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0318*
Viral CNS Flow Chip Kit
(HS24)
Detección de virus causantes de
meningitis/encefalitis en humanos mediante RTPCR múltiple e hibridación en fase reversa
para hybriSpot 24 (HS24)
MAD-003934M-HS24-24
24
Para uso en diagnóstico in vitro
Según Directiva 98/79/CE y Norma ISO 18113-2
*El ON 0318 solo interviene en la evaluación de la conformidad del ensayo para
Citomegalovirus (CMV), el resto de los virus tienen marcado CE de autocertificación.
Máster Diagnóstica S.L.
Avda. Conocimiento, 100. P.T. Ciencias de la Salud. 18016. Granada (España).
Tel: +34 958 271 449. master@vitroweb.com ; www.masterdiagnostica.com
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ÍNDICE
1
USO PREVISTO .................................................................................................................................................. 3
2
PRINCIPIO DEL MÉTODO ................................................................................................................................... 3
3
COMPONENTES ................................................................................................................................................ 4
3.1
3.2
4
Reactivos para RT-PCR múltiple en un solo paso ............................................................................................ 4
Reactivos para la hibridación .......................................................................................................................... 4
MATERIAL ADICIONAL REQUERIDO NO SUMINISTRADO................................................................................... 5
4.1
4.2
Reactivos y materiales ..................................................................................................................................... 5
Equipamiento .................................................................................................................................................. 5
5
CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD...................................................................................... 5
6
ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES ..................................................................................................................... 5
7
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Y DEL PRODUCTO ............................................................................................ 7
7.1
7.2
8
Toma de muestras ........................................................................................................................................... 7
Extracción de ácidos nucleicos desde el LCR ................................................................................................... 7
PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS .......................................................................................................................... 7
8.1
8.2
8.3
Reacción de amplificación de ADN/ARN vírico................................................................................................ 7
Preparación de los reactivos ........................................................................................................................... 8
Hibridación reversa por Flow-through ............................................................................................................ 9
9
PROCEDIMIENTO DE CONTROL DE CALIDAD ..................................................................................................... 9
10
ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS ................................................................................................11
11
CARACTERÍSTICAS DEL FUNCIONAMIENTO ......................................................................................................12
11.1
11.2
Analítico......................................................................................................................................................... 12
Clínico ............................................................................................................................................................ 16
12
LIMITACIONES .................................................................................................................................................16
13
PROBLEMAS Y SOLUCIONES .............................................................................................................................17
14
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................................................................18
15
SÍMBOLOS DE LA ETIQUETA .............................................................................................................................19
16
GLOSARIO ........................................................................................................................................................19
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USO PREVISTO
Viral CNS Flow Chip es un kit de diagnóstico in vitro de virus causantes de meningitis y encefalitis en
humanos. Los virus causantes de infecciones en el sistema nervioso central (CNS) son a menudo difíciles
de identificar. Los métodos que se usan actualmente para su diagnóstico son muy laboriosos y no siempre
muestran una especificidad del 100%. El sistema Viral CNS Flow Chip permite la detección simultánea de 8
especies de virus: Herpes simplex 1 (HSV-1), Herpes simplex 2 (HSV-2), Citomegalovirus (CMV), EpsteinBarr Virus (EBV), Varicella-Zoster (VZV), Toscana (TOSV), Enterovirus (EV) y Parechovirus (HPeV), mediante
la amplificación del ADN/ARN vírico por transcripción inversa y PCR (RT-PCR) en un solo paso y múltiple, y
posterior hibridación reversa sobre una membrana que contiene sondas específicas para cada especie. La
hibridación se lleva a cabo de forma semi-automática empleando la tecnología basada en el sistema “DNAFlow”.
Virus
Target
Herpes simplex 1
Herpes simplex 2
Cytomegalovirus
Epstein-Barra
Varicella-Zoster
Toscana
Enterovirusb
Parechovirus
US5, envelope glycoprotein J.
