ, la efectividad depende principalmente de la
volatilidad de los contaminantes, la permeabilidad y homogeneidad del suelo.
1.1.3.4. Desorción Térmica. En los procesos de desorción térmica se calienta el suelo
contaminado hasta temperaturas entre los 90 ºC a 540 ºC, para así lograr vaporizarlos, logrando
la separación del suelo. Se conoce que el calor acelera el transporte de los contaminantes a
través del suelo, los contaminantes deberán ser llevados a un tratamiento de gases posterior, con
el uso de gases acarreadores o sistemas de vacío. En un proceso físico no destructivo, se lo
clasifica en base a la temperatura de operación en dos grupos:
a) Desorción térmica de alta temperatura. Se alcanzan temperaturas que van desde los 320 ºC
a los 540 ºC. Se utilizan en combinación con la solidificación/estabilización y la
incineración, dependiendo de sus condiciones.
b) Desorción térmica de baja temperatura. Se calientan los desechos a temperaturas entre 90
ºC y 320 ºC. Es una tecnología altamente probada en el tratamiento de varios tipos de suelo
contaminados con BTX (benceno, tolueno y xileno) [11].
1.1.4.
Micorremediación. En la micorremediación se emplean hongos con el fin de degradar
componentes que llegan a ser contaminantes para el ambiente. Esto gracias a la capacidad que
tienen ciertos hongos de degradar moléculas orgánicas. Se emplean estos hongos en forma de
una mezcla del micelio con el suelo contaminado, donde ocurre la secreción de enzimas que
digieren la lignina y celulosa, estas enzimas al no ser tan específicas tienen la habilidad de
descomponer un amplio grupo de toxinas que tienen enlaces similares a los de la madera [12].
Se sabe que los hongos de pudrición blanca son los que tienen la mayor capacidad de
degradación de HAP’s hasta con seis anillos aromáticos [13][14], reduciendo su toxicidad [15].
5
1.2. Hongos.
1.2.1. Definición. Los hongos son un grupo de organismos eucariotas en los que se encuentran
mohos, levaduras y setas. Se encuentran divididas en un reino distinto al del resto,
principalmente por la constitución de su pared celular que a diferencia del reino vegetal en lugar
de celulosa contiene quitina. Los hongos son un grupo muy numeroso de organismos.
Aproximadamente se han descrito taxonómicamente 500.000, pero existe la estimación que
podrían existir entre 1 y 1.5 millones de especies [16].
1.2.2. Partes del hongo. En cuanto al estudio del hongo se pueden diferenciar dos partes
fundamentales que constituyen el hongo como son el cuerpo vegetativo y el cuerpo reproductor,
como se observa en la Figura 3. El cuerpo vegetativo esta principalmente compuesto por un
conjunto de filamentos llamados hifas, las mismas que se unen para formar los micelios. El
micelio es el encargado de absorber substancias minerales del suelo, además es el encargado de
la producción de enzimas, se puede decir que el hongo en realidad es el micelio, ya que la seta
no es más que su aparato reproductor, pero comúnmente se denomina hongo solamente a la seta.
Los micelios reproductores crecen hacia la superficie, estos forman los organelos reproductores,
conocidos como endosporios, sirven para la generación de nuevos micelios. A diferencia de los
micelios vegetativos que crecen bajo la superficie y tienen la finalidad de absorber nutrientes.
Figura 3. Representación de un hongo con las partes que lo constituyen.
Fuente: Didáctica Personalizada, “Material Didáctico Montessori”, Chihuahua, México, pp.614.
[Fecha de consulta: 23 Agosto 2014].
Disponible en: <http://www.didacticapersonalizada.org/image/Botanica_005.jpg >.
6
1.2.3. Importancia de los hongos. “Se ha descrito la importancia de los hongos debido a que
están involucrados en numerosos fenómenos biológicos, tales como: desintegración de la
materia orgánica; causan la mayoría de las enfermedades conocidas en plantas, animales y
humanos; en procesos industriales de fermentación (pan, vino, cerveza, ciertos quesos, etc.); en
alimentación humana (champiñones, trufas, níscalos, etc.), y son útiles en investigación ya que
presentan un ciclo vital corto, fácil reproducción y con frecuencia una genética haploide” [17].
Sin dejar de tomar en cuenta que cierto tipo de hongos tienen la capacidad de generar enzimas
muchas de las cuales tienen un alto potencial industrial, existen enzimas que ayudan a hidrolizar
la celulosa, como son las celulasas, algo que podría ayudar a la obtención de alcoholes, además
pueden producir enzimas que tienen propiedades degradadoras principalmente de lignina y
celulosa, pero al no ser especificas degradan además componentes contaminantes con enlaces
similares a los de los compuestos antes mencionados.
1.3. Enzimas.
1.3.1. Generalidades. Las enzimas son moléculas proteicas que tienen la propiedad de actuar
como catalizadores biológicos, proporcionan los medios suficientes para realizar funciones
complejas tales como la síntesis y descomposición de compuestos.
Las enzimas consisten de cadenas de aminoácidos unidos en una secuencia definida. Las
enzimas tienen en su estructura un centro activo, formado por relativamente una pequeña
cantidad de aminoácidos que son los responsables directos de la unión con el sustrato y son los
que catalizan la reacción particular de cada enzima [18].
1.3.2.
Clasificación. “La identificación final de una enzima en particular es posible a través de
su número de Comisión Enzimática (C.E.). La asignación de los números de C.E. se describe en
las directrices establecidas por la Unión Internacional de Bioquímica. Todas las enzimas
conocidas caen dentro de las siguientes seis categorías. Las seis principales divisiones son:
7
• Oxidoreductasas.
• Transferasas.
• Hidrolasas.
• Liasas.
• Isomerasas.
• Ligasas (sintetasas).
Las oxidoreductasas catalizan la transferencia de electrones y protones desde un donador hacia
un receptor. Las transferasas catalizan la transferencia de un grupo funcional desde un donador
hacia un receptor. Las hidrolasas facilitan el reemplazo de C-C, C-O, C-N y otros enlaces por
agua. Las liasas catalizan la eliminación de estos mismos enlaces, dejando dobles enlaces (o, en
el modo inverso, catalizan la adición de grupos a través de dobles enlaces). Las isomerasas
facilitan el reordenamiento geométrico o estructural, o isomerizaciones. Finalmente, las ligasas
catalizan la unión de dos moléculas” [19].
1.3.3. Mecanismo de reacción. Se sabe que las enzimas actúan como todos los catalizadores
reduciendo la energía de activación (EA) de una reacción, Las enzimas reducen la energía de
activación mediante la creación de un ambiente en el que el estado de transición es estabilizado,
se dice que la enzima mediante atracción de cargas cambia la conformación del sustrato,
llevándolo al estado de transición pero de tal manera que la energía necesaria para llegar a dicho
estado, disminuye. Esto brinda una ruta alternativa para que la reacción ocurra con menor EA,
cosa que no ocurre sin la presencia de la enzima. La ruta alternativa sucede mediante la
creación de una reacción intermedia denominada complejo Enzima-Sustrato.
1.3.4. Cofactores. En muchos casos las enzimas no son capaces de actuar solas, y necesitan la
ayuda de cofactores para que la reacción catalítica suceda. Los cofactores también son
conocidos como cosustratos cumpliendo esa función sufren una reacción química a la par del
sustrato. Los cofactores van desde iones metálicos hasta compuestos orgánicos.
8
1.3.5. Centro Activo. El centro activo de la enzima es aquel lugar en el que una pequeña parte
de los aminoácidos que constituyen la enzima se encargan de la catálisis involucrada. Esto
sucede debido a que en este punto la enzima se une el sustrato. La estructura tridimensional que
tienen las enzimas, permite que al centro activo ingresen solo sustratos muy específicos (ni
siquiera sus isómeros) son altamente selectivos, como se diferencia en el modelo esquemático
de una enzima en la Figura 4.
Figura 4. Ubicación esquemática del centro activo de la enzima.
Fuente: Adam, Sam, “A level notes”, USA, 2013. [Fecha de consulta: 24 Noviembre 2014].
Disponible en: <http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Competitive_inhibition_es.svg >.
1.3.6. Complejo Enzima-Sustrato. Las reacciones en las que se utilizan enzimas como
catalizadores, el primer paso para que suceda esto es la unión entre el sustrato con la enzima,
formando el complejo Enzima – Sustrato. Posterior a la disolución del complejo ocurre la
liberación de la enzima y el sustrato libre o producto.
E
Enzima
+
S
Sustrato
ES
Complejo Enzima – Sustrato
E
+
Enzima
P
(1)
Producto
Figura 5. Formación del Complejo Enzima – Sustrato
Fuente: Crimson, Jerry, “Competitive inhibition”, derivativeFX, USA, 2011.
[Fecha de consulta: 24 Noviembre 2014].
Disponible en: <http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Competitive_inhibition_es.svg >.
9
La velocidad en la que ocurre todo este proceso depende de la naturaleza de la enzima y del
sustrato. Se reconoce que en los casos de reacciones de catálisis enzimática la velocidad de
reacción alcanza a ser al menos 100 veces mayor que en las reacciones no enzimáticas[20].
1.3.7. Cinética Enzimática. El tratamiento matemático de la cinética enzimática es muy
complejo, incluso si se conocen los pasos básicos involucrados en la reacción. A través de los
siguientes pasos elementales se muestra un esquema simplificado:
+
⇒
(2)
+
(3)
⇒
Donde E, S y P representan la enzima, el sustrato y el producto, y ES es el intermediario
enzima-sustrato. Con cierta frecuencia se supone que la formación de ES y su descomposición
en las moléculas de enzima y sustrato es un proceso rápido, y que el paso determinante de la
velocidad es la formación del producto [21].
En general, la velocidad para dichas reacciones está dada por la ecuación:
=
∆| |
∆
(4)
=
1.4. Actividad Enzimática.
La determinación directa de las concentraciones de enzima para catalizar una reacción es
excesivamente complicada debido a que las concentraciones son demasiado bajas, por lo que la
determinación se la realiza por medio del seguimiento de una reacción, ya sea por la
desaparición de un sustrato, o por la formación de un producto de la reacción.
10
La concentración de las enzimas se la expresa en función de la actividad de las enzimas en
unidades de tiempo en las que ocurre una conversión de una cantidad arbitraria de sustrato, y
con una cantidad predefinida de enzima. Existen métodos estandarizados a condiciones de
temperatura, pH y concentraciones de sustrato [22].
1.4.1. Factores que afectan la actividad enzimática. Hay varios parámetros que pueden tener
un efecto sobre el ensayo enzimático y los cuales se consideran brevemente a continuación:
1.4.1.1. Efecto del pH. El pH afecta de una manera directa a la estructura tridimensional de la
enzima, por lo que si a una reacción catalizada por una enzima se la orienta hacia diferentes
valores de pH, manteniendo las concentraciones de enzima y sustrato constantes, se verá que
existe solo un rango en el que lograran actuar las enzimas, y que por encima o debajo de aquel
no existe reacción alguna. El pH afecta directamente la habilidad de la enzima para atarse al
sustrato.
El valor del rango de pH y su amplitud dependerá exclusivamente de las propiedades de la
enzima, para los ensayos lo más común es llevarlos a las condiciones en los que ocurre la mayor
actividad enzimática, por lo que el uso de soluciones amortiguadoras previenen una desviación
hacia un pH no deseado. Las desviaciones del pH generalmente ocurren por la formación de
productos ácidos o básicos.
Figura 6. Representación del efecto del pH sobre la actividad enzimática.
Fuente: González, Juan, “Curso de Biomoléculas”, Bilbao, CSIC, España, 2007.
[Fecha de consulta: 17 Noviembre 2014].
Disponible en: < http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz22.htm#ph >.
11
1.4.1.2. Efecto de la temperatura. El aumento de la temperatura es indispensable para que
aumente la velocidad de reacción como lo describe Arrhenius. En el caso de reacciones
enzimáticas se debe tener en cuenta que existe una temperatura óptima para que ocurra la
reacción, debido a que al sobrepasar un límite superior puede darse la desnaturalización de la
enzima por elevadas temperaturas [22].
Figura 7. Representación del efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.
Fuente: González, Juan, “Curso de Biomoléculas”, Bilbao, CSIC, España, 2007.
[Fecha de consulta: 17 Noviembre 2014].
Disponible en: < http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz22.htm#t >.
1.4.2. Rasgos característicos de las enzimas como catalizadores. Las enzimas como
catalizadores tienen 4 aspectos muy beneficiosos:
Las enzimas al tener una alta selectividad tienen como ventaja la posibilidad de transformar
únicamente el sustrato hacia el producto requerido, con un alto rendimiento y sin generar
reacciones secundarias por lo que no se producen contaminantes en la reacción.
Con las enzimas se puede llegar a catalizar reacciones, que no se lograría con catalizadores
químicos, por lo que el rango de reacciones catalizadas es mucho más amplio.
Se alcanzan velocidades de reacción de 100 a 1000 veces más altas que las correspondientes con
los catalizadores no enzimáticos. La ventaja es que alcanzan dichas velocidades sin la necesidad
de encontrarse en condiciones extremas de pH, temperatura y presión, e incluso en el solvente
más común como es el agua [23].
12
1.5.
Enzimas fúngicas.
1.5.1. Hongos productores de enzimas. Los hongos filamentosos como los Cladosporium y
Aspergillus son los principales participes en la biodegradación de hidrocarburos alifáticos,
mientras que las especies como la Cunninghamella, Penicillium, Fusarium y Aspergillus son
capaces de descomponer a los hidrocarburos aromáticos [24].
Los hongos filamentosos son incapaces de mineralizar o descomponer en su totalidad los
hidrocarburos aromáticos [25], la ventaja de dichos hongos es la de transformar los
hidrocarburos en productos que tienen una menor toxicidad y aumenta la facilidad de
descomponer a los hidrocarburos aromáticos con la ayuda de bacterias [26].
1.5.2.
Enzimas producidas. Los hongos Basidiomicetos son capaces de producir enzimas
ligninolíticas tales como la lignino peroxidasa (LiP), manganeso peroxidasa (MnP), y la lacasa
que son las principales enzimas utilizadas en la degradación de la lignina [27]. Se supuso que
por la similitud estructural de los sustratos puede ocurrir la degradación de HAP`s [28][29] y
otros contaminantes orgánicos mediante la utilización de enzimas extracelulares ligninolíticas
[30].
1.5.3. Clasificación de enzimas producidas. Se han clasificado a las enzimas producidas por
los hongos como: Oxidoreductasas, Lacasas y Peroxidasas, fundamentándose en su actividad y
recurso. Algunas Peroxidasas como: Lignino Peroxidasa (LiP), Manganeso Peroxidasa (MnP), y
la Versátil Peroxidasa han sido estudiadas por su alto potencial para degradar sustancias tóxicas
en la naturaleza.
1.5.4. Lignino Peroxidasa. La Lignino Peroxidasa es una enzima secretada durante el
metabolismo de los hongos de la pudrición blanca. La degradación de la lignina y otros
compuestos fenólicos ocurre en la presencia de un cosustrato como es el peróxido de hidrógeno
y con un mediador como es el alcohol veratrílico. Durante la reacción, el H2O2 se reduce a H2O
con la ganancia de un electrón de la LiP, (donde la misma se oxida). La LiP (oxidada) con la
ganancia de un electrón desde el alcohol veratrílico regresa a su estado original, y el
veratrilaldehído es formado. Luego el veratrilaldehído se reduce nuevamente a alcohol
veratrílico por la ganancia de un electrón desde el sustrato. Esto resulta en la oxidación de
compuestos fenólicos halogenados, compuestos aromáticos policíclicos y otros compuestos
aromáticos, siguiendo una serie de reacciones no enzimáticas[31][32].
13
La LiP juega un rol central en la degradación de la pared celular de las plantas constituidas por
lignina. La LiP está disponible para oxidar compuestos aromáticos con potenciales redox
mayores que 1.4 V por la abstracción de un simple electrón, pero el mecanismo redox exacto es
aun pobremente entendido [33].
Figura 8. Secuencia de reacciones de las Lignino Peroxidasas.
Fuente: Quintero, Juan, “Degradación de plaguicidas mediante hongos de la pudrición blanca de
la madera”, Medellín, Universidad de Antioquía, Colombia, 2011.
[Fecha de consulta: 04 Diciembre 2014]. Disponible en:
< http://www.revistas.unal.edu.co/index.php/refame/article/viewFile/26394/37123/ >.
14
2. MARCO EXPERIMENTAL
Para la evaluación de producción de la enzima Lignino Peroxidasa y su capacidad de
biodegradación de HAP’s, el trabajo experimental se dividió en tres partes. La primera consta de
la reproducción de las cepas, la segunda consiste en la determinación de la lignino peroxidasa en
el medio contaminado mediante el método de Kirk & Farrel, y la tercera en la cuantificación de
los HAP’s en cada muestra mediante el método ASTM D7363-07.