UL48, transactivating tegument protein VP16
HCMVUL111A, ORF in transforming region
BALF5, DNA polymerase
ORF31 core gene
nucleoprotein gene
5´UTR
polyprotein
Tabla 1: Regiones genómicas amplificadas para cada virus.
a
Epstein-Barr: Este virus se puede encontrar de forma latente en linfocitos B, por tanto un resultado positivo para
este virus con Viral CNS Flow Chip Kit no siempre debe ser atribuido a una infección neurológica causada por él. Este
test podría estar detectando el ADN del virus latente en las células linfoides B que forman parte de la respuesta
inflamatoria inducida por otro agente, por lo cual se puede detectar con cierta frecuencia el virus Epstein-Barr junto
a cualquier otro de los virus incluidos en el panel.
b
Enterovirus detectados con Viral CNS Flow Chip kit:
• Coxsackievirus A: A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8, A9, A10, A11, A12, A13, A14, A15, A16, A17, A18, A19, A20, A21,
A22, A24.
• Coxsackievirus B: B1, B2, B3, B4, B5, B6.
• Poliovirus: 1, 2, 3
• Echovirus: E1, E2, E3, E4, E5, E6, E7, E9, E11, E12, E13, E14, E15, E16, E17, E18, E19, E20, E21, E24, E25, E26, E27,
E29, E30, E31, E32, E33, E68, E70, E71.
Estado Microbiológico: Producto no estéril.
2
PRINCIPIO DEL MÉTODO
Viral CNS Flow Chip se basa en una metodología que consiste en la amplificación simultánea de virus ADN
y virus ARN por RT-PCR múltiple en un solo paso, seguido de hibridación en membrana con sondas de ADN
específicas mediante la tecnología DNA-Flow (hybriSpot 24). Los amplicones biotilinados generados tras la
RT-PCR se hibridan en membranas que contienen un array de sondas específicas para cada virus, así como
sondas de control de amplificación e hibridación. La tecnología DNA-Flow permite una unión muy rápida
entre el producto de PCR y su sonda específica en un ambiente tridimensional poroso, en contraste con la
hibridación en superficie convencional. Una vez producida la unión entre los amplicones específicos y sus
sondas correspondientes, la señal se visualiza mediante una reacción inmunoenzimática colorimétrica con
Estreptavidina-Fosfatasa alcalina y un cromógeno (NBT-BCIP) que genera precipitados insolubles en la
membrana en aquellas posiciones en las que se ha producido la hibridación. Los resultados son analizados
automáticamente con el software hybriSoft.
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3
COMPONENTES
El kit proporciona reactivos suficientes para procesar 24 muestras. Se incluyen los reactivos necesarios
para llevar a cabo la amplificación específica, así como la posterior hibridación sobre membrana.
3.1
Reactivos para RT-PCR múltiple en un solo paso
-
24 tests (MAD-003934M-P-HS24-24):
Nombre
Formato
Referencia
One Step RT-PCR Mix
Reverse Transcriptase mix 100x
1250 µl
15 µl
MAD-003934M-MIX-HS24
MAD-RT-2
Tabla 2: Reactivos suministrados para realizar la RT-PCR
La Mix de PCR contiene tampón de PCR, enzima Cod UNG, MgCl2, dNTPs (U/T), agua libre de DNasas y
RNasas y cebadores biotinilados. Los cebadores que se incluyen son los específicos para la amplificación de
8 especies víricas (Herpes simplex 1, Herpes simplex 2, Citomegalovirus, Virus Epstein-Barr, Virus VaricellaZoster, Virus Toscana, Enterovirus y Parechovirus). Además incluye los cebadores para amplificar un
fragmento de ADN genómico humano usado como control interno y cebadores y ADN de control exógeno
de amplificación. La mix Reverse Transcriptase contiene las enzimas Reverse Transcriptase, hot-start DNA
polymerase y RNase inhibitor.
3.2
Reactivos para la hibridación
-
24 tests (MAD-003934M-H-HS24-24):
Nombre
Formato
Hybridization Solution (Reagent A)
Blocking Solution (Reagent B)
Streptavidin-Alkaline Phosphatase (Reagent C)
Washing Buffer I (Reagent D)
Substrate (Reagent E1)
Chromogen (Reagent E2)
Reagent E
Washing Buffer II (Reagent F)
Viral CNS CHIP (HS)
60 ml
10 ml
10 ml
35 ml
14 ml
14 ml
-18 ml
1 x 24 units
Referencia
MAD-003930MA-HS24-24
MAD-003930MB-HS24-24
MAD-003930MC-HS24-24
MAD-003930MD-HS24-24
MAD-003930ME1-HS24-24
MAD-003930ME2-HS24-24
MAD-003930ME-HS24
MAD-003930MF-HS24-24
MAD-003934M-CH-HS-24
Tabla 3: Reactivos suministrados para realizar la hibridación.