2.1. Descripción del proceso.
En base a la bibliografía se identificaron las especies que tienen la capacidad de degradar
HAP`s. Posterior a esto, se obtuvieron las cepas de hongos de las especies Aspergillus terreus y
Penicillium corylophilum, con el conocimiento de que dichos hongos pueden generar enzimas
especificas para la biodegradación. A partir de las cepas originales se realizó la reproducción de
las mismas todo esto en el medio de cultivo Agar Papa Dextrosa, con el objetivo de multiplicar
las cepas para su posterior inoculación en el medio de cultivo conformado por el Agar Papa
Dextrosa y el contaminante en una determinada proporción la cual se detalla en el diseño
experimental. Previo a la inoculación del contaminante se realizó mediante cromatografía
liquida la cuantificación de HAP`s para verificar el cambio de composición de la muestra de
contaminante al finalizar el experimento. Luego de la inoculación se ajustaron las condiciones
de pH de acuerdo al diseño experimental, después se procedió a obtener diferentes muestras de
la mezcla ya inoculada con la finalidad de determinar la actividad enzimática de Lignino
Peroxidasa a lo largo del tiempo en sus diferentes condiciones. Con el fin de comprobar el
cambio de composición del contaminante se realizó un análisis cromatográfico líquido de alta
eficiencia al finalizar la experiencia. Mediante los datos obtenidos se realizara el análisis
estadístico mediante la técnica de superficie de respuesta, para encontrar las mejores
condiciones para la degradación del contaminante para nuestro caso los hidrocarburos
aromáticos policíclicos.
15
Obtención de cepas
Identificación de
de Aspergillus terreus
cepas degradadoras
de HAP’s
y Penicillium
Identificación de
cepas degradadoras
de HAP’s
corylophilum
Reproducción de
cepas en medio
Muestreo (15 días)
Crecimiento de cepas
contaminado con
petróleo crudo
Medición
Optimización de
colorimétrica de la
condiciones mediante
actividad enzimática
superficie de
de LiP
respuesta
Análisis del
Análisis de HPLC de
porcentaje de
muestras posterior al
reducción de HAP’s
tratamiento
Figura 9. Diagrama de flujo con la descripción del proceso.
16
2.2. Proceso experimental seleccionado.
En base al programa estadístico STATGRAPHICS® se diseñó el proceso experimental, en el
que a partir de la bibliografía consultada se estableció la temperatura de trabajo como constante,
siendo ésta la temperatura óptima para el crecimiento respectivo de las dos especies de hongos a
utilizar: Aspergillus terreus y Penicillium corylophilum. Además, se definieron las variables del
proceso: el pH y la cantidad de contaminante, la primera variable se la definió con la finalidad
de encontrar la condición a la que se obtiene una mayor actividad enzimática, la misma que se
encuentra dentro del rango de 3,5 – 6,5 unidades de pH. La explicación del uso de la segunda
variable es más aplicativa, se la definió con la finalidad de establecer el cambio de composición
del contaminante en función de su cantidad con respecto al medio de cultivo, la misma que va
del 0,5% vc/vm – 1,5% vc/vm en volumen con respecto al medio de cultivo.
2.3. Diseño Experimental.
El Diseño Experimental se basa en la determinación de la cantidad óptima de la actividad
enzimática de
Lignino Peroxidasa en función de las variables de pH y cantidad de
contaminante. El programa estadístico STATGRAPHICS® muestra el siguiente diseño
experimental, el mismo que consta de 9 diferentes ensayos para cada tipo de hongo los que se
detallan a continuación, en las Figuras 9 y 10:
Donde:
T: Temperatura optima de crecimiento para el Aspergillus y el Penicillium 26 °C
pH1: potencial de 3,5
pH2: potencial de 5
pH3: potencial de 6,5
C1: Concentración del contaminante con respecto al medio de cultivo 0,5 %
C2: Concentración del contaminante con respecto al medio de cultivo 1,0 %
C3: Concentración del contaminante con respecto al medio de cultivo 1,5 %
17
C1
pH1
C2
C3
C1
Aspergillus
pH2
T
C2
C3
C1
pH3
C2
C3
Figura 10. Diseño Experimental para determinación de la Lignino Peroxidasa en
Aspergillus.
18
C1
pH1
C2
C3
C1
Penicillium
pH2
T
C2
C3
C1
pH3
C2
C3
Figura 11. Diseño Experimental para determinación de la Lignino Peroxidasa en
Penicillium.
19
Una vez que se definieron las variables y parámetros de toda la experimentación, se propone
diseñar un modelo experimental que permita determinar condiciones para optimizar la
producción de la actividad enzimática de la Lignino Peroxidasa, para lo cual se usó un método
factorial 22 que es un diseño que estudia el efecto de dos factores considerando niveles en cada
uno, y así poder determinar una combinación de niveles de los factores.
(-1, 1)
(0, 1)
(1, 1)
(-1, 0)
(0, 0)
(1, 0)
(-1, -1)
(0, -1)
(1, -1)
Figura 12. Diseño factorial de 22.
En la Figura 11 se muestra el diseño factorial 22 y un punto central. En el plano se puede
observar la distribución de los puntos para la experimentación.
Para poder determinar una combinación de niveles de los factores que muestren las condiciones
óptimas de producción de la actividad enzimática de Lignino Peroxidasa, se aplico la estrategia
experimental llamada superficie de respuesta. Esta técnica se utiliza cuando la variable de
respuesta que es la de interés se ve influenciada por otras variables para poder llegar a su punto
óptimo.
2.3.1. Parámetros fijos. Existen condiciones que se mantendrán fijas durante la
experimentación, que se detallan en la Tabla 1:
Tabla 1. Parámetros fijos definidos para la experimentación
Parámetro Fijo
Temperatura
Valor
26 ºC
20
2.3.2. Parámetros variables. Para aplicar el método experimental planteado se ha
considerado como variables independientes el potencial hidrógeno del medio de cultivo, además
de la concentración del contaminante de hidrocarburo en relación a la cantidad total de medio.
Debido a que existen dos niveles de variación, estos vendrán definidos como máximo y mínimo.
Estos valores se determinaron en referencia a bibliografía y experimentación previa.
Tabla 2. Valores considerados para experimentación de los parámetros variables
Niveles
Factor
Alto
Bajo
pH
6,5 (1)
3,5 (-1)
Concentración de contaminante
1,5% vc/vm (1)
0,5% vc/vm (-1)
Se trabajó con un diseño de segundo orden de composición central, la codificación de las
condiciones es la siguiente:
Tabla 3. Codificación de las mezclas durante la experimentación
Valores Codificados
pH
(-1, -1)
(0, -1)
(1, -1)
(-1, 0)
(0, 0)
(1, 0)
(-1, 1)
(0, 1)
(1, 1)
3,5
5
6,5
3,5
5
6,5
3,5
5
6,5
Concentración de
contaminante, vc/vm
0,5%
0,5%
0,5%
1%
1%
1%
1,5%
1,5%
1,5%
21
CODIFICACIÓN
A
B
C
D
E
F
G
H
I
G
(3,5; 1,5%)
H
(5; 1,5%)
I
(6,5; 1,5%)
D
(3,5; 1%)
E
(5; 1%)
F
(6,5; 1%)
A
(3,5; 0,5%)
B
(5; 0,5%)
C
(6,5; 0,5%)
Figura 13. Diseño factorial 22 con nomenclatura y valores.
En la Figura 12 se muestra la distribución de los puntos para la experimentación conjuntamente
con el potencial hidrógeno y concentración del contaminante, y la nomenclatura durante toda la
experimentación.
2.3.3. Parámetro de evaluación y optimización.
• Actividad Enzimática de la Lignino Peroxidasa.
El cálculo de la actividad enzimática de la Lignino Peroxidasa se lo realizó mediante el
método de Kirk & Farrel descrito en el procedimiento (Véase el punto 2.3.2.5).
22
2.4. Materiales y Equipos.
2.4.1. Reproducción de las cepas.
2.4.1.1. Preparación del agar papa dextrosa para el inóculo.
• Reverbero
• Malla de Amianto
• Vasos de Precipitación
(R: 1000 mL; Ap: ± 100,0 mL)
• Autoclave TUTTNAUER 3870M ®
• Balanza Analítica ADAM ®
(R: 450 g; Ap: ± 0,001 g)
• Varilla de Agitación
2.4.1.2. Inoculación del hongo en el medio de cultivo agar papa dextrosa.
• Cajas Petri
(R: 40 mL)
• Asa
• Vasos de Precipitación
(R: 600 mL; Ap: ± 50,0 mL)
• Cámara de Flujo Laminar BBS-DDC
• Parafilm
• Mechero Fisher
2.4.1.3. Crecimiento del Hongo en el medio de cultivo Agar Papa Dextrosa.
• Estufa MEMMERT ®
2.4.2. Determinación de la lignino peroxidasa en el medio contaminado.
2.4.2.1. Preparación del Agar Papa Dextrosa para el Inóculo en el medio contaminado.
• Reverbero
• Malla de Amianto
• Vasos de Precipitación
(R: 1000 mL; Ap: ± 100,0 mL)
• Autoclave TUTTNAUER 3870M ®
• Balanza Analítica ADAM ®
(R: 450 g; Ap: ± 0,001 g)
23
• Varilla de Agitación
• Micropipeta
(R: 105 µL; Ap: ± 1 µL)
• Cámara de Flujo Laminar BBS-DDC
2.4.2.2. Inoculación del hongo en el medio de cultivo agar papa dextrosa en conjunto con el
contaminante.
• Mechero de Fisher
• Cajas Petri
(R: 40 mL)
• Asa
• Vasos de Precipitación
(R: 600 mL; Ap: ± 50,0 mL)
• Cámara de Flujo Laminar BBS-DDC
2.4.2.3. Crecimiento del hongo en el medio de cultivo agar papa dextrosa en conjunto con el
contaminante.
• Estufa MEMMERT ®
(R: 0 - 270ºC)
2.4.2.4. Muestreo para determinación de lignino peroxidasa.
• Balón Aforado
(R: 100 mL)
• Varilla de Agitación
• Micropipetas
(R: 10 mL; Ap: ± 0,5 mL)
• Centrifugadora MODEL 80-2S ®
(R: 4000 rpm; Ap: ± 500 rpm)
• Cámara de Flujo Laminar BBS-DDC
• Tubos para muestras HATCH ®
2.4.2.5. Determinación de lignino peroxidasa por espectrofotometría.
• Espectrofotómetro RAYTO R-9200®
(Ap: ± 0,001 Abs)
• Balón Aforado
(R: 100 mL)
• Micropipetas
(R: 105 µL; Ap: ± 1,0 µL)
• Tubos para muestras HATCH ®
2.4.3. Cuantificación de HAP´s en el Crudo.
• HPLC (Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento)
24
2.5. Sustancias y Reactivos.
2.5.1. Reproducción de las cepas.
• Agar papa dextrosa CRITERION ®
• Agua destilada
H2O (l.)
• Alcohol
C2H5OH (sol.)
2.5.2. Determinación de lignino peroxidasa.
• Alcohol veratrílico SIGMA ALDRICH ®
C9H1203 (sol.)
• Veratrilaldehído SIGMA ALDRICH ®
C9H10O3 (sol.)
• Citrato de sodio
Na3C6H5O7 (s.)
• Ácido cítrico
C6H8O7 (s.)
• Peróxido de hidrógeno Mallinckrodt AR ®
H2O2 (l.)
• Agua destilada
H2O (l.)
• Tween 20
C58H114O26 (sol.)
• Petróleo crudo
2.5.3. Cuantificación de HAP´s en el crudo.
• Se detalla en la norma ASTM D7363-07.
2.6. Procedimiento.
2.6.1. Reproducción de las cepas.
2.6.1.1. Preparación del agar papa dextrosa para el inóculo.
• Pesar 39 g del agar papa dextrosa en la balanza analítica.
• Medir 1 L de agua destilada.
• Mezclar el agar papa dextrosa con el agua destilada en un vaso de precipitación.
• Someter la mezcla a calentamiento en el reverbero con continúa agitación, hasta llegar a
hervir la mezcla.
25
• Llevar a la autoclave la mezcla con el fin de esterilizar el medio, posterior a esto con la
ayuda de un mechero colocar el medio de cultivo en las diferentes cajas Petri a utilizar y
dejar que solidifique.
2.6.1.2. Inoculación del hongo en el medio de cultivo agar papa dextrosa.
• Colocar las cajas Petri con el medio de cultivo solidificado y el material indicado en el
punto 2.2.2.2.
• Encender los rayos ultravioleta de la cámara de flujo laminar para conseguir que la
inoculación se la realice en un medio estéril por un lapso de 30 minutos.
• Apagar la cámara de flujo laminar y esperar 10 minutos por la formación de radicales libres
en el ambiente de trabajo.
• Encender el mechero, colocar el asa en la llama hasta el punto de incandescencia y enfriarlo
en alcohol.
• Hacer un raspado con el asa en las cajas Petri que contienen las cepas originales de los
hongos.
• Inocular con el asa las cepas de hongos en los medios de cultivo solidificados.
• Sellar las cajas Petri con parafilm.
2.6.1.3. Crecimiento del hongo en el medio de cultivo agar papa dextrosa.
• Regular las condiciones de la estufa hasta la temperatura óptima de crecimiento de los
hongos.
• Colocar las cajas Petri selladas dentro de la estufa y permitir que se desarrollen las nuevas
cepas dentro del medio de cultivo.
• Observar continuamente su crecimiento.
2.6.2. Determinación de la Lignino Peroxidasa en el medio contaminado.
2.6.2.1. Preparación del agar papa dextrosa para el inóculo en el medio contaminado.
• Medir 100 mL de agua destilada, y calentarlos en el reverbero.
• Medir 0,5 mL de petróleo crudo, 3 mL de Tween 20, y 7 g de Agar Papa Dextrosa y después
añadirlos a la mezcla.
• Mantenerlos en calentamiento con constante agitación hasta obtener una mezcla
completamente homogénea.
26
• Llevar la mezcla hacia la autoclave con el fin de esterilizar el medio.
• Colocar el medio contaminado en diferentes cajas Petri y ajustar su pH a 3,5; 5 y 6,5
colocando 1 mL de una solución buffer.
• Repetir el procedimiento antes detallado colocando 1 y 1,5 mL de crudo.
2.6.2.2. Inoculación del hongo en el medio de cultivo agar papa dextrosa.
• Colocar las cajas Petri con el medio de cultivo solidificado y el material indicado en el
punto 2.2.2.2. en la cámara de flujo laminar.
• Encender los rayos ultravioleta de la cámara de flujo laminar por un lapso de 30 minutos
para conseguir que la inoculación se la realice en un medio estéril.
• Apagar la cámara de flujo laminar y esperar 10 minutos por normas de seguridad.
• Encender el mechero, colocar el asa en la llama hasta el punto de incandescencia y enfriarlo
en alcohol.
• Hacer un raspado con el asa en las cajas Petri que contienen las cepas originales de los
hongos.
• Inocular con el asa las cepas de hongos en los medios de cultivo solidificados.
2.6.2.3. Crecimiento del hongo en el medio de cultivo agar papa dextrosa en conjunto con el
contaminante.
• Regular las condiciones de la estufa hasta la temperatura óptima de crecimiento de los
hongos.
• Colocar las cajas Petri selladas dentro de la estufa y permitir que se desarrollen las nuevas
cepas dentro del medio de cultivo.
• Observar continuamente su crecimiento durante 10 días seguidos.
2.6.2.4. Muestreo para determinación de lignino peroxidasa.
• Realizar el muestreo después de 10 días a partir de su incubación.
• Preparar una solución de Tween 20 al 0,1% v/v.
• Colocar el material indicado en el punto 2.2.2.4 a excepción de la centrifugadora dentro de la
cámara de flujo laminar.
• Encender los rayos ultravioleta de la cámara de flujo laminar para conseguir que el muestreo
se lo realice en un medio estéril por un lapso de 30 minutos.
• Apagar la cámara de flujo laminar y esperar 10 minutos por normas de seguridad.
• Colocar 2 mL de Tween 20 dentro de las Cajas Petri para muestrear y disolver un área
específica de los micelios en el Tween 20 con la ayuda de la varilla de agitación.
27
• Con la ayuda de la micropipeta absorber 1 mL de la mezcla disuelta y colocarla dentro de los
tubos de vidrio pyrex con tapa rosca previamente etiquetados con el pH, composición de
contaminante en el medio y día de muestreo.
• A cada uno de los diferentes tubos de vidrio pyrex con tapa rosca colocar 10 mL del medio
de cultivo líquido preparado con 10 g de glucosa, 2,5 g de peptona y 2,5 g de extracto de
levadura en 500 mL de agua destilada.
• Llevar esta mezcla a centrifugación. Realizar esto durante 30 minutos a 3.500 rpm, y separar
el líquido sobrenadante, el mismo que será el extracto enzimático a utilizar durante la
determinación de la lignino peroxidasa mediante espectrofotometría.
2.6.2.5. Determinación de lignino peroxidasa por espectrofotometría.
• Preparar la solución blanco para la determinación de lignino peroxidasa por
espectrofotometría preparada de la siguiente manera: 200 μL de buffer de citrato de sodio
0,25M con pH de 3,5, 40 μL de alcohol veratrílico 10 mM y 760 μL de muestra.
• Obtener los 760 μL de muestra para el blanco, disolviendo un área específica del medio de
cultivo contaminado con el hidrocarburo proveniente del oriente pero sin la inoculación del
hongo con Tween 20, extrayéndolo con una micropipeta y procediendo de la misma manera
que para la obtención del extracto enzimático.
• Para cuantificar la enzima lignino peroxidasa se lo hizo mediante el método de Kirk & Farrel
el mismo que consiste en la oxidación del alcohol veratrílico a veratrilaldehído, la muestra se
prepara con: 200 μL de buffer de citrato, 40 μL de alcohol veratrílico, 710 μL del extracto
enzimático y finalmente 50 μL de peróxido de hidrógeno 0,4 mM, en ese orden
específicamente.
• Una vez preparadas las muestras se las mide mediante el espectrofotómetro el mismo que
solicita la muestra blanco, y posteriormente la muestra a cuantificar.
28
3. DATOS EXPERIMENTALES.
3.1. Actividad Enzimática de la Lignino Peroxidasa.
3.1.1. Datos de absorbancias obtenidas. En las tablas 4 y 5 se muestran los resúmenes de los datos obtenidos de absorbancias mediante el método de
Kirk & Farrel, tanto para el Aspergillus como para el Penicillium.
Tabla 4. Absorbancias obtenidas para el Aspergillus en sus diferentes condiciones
Días de
Ensayo
1
3
5
7
9
11
13
15
17
19
A
0,043
0,028
0,042
0,044
0,014
0,009
0,019
0,064
0,017
0,024
B
0,047
0,064
0,037
0,054
0,071
0,015
0,027
0,088
0,033
0,026
C
0,049
0,042
0,077
0,069
0,064
0,022
0,017
0,090
0,031
0,003
Absorbancias para el Aspergillus, [nm]
D
E
F
0,051
0,040
0,009
0,025
0,023
0,031
0,038
0,076
0,074
0,001
0,002
0,004
0,004
0,024
0,018
0,011
0,051
0,022
0,048
0,075
0,015
0,047
0,078
0,079
0,022
0,029
0,010
0,003
0,027
0,033
29
G
0,032
0,056
0,071
0,035
0,066
0,055
0,048
0,078
0,046
0,009
H
0,024
0,060
0,061
0,033
0,044
0,036
0,001
0,072
0,030
0,039
I
0,006
0,053
0,058
0,001
0,002
0,030
0,045
0,047
0,036
0,019
Tabla 5. Absorbancias obtenidas para el Penicillium en sus diferentes condiciones
Días de
Ensayo
1
3
5
7
9
11
13
15
17
19
A
0,055
0,056
0,065
0,020
0,054
0,052
0,070
0,043
0,040
0,037
B
0,027
0,041
0,045
0,058
0,060
0,062
0,119
0,023
0,029
0,048
C
0,022
0,085
0,011
0,069
0,065
0,098
0,120
0,030
0,022
0,039
Absorbancias para el Penicillium, [nm]
D
E
F
0,075
0,065
0,073
0,068
0,065
0,068
0,067
0,020
0,074
0,036
0,028
0,062
0,057
0,038
0,044
0,047
0,066
0,027
0,083
0,195
0,092
0,021
0,021
0,013
0,001
0,014
0,038
0,022
0,020
0,050
30
G
0,076
0,052
0,067
0,001
0,047
0,044
0,094
0,047
0,037
0,001
H
0,036
0,059
0,052
0,017
0,033
0,036
0,064
0,033
0,027
0,015
I
0,026
0,066
0,041
0,049
0,060
0,047
0,068
0,022
0,015
0,012
3.2. Reducción de HAP’s en las muestras.
3.2.1. Datos iniciales de los HAP’s en las muestras. En la tabla 6 se muestra un cuadro de
resumen con los valores de HAP’s obtenidos en las muestras iniciales de petróleo crudo.
Tabla 6. Valores iniciales de HAP’s en las muestras
Valores iniciales de HAP´s en las muestras
Nombre
Valor
Unidad
Naftaleno
0,07
mg/L
Acenaftileno
0,18
mg/L
Acenafteno
0,31
mg/L
Fluoreno
0,29
mg/L
Fenantreno
1,46
mg/L
Antraceno
1,66
mg/L
Carbazole
0,30
mg/L
Fluoranteno
0,15
mg/L
Pireno
0,21
mg/L
Benzo(a)antraceno
0,44
mg/L
Criseno
0,49
mg/L
Benzo(b) fluoranteno
0,07
mg/L
Benzo(k)fluoranteno
0,07
mg/L
Benzo(a)pireno
0,04
mg/L
Indeno(1,2,3-cd)pireno
N.D.
mg/L
Dibenzo(a,h)antraceno
0,08
mg/L
Benzo(g,h,i)perileno
0,05
mg/L
TOTAL
5,87
mg/L
31
3.2.2. Datos finales de HAP’s posterior al tratamiento con los hongos. En la tabla 7 se
muestran las concentraciones de HAP’s posteriores a los tratamientos con hongos en las
muestras más representativas.
Tabla 7. Valores de HAP´s posterior al tratamiento en las muestras
Valores de HAP´s posterior al tratamiento en las muestras
Nombre
P-E
P-C
P-I
A–C
A–I
Naftaleno
0,00
0,00
0,01
0,00
0,06
Acenaftileno
0,01
0,01
0,09
0,01
0,09
Acenafteno
0,01
0,01
0,17
0,01
0,13
Fluoreno
0,01
0,01
0,14
0,00
0,11
Fenantreno
0,00
0,00
0,66
0,00
0,47
Antraceno
0,00
0,01
0,75
0,01
0,54
Carbazole
0,01
0,01
0,14
0,01
0,10
Fluoranteno
0,00
0,00
0,12
0,01
0,04
Pireno
0,00
0,00
0,09
0,00
0,06
Benzo(a)antraceno
0,00
0,01
0,19
0,02
0,13
Criseno
0,00
0,01
0,21
0,02
0,15
Benzo(b) fluoranteno
0,01
0,01
0,02
0,00
0,05
Benzo(k)fluoranteno
0,01
0,01
0,02
0,00
0,05
Benzo(a)pireno
0,00
0,00
0,02
0,00
0,01
Indeno(1,2,3-cd)pireno
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
Dibenzo(a,h)antraceno
0,00
0,00
0,01
0,02
0,06
Benzo(g,h,i)perileno
0,00
0,00
0,02
0,00
0,02
TOTAL
0,06
0,09
2,66
0,11
2,07
Unidad
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
mg/L
3.3. Optimización.
La optimización se la realiza con el uso de la estrategia estadística de superficie de respuesta.
Los datos que se utilizan se encuentran la tabla 4.
32
4.
CÁLCULOS.
4.1. Cálculo de la actividad enzimática de lignino peroxidasa.
=
!"×$% ×&'
×(×$)
(5)
!"
= *∗*,-∗.,0- ∗ 1000 ∗ 3
(6)
Siendo:
ULiP/L: Unidades de actividad Lignino Peroxidasa por litro de muestra.
Abs: Absorbancia.
Vt: Volumen total.
Fd: Factor de dilución.
t: Tiempo de ensayo.
ɛ: Factor de extracción.
Vm: Volumen de muestra.
4.2. Cálculo de la reducción de HAP’s en las muestras.
%5 67 89 ó8 = ;
<
=>=?=@A
<
BC<
=>=?=@A
D=>@A E
F ∗ 100
(7)
4.3. Cálculo de la optimización.
El cálculo de la optimización se lo realizó mediante el programa estadístico STATGRAPHICS®
utilizando la técnica de superficie de respuesta, además de verificar los efectos principales de las
variables sobre la superficie de respuesta.
33
5.
RESULTADOS
5.1. Resultados de la actividad enzimática de lignino peroxidasa.
En las tablas 8 y 9 se muestran los resúmenes de los resultados obtenidos de las actividades enzimáticas mediante el método de Kirk & Farrel, tanto para
el Aspergillus como para el Penicillium.
Tabla 8. Resultados de la actividad enzimática para el Aspergillus en sus diferentes condiciones
Días de
Ensayo
1
3
5
7
9
11
13
15
17
19
A
2,954
1,923
2,885
3,022
0,962
0,618
1,305
4,396
1,168
1,648
B
3,228
4,396
2,541
3,709
4,877
1,030
1,855
6,044
2,267
1,786
Actividades Enzimáticas para el Aspergillus, [UI/mLsol.]
C
D
E
F
G
3,366
3,503
2,747
0,618
2,198
2,885
1,717
1,580
2,129
3,846
5,289
2,610
5,220
5,083
4,877
4,739
0,069
0,137
0,275
2,404
4,396
0,275
1,648
1,236
4,533
1,511
0,756
3,503
1,511
3,778
1,168
3,297
5,152
1,030
3,297
6,182
3,228
5,358
5,426
5,358
2,129
1,511
1,992
0,687
3,160
0,206
0,206
1,855
2,267
0,618
34
H
1,648
4,121
4,190
2,267
3,022
2,473
0,069
4,945
2,061
2,679
I
0,412
3,640
3,984
0,069
0,137
2,061
3,091
3,228
2,473
1,305
Tabla 9. Resultados de la actividad enzimática para el Penicillium en sus diferentes condiciones
Días de
Ensayo
1
3
5
7
9
11
13
15
17
19
A
3,778
3,846
4,465
1,374
3,709
3,572
4,808
2,954
2,747
2,541
B
1,855
2,816
3,091
3,984
4,121
4,259
8,174
1,580
1,992
3,297
Actividades Enzimáticas para el Penicillium, [UI/mLsol.]
C
D
E
F
G
1,511
5,152
4,465
5,014
5,220
5,838
4,671
4,465
4,671
3,572
0,756
4,602
1,374
5,083
4,602
4,739
2,473
1,923
4,259
0,069
4,465
3,915
2,610
3,022
3,228
6,731
3,228
4,533
1,855
3,022
8,242
5,701
13,394
6,319
6,457
2,061
1,442
1,442
0,893
3,228
1,511
0,069
0,962
2,610
2,541
2,679
1,511
1,374
3,434
0,069
35
H
2,473
4,053
3,572
1,168
2,267
2,473
4,396
2,267
1,855
1,030
I
1,786
4,533
2,816
3,366
4,121
3,228
4,671
1,511
1,030
0,824
En el gráfico 1 se representa la variación de la actividad enzimática de la Lignino Peroxidasa en
función del tiempo para las diferentes combinaciones de pH y concentración del contaminante
Actividad Enzimática LiP, [UI/mLsol.]
para el caso del Aspergillus.
Aspergillus - Actividad Enzimática = f(Días de
Ensayo)
15
10
5
0
0
5
10
15
20
3,5 - 0,5
5,0 - 0,5
6,5 - 0,5
3,5 - 1,0
5,0 - 1,0
6,5 - 1,0
3,5 - 1,5
5,0 - 1,5
6,5 - 1,5
Días de Ensayo
Gráfico 1. Aspergillus - Actividad Enzimática = f (Días de ensayo)
En el gráfico 2 se representa la variación de la actividad enzimática de la Lignino Peroxidasa en
función del tiempo para las diferentes combinaciones de pH y concentración del contaminante
Actividad Enzimática, [UI/mLsol.]
para el caso del Penicillium.
Penicillium - Actividad Enzimática = f(Días de
Ensayo)
3,5 - 0,5
15
10
5
0
0
5
10
15
20
Días de Ensayo
Gráfico 2. Penicillium - Actividad Enzimática = f (Días de ensayo)
36
5,0 - 0,5
6,5 - 0,5
3,5 - 1,0
5,0 - 1,0
6,5 - 1,0
3,5 - 1,5
5,0 - 1,5
6,5 - 1,5
5.2. Resultados de la reducción de HAP’s en las muestras.
En la tabla 12 se muestra el cuadro de resumen del porcentaje de reducción de HAP’s en las
muestras más representativas.
Tabla 10. Porcentaje de Reducción de HAP's en las muestras
Porcentaje de Reducción de HAP's en las muestras
Nombre
P-E
P-C
P–I
A–C
Naftaleno
100,00
100,00
85,71
100,00
Acenaftileno
94,44
94,44
50,00
94,44
Acenafteno
96,77
96,77
45,16
96,77
Fluoreno
96,55
96,55
51,72
100,00
Fenantreno
100,00
100,00
54,79
100,00
Antraceno
100,00
99,40
54,82
99,40
Carbazole
96,67
96,67
53,33
96,67
Fluoranteno
100,00
100,00
20,00
93,33
Pireno
100,00
100,00
57,14
100,00
Benzo(a)antraceno
100,00
97,73
56,82
95,45
Criseno
100,00
97,96
57,14
95,92
Benzo(b)fluoranteno
85,71
85,71
71,43
100,00
Benzo(k)fluoranteno
85,71
85,71
71,43
100,00
Benzo(a)pireno
100,00
100,00
50,00
100,00
Indeno(1,2,3-cd)pireno
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
Dibenzo(a,h)antraceno
100,00
100,00
87,50
75,00
Benzo(g,h,i)perileno
100,00
100,00
60,00
100,00
TOTAL
98,98
98,47
64,74
98,13
37
A–I
14,29
50,00
58,06
62,07
67,81
67,47
66,67
73,33
71,43
70,45
69,39
28,57
28,57
75,00
N.D.
25,00
60,00
54,68
En los gráficos 3, 4, 5, 6 y 7 se muestran histogramas en los que se detallan los valores de
concentración de HAP's antes y después del tratamiento.
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Antes
Después
Naftaleno
Acenaftileno
Acenafteno
Fluoreno
Fenantreno
Antraceno
Carbazole
Fluoranteno
Pireno
Benzo(a)antraceno
Criseno
Benzo(b) fluoranteno
Benzo(k)fluoranteno
Benzo(a)pireno
Indeno(1,2,3-cd)pireno
Dibenzo(a,h)antraceno
Benzo(g,h,i)perileno
Concentración, [mg/L]
P-E
Gráfico 3. Concentración de HAP’s antes y después del tratamiento para el caso del
Penicillium a las condiciones de E.
38
Concentración, [mg/L]
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Naftaleno
Acenaftileno
Acenafteno
Fluoreno
Fenantreno
Antraceno
Carbazole
Fluoranteno
Pireno
Benzo(a)antraceno
Criseno
Benzo(b) fluoranteno
Benzo(k)fluoranteno
Benzo(a)pireno
Indeno(1,2,3-cd)pireno
Dibenzo(a,h)antraceno
Benzo(g,h,i)perileno
P-C
P-I
Naftaleno
Acenaftileno
Acenafteno
Fluoreno
Fenantreno
Antraceno
Carbazole
Fluoranteno
Pireno
Benzo(a)antraceno
Criseno
Benzo(b) fluoranteno
Benzo(k)fluoranteno
Benzo(a)pireno
Indeno(1,2,3-cd)pireno
Dibenzo(a,h)antraceno
Benzo(g,h,i)perileno
Antes
Después
Antes
Después
Gráfico 4. Concentración de HAP’s antes y después del tratamiento para el caso del
Penicillium a las condiciones de C.
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
39
Gráfico 5. Concentración de HAP’s antes y después del tratamiento para el caso del
Penicillium a las condiciones de I.
Concentración, [mg/L]
Concentración, [mg/L]
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Naftaleno
Acenaftileno
Acenafteno
Fluoreno
Fenantreno
Antraceno
Carbazole
Fluoranteno
Pireno
Benzo(a)antraceno
Criseno
Benzo(b) fluoranteno
Benzo(k)fluoranteno
Benzo(a)pireno
Indeno(1,2,3-cd)pireno
Dibenzo(a,h)antraceno
Benzo(g,h,i)perileno
A-C
A-I
Naftaleno
Acenaftileno
Acenafteno
Fluoreno
Fenantreno
Antraceno
Carbazole
Fluoranteno
Pireno
Benzo(a)antraceno
Criseno
Benzo(b) fluoranteno
Benzo(k)fluoranteno
Benzo(a)pireno
Indeno(1,2,3-cd)pireno
Dibenzo(a,h)antraceno
Benzo(g,h,i)perileno
Antes
Después
Antes
Después
Gráfico 6. Concentración de HAP’s antes y después del tratamiento para el caso del
Aspergillus a las condiciones de C.
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
40
Gráfico 7. Concentración de HAP’s antes y después del tratamiento para el caso del
Aspergillus a las condiciones de I.
Concentración, [mg/L]
5.3. Resultados de la optimización.
5.3.1. Efectos principales de variables sobre la variable respuesta. Los efectos principales
son una característica que tienen los diseños factoriales en donde se muestra la influencia de
cada uno de los factores en la variable de interés (respuesta). Cada grafica expresa el
comportamiento de la variable de respuesta en función del incremento o la disminución del
factor. Para diseños factoriales, se trabaja ya con diseños de segundo orden y aquí los efectos
son curvos (cuadráticos).
Para analizar los ensayos de actividad enzimática se utilizó el software estadístico Statgraphics
Centurion XVI, con el que se obtuvieron gráficas que muestran el efecto de los factores en la
actividad enzimática.
5.3.1.1. Efectos principales sobre la actividad enzimática para el Aspergillus terreus.
Gráfico 8. Efectos principales para la actividad enzimática del Aspergillus en el día de
ensayo 15
41
5.3.1.2. Efectos principales sobre la actividad enzimática para el Penicillium corylophilum.
Gráfico 9. Efectos principales para la actividad enzimática del Penicillium en el día de
ensayo 13
5.3.2. Optimización. En el caso de optimización, se muestran las condiciones óptimas de
maximización o minimización (según el caso) de la propiedad o propiedades evaluadas.
Para analizar los resultados de los ensayos realizados a los medios de cultivo contaminados se
utilizó un software estadístico llamado Statgraphics Centurion XVI, con el que se obtuvieron las
condiciones óptimas de trabajo y superficie de respuesta de los parámetros a optimizar.
En la gráfica de superficie de respuesta, se tienen en los ejes X y Y los factores analizados en la
optimización (pH y Concentración de contaminante), y en el eje Z se tienen los valores de la
variable de respuesta. El parámetro de optimización para los ensayos realizados fue la actividad
enzimática de la Lignino Peroxidasa.
Este parámetro de evaluación se lo consideró en función a una futura aplicación de la
producción de la enzima Lignino Peroxidasa en la biorremediación de hidrocarburos aromáticos
policíclicos.
42
5.3.2.1. Superficie de Respuesta para el Aspergillus en el día de ensayo 15.
Gráfico 10. Superficie de respuesta para el Aspergillus en el día de ensayo 15.
De acuerdo a la superficie de respuesta obtenida, la ecuación para actividad enzimática de LiP
está definida por los siguientes términos:
Act. Enzimática LiP = -8,92419 + 5,12319*pH + 2,65767*Conc. Cont. - 0,361185*pH2 1,30533*pH*Conc. Cont. + 1,41933*Conc. Cont.2
(8)
R2 = 79,7423 %
En donde:
pH: potencial hidrógeno del medio contaminado.
Conc. Cont.: % concentración de contaminante en relación a la cantidad de agar.
El óptimo observado para maximización es:
Tabla 11. Resultados de maximización de la actividad enzimática de LiP para el
Aspergillus
pH
6,19
Concentración de
Punto Óptimo, Actividad
Contaminante
Enzimática LiP
0,5
6,59
43
5.3.2.2. Superficie de Respuesta para el Penicillium en el día de ensayo 13.
Gráfico 11. Superficie de Respuesta para el Penicillium en el día de ensayo 13
De acuerdo a la superficie de respuesta obtenida, la ecuación para actividad enzimática de LiP
está definida por los siguientes términos:
Act. Enzimática LiP = -36,3561 + 13,6436*pH + 25,5733*Conc. Cont. - 1,16519*pH2 1,74*pH*Conc. Cont. - 9,38667*Conc. Cont.2
(9)
R2 = 59,895 %
En donde:
pH: potencial hidrógeno del medio contaminado.
Conc. Cont.: % concentración de contaminante en relación a la cantidad de agar.
El óptimo observado para maximización es:
Tabla 12. Resultados de maximización de la actividad enzimática de LiP para el
Penicillium
pH
5,19
Concentración de
Punto Óptimo, Actividad
Contaminante
Enzimática LiP
0,88
10,36
44
6.
DISCUSIÓN
Actividad Enzimática
• Se observó la tendencia que tenía la actividad enzimática del Aspergillus terreus en función
de los días de ensayo (Véase Gráfico 1) y se determinó que en los primeros días los puntos
de las diferentes muestras estaban dispersos y no presentaban tendencias similares, esto se
debió a que no existe una manera de controlar el crecimiento homogéneo del
microorganismo en la caja Petri y el muestreo se realizó en un área específica.
• En el caso del gráfico de actividad enzimática de Penicillium corylophilum en función de los
días de ensayo las tendencias de las muestras son similares (Véase Gráfico 2), exceptuando
el caso de la muestra con pH de 6,5 y una concentración de contaminante de 0,5% vc/vm. La
misma que para el día 3 tiene una alta actividad enzimática y en el día 5 casi no se presenta
la producción de enzima, este se debe a la manera de muestreo que se realizó y la cantidad de
micelio extraído no fue suficiente.
• Observando los resultados de actividades enzimáticas obtenidas se puede decir que, la mayor
influencia en los resultados depende de la cantidad de micelio extraída en el área de
muestreo. Se debe tomar en cuenta que no hay una manera de controlar el crecimiento
homogéneo del microorganismo.
Reducción de HAP’s
• Al revisar los valores obtenidos en el porcentaje de reducción de HAP's (Véase Tabla 10), se
observa que se obtienen valores significativos al reducir al menos el 54,58% y alcanzando un
máximo de reducción de HAP’s del 98,98%. Estos valores responden a la mayor o menor
producción de la enzima Lignino Peroxidasa, ya que al tener una mayor cantidad de enzima
esta tendrá un mayor contacto con el sustrato oxidándolo.
45
• Se realizó la medición de la reducción de HAP’s para el hongo Aspergillus terreus a 2
muestras representativas. En este caso fueron las muestras a las condiciones C e I. La
primera fue la que obtuvo la mayor producción de actividad enzimática con un valor de
6,182 UI/mLsol., y la segunda que presentó la menor actividad enzimática con un valor de
3,228 UI/mLsol. (Véase Tabla 8). Esto se debió a que las condiciones de C se encuentras muy
próximas al valor óptimo y entre más se alejan, menor es el valor de la actividad enzimática.
• La medición de la reducción de HAP’s para el hongo Penicillium corylophilum se la realizó
a 3 muestras representativas, en este caso fueron las muestras a las condiciones C, E y I. Las
dos primeras fueron las que obtuvieron una mayor producción de actividad enzimática con
valores de 8,242 y 13,394 UI/mLsol. respectivamente, y la tercera la que presentó una de las
menores actividades enzimáticas con un valor de 4,671 UI/mLsol. (Véase Tabla 9). Esto se
debió a que las condiciones de C se encuentras muy próximas al valor óptimo y entre mas se
alejan menor es el valor de la actividad enzimática.
Optimización
• Los valores de actividad enzimática de Lignino Peroxidasa en cada uno de los ensayos para
el Aspergillus terreus, presentan un incremento significativo en el día de ensayo 15 (Véase
Gráfico 1), porque existió el mayor crecimiento microbiano y debido a la demanda
alimenticia el hongo, produjo una alta cantidad de enzimas con la finalidad de conseguir una
fuente de carbono. Al existir esta elevada cantidad de producción de enzima la optimización
se la realizará en el mencionado día de ensayo.
• Se presentó un incremento significativo en el día de ensayo 13 en los valores de actividad
enzimática de Lignino Peroxidasa en cada uno de los ensayos para el Penicillium
corylophilum, (Véase Gráfico 2), porque se llegó al mayor crecimiento microbiano, al existir
esta elevada cantidad de producción de enzima la optimización se la realizara en el
mencionado día de ensayo.
• En el gráfico que presenta los efectos de las variables sobre la actividad enzimática para el
caso del Aspergillus terreus (Véase Gráfico 8), se observa que existe concordancia a lo que
se presenta en la teoría al tener un punto máximo de actividad enzimática en un valor de pH
de aproximadamente 5,5 y se tiene un decremento al exceder o no alcanzar este valor.
Además se visualiza que se tienen mayores producciones de actividad enzimática al
disminuir la concentración de contaminante.
46
• En el gráfico que presenta los efectos de las variables sobre la actividad enzimática para el
caso del Penicillium corylophilum, se observa que existe una concordancia a lo que se
presenta en la teoría al tener un punto máximo de actividad enzimática en un valor de pH de
aproximadamente 5,5 y se tiene un decremento al exceder o no alcanzar este valor, además
se visualiza que se tienen mayores producciones de actividad enzimática al 1% de
concentración de contaminante.
• A partir del gráfico de superficie de respuesta se obtiene la ecuación cuadrática que define el
comportamiento de producción de actividad enzimática de Lignino Peroxidasa para el caso
del Aspergillus terreus obteniendo un R2= 79,7%. El ajuste obtenido nos dice que la
ecuación nos permite predecir cuál será la actividad enzimática en función del pH y la
concentración del contaminante en una manera muy aceptable.
• Se obtuvo la ecuación que define el comportamiento de producción de actividad enzimática
de Lignino Peroxidasa para el caso del Penicillium corylophilum obteniendo un R2= 59,9%.
El ajuste obtenido nos dice que la ecuación nos permite predecir en una manera aproximada
cuál será la actividad enzimática en función del pH y la concentración del contaminante.
47
7.
CONCLUSIONES
Actividad Enzimática
• Se determinó que la máxima actividad enzimática de Lignino Peroxidasa del Aspergillus
terreus se obtiene en el día de ensayo 15.
• Se observó que la mayor producción enzimática de Lignino Peroxidasa del Penicillium
corylophilum se obtiene en el día de ensayo 13.
Reducción de HAP’s
• Se observó que el valor total de HAP’s en la muestra inicial fue de 5,87 mg/L, al compararlo
con los valores totales posterior a los tratamientos en las diferentes condiciones, existen
reducciones significativas, siendo mayores en los casos en que se produjo una mayor
cantidad de enzima.
• La mayor reducción porcentual de HAP’s en el caso del hongo Penicillium corylophilum se
dio a las condiciones de E (Véase Tabla 3), con un valor de 98,98%.
• Se obtuvo la mayor reducción porcentual de HAP’s en el caso del hongo Aspergillus terreus
a las condiciones de C (Véase Tabla 3), con un valor de 98,13%.
Optimización
• Se determinó que para el caso del Aspergillus terreus se obtiene una máxima producción de
enzima. Se da a las condiciones de pH de 6,2 y la concentración de contaminante igual a
0,5% vc/vm.
• Para el caso del Penicillium corylophilum se obtiene una máxima producción de enzima a las
condiciones de pH de 5,2 y la concentración de contaminante igual a 0,9% vc/vm.
• Se concluyó que los efectos de las variables como son el pH y la concentración de
contaminante, tienen una mayor influencia sobre el hongo Penicillium corylophilum.
48
•
La ecuación que define la producción de actividad enzimática de Lignino Peroxidasa para el
Aspergillus terreus es la siguiente: Act. Enzimática LiP = -8,92419 + 5,12319*pH +
2,65767*Conc. Cont. - 0,361185*pH2 - 1,30533*pH*Conc. Cont. + 1,41933*Conc. Cont.2.
• La producción de actividad enzimática de Lignino Peroxidasa para el Penicillium
corylophilum se define por la siguiente ecuación: Act. Enzimática LiP = -36,3561 +
13,6436*pH + 25,5733*Conc. Cont. - 1,16519*pH2 - 1,74*pH*Conc. Cont. - 9,38667*Conc.
Cont.2.
49
8. RECOMENDACIONES
• Para futuros trabajos de investigación sobre la producción de enzimas con potenciales en
biorremediación, se recomienda analizar mezclas de cepas de hongos con bacterias, con el
fin de obtener una mayor producción de enzimas biodegradadoras.
• Se recomienda realizar el análisis de la reducción de HAP’s, cuando existe un aumento en la
concentración inicial del contaminante.
• Debido a que la investigación en el país sobre enzimas es un campo que está empezando a
estudiarse, se recomienda analizar todas las posibles aplicaciones industriales de las enzimas
producidas para obtener un mejor provecho de la producción a partir de los hongos, además
se recomienda realizar los estudios sobre la separación y purificación de enzimas producidas.
50
CITAS BIBLIOGRÁFICAS
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Madrid: Mc Graw Hill, 1999, p.154.
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[10] SHARMA, H., JAIN, V. y KHAN, Z., Chemosphere, vol. 2, nº 66, 2006, pp. 302-310.
[11] VOLKE, T., VELASCO, J., Op. Cit., p. 15.
[12] CHANG, B., WEI, S. y YUAN, S., Chemosphere, nº 41, 2000, pp. 1463-1468.
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Environmental Microbiology, nº 62, 1997, pp. 292-295.
[14] KOTTERMAN, M., VIS, E. y FIELD, J., Applied and Environmental Microbiology, nº 64,
1998, pp. 2853-2858.
[15] BEZALEL, L., HADAVAR, Y. y CERNIGLIA, C., Applied and Environmental
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51
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1991, p.654.
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[23] WISEMAN, A., Op. Cit. p.687.
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JACOBSEN, C., Bioaugmentation of tar-contaminated soils under field conditions using
Pluerotus ostreatus refuse from commercial mushroom production, Environmental
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[25] HUSAINI, A., ROSLAN, H. y ANG, C., Biodegradation of aliphatic hydrocarbon by
indigenous fungi isolated from used motor oil contaminated sites, World Microbiology
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[26] SASEK, W., CAJTHAML, T. y BHATT, M., Use of fungal technology in soil remediation.
A case study, Water, Air and Soil Pollution, nº 3, 2003, p. 5.
[27] VARES, T., NIEMENMAA, O. y HATAKKA, A., Applied and Environmental
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[28] BEZALEL, L., HADAVAR, Y., FU, P., FREEMAN, J. y CERNIGLIA, C., Applied and
Environmental Microbiology, nº 62, 1996, pp. 2554–2559.
[29] PICKARD, M., ROMAN, R., TINOCO, R. y DUHALT, R., Applied and Environmental
Microbiology, nº 65, 1996, pp. 3805–3809.
[30] NOVOTNY, C., SVOBODOVA, K., EXBANOVA, P., CAJTHAML, T., KASINATH, A.
y LANG, E., Soil Biology & Biochemistry, nº 36, 2004, pp. 1545–1551.
[31] YOSHIDA, S., Reaction of manganese peroxidase of Bjerkandera adusta wiuth synthetic
lignin in acetone solution, journal of Wood Science, vol. 44, nº 6, 1998, pp. 486-490.
52
[32] TEN HAVE, R. y TEUNISSEN, P., Oxidative mechanisms involved in lignin degradation
by white-rot fungi, Chemical Reviews, vol. 101, nº 11, 2001, pp. 3397-3413.
[33] PIONTEK, K., SMITH, A. y BLODIG, W., Lignin peroxidase structure and function,
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53
BIBLIOGRAFÍA
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• HOFRICHTER, Martin.The Mycota: Industrial Applications. Springer, Heidelberg,
Alemania, 2010. 324 p.
• KAVANAGH, Kevin. Fungi: Biology and Applications. John Wiley & Sons, Ltd.,
Maynooth, 2011. 179 p.
• MILES, Philip y CHANG, Shu-Ting. Mushroom Biology: Concise Basics and Current
Developments.World Scientific Publishing Co, Lexington. 2014. 7 p.
• STELIGA, Teresa. Role of Fungi in Biodegradation of Petroleum Hydrocarbons in Drill
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• YOUNG, Darcy. Bioremediation with White-Rot Fungi at Fisherville Mill: Analyses of
Gene Expression and Number 6 Fuel Oil Degradation, Mosakowski Institute,
Estados Unidos, 2012. 22 p.
54
ANEXOS
55
ANEXO A. Materiales utilizados para la reproducción de las cepas.
Figura A1. Preparación del medio de cultivo.
56
ANEXO B. Visualización de las placas con los diferentes hongos.
Figura B1. Vista del hongo Penicillium en el medio de cultivo acondicionado a un pH 3.5 y
concentración de contaminante de 0.5%
Figura B2. Vista del hongo Aspergillus en el medio de cultivo acondicionado a un pH 3.5 y
concentración de contaminante de 0.5%
57
ANEXO C. Extracción de las muestras para la posterior medición de actividad
enzimática.
Figura C1. Obtención de las muestras para medición de actividad enzimática.
Figura C2. Muestras obtenidas previo a la medición.
58
Figura C3. Enfriamiento de las muestras para la no variación de la actividad enzimática.
59
ANEXO D. Equipo utilizados en la medición de la actividad enzimática de
Lignino Peroxidasa.
Figura D1. Balanza Digital para la determinación de LiP por el método de Kirk & Farrel.
Figura D2. Autoclave para la determinación de LiP por el método de Kirk & Farrel.
60
Figura D3. Centrifugadora para la determinación de LiP por el método de Kirk & Farrel.
Figura D4. Espectrofotómetro para la determinación de LiP por el método de Kirk &
Farrel.
61