IMPORTANTE: Todos los reactivos se suministran en formato listo para uso, excepto los reactivos E-1 y E-2
que deben mezclarse en proporción 1:1 justo antes de su uso en el vial vacío proporcionado para tal fin y
etiquetado como “Reactivo E”.
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MATERIAL ADICIONAL REQUERIDO NO SUMINISTRADO
4.1
Reactivos y materiales
•
•
•
•
•
•
4.2
Equipamiento
•
•
•
•
•
•
•
•
5
Reactivos para purificación de ADN/ARN viral
Guantes desechables
Tubos eppendorf de 0,2/0,5 ml libres de DNasa/RNasa
PCR Encoded Plates with Flat Cap Strips and Adhesive Film, Ref: MAD-003900P-HS24
HS24 PCR Tube Strips and Flat Cap Strips, Ref: MAD-003900ST-HS24
Puntas de pipeta con filtro libres de DNasa/RNasa
Microcentrífuga
Micropipetas automáticas: P1000, P200, P20 y P2
Termociclador
Bloque térmico para calentar tubos de PCR (puede ser sustituido por un termociclador)
Placa de frío (4 °C).
Baño termostatizado/estufa
Equipo para hibridación hybriSpot 24
Software Hybrisoft
CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
Viral CNS Flow Chip consta de dos componentes que se suministran en cajas separadas:
Reactivos para RT-PCR. Envío entre 2°C y 8°C* y conservación a -20°C, siendo estable hasta la fecha de
caducidad especificada. Los reactivos de PCR deben ser conservados en zonas libres de contaminación por
ADN/ARN o productos de PCR. Evitar múltiples ciclos de congelación y descongelación.
Reactivos para hibridación. Envío y conservación a 2-8°C*. Tanto los reactivos como los Viral CNS Chips son
estables hasta la fecha de caducidad especificada. No congelar.
* Se incluye un indicador de temperatura con el embalaje. En caso de que la cadena de frío se rompa se recomienda contactar
con el fabricante antes de utilizar los reactivos.
6
ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES
• Lea las instrucciones de uso antes de utilizar este producto.
• Recomendaciones de seguridad:
Las precauciones de seguridad se describen en la ficha de seguridad. Este producto está destinado
únicamente para uso profesional en un laboratorio, y no como fármaco, para uso doméstico ni otros
fines. La versión actual de la ficha de seguridad de este producto se puede descargar del sitio web
www.vitro.bio o puede solicitarse a regulatory.md@vitro.bio.
• Viral CNS Flow Chip kit utiliza como material de partida ácidos nucleicos previamente extraídos y
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purificados. Es responsabilidad del cliente incluir los controles necesarios para verificar que el sistema
de extracción de material genético utilizado funciona adecuadamente.
• Consideraciones generales para evitar la degradación del ARN con ribonucleasas (RNasas):
Las RNasas son enzimas muy estables, difíciles de inactivar, que actúan rápidamente degradando el
ARN. Hay que evitar la introducción de RNasas en la muestra problema y en los reactivos usados para la
RT-PCR manteniendo las siguientes precauciones:
Trabajar en un área limpia libre de RNasas. La principal fuente de contaminación por RNasas
procede la piel y las partículas de polvo, portadores de bacterias y hongos.
Usar siempre guantes desechables para prevenir la contaminación de RNasas procedentes de la piel.
Cambiar los guantes con frecuencia y mantener los tubos cerrados.
Usar tubos de PCR y puntas de pipeta libres de RNasas.
Durante todo el proceso de preparación de la muestra para la amplificación, trabajar rápidamente
para evitar la degradación de ARN por RNasas residuales y endógenas.
• Consideraciones generales para evitar la contaminación con producto de PCR:
La mayor fuente de contaminación suele ser el propio producto de PCR amplificado, por lo cual es
recomendable llevar a cabo la manipulación de los productos amplificados en una zona diferente a
donde se realiza la reacción de PCR. Es recomendable trabajar en áreas diferenciadas de pre- y postPCR en donde se realice la manipulación del ADN problema y preparación de tubos de PCR (pre-PCR) y
la manipulación e hibridación de los productos amplificados (post-PCR). Estas áreas deben estar
separadas físicamente y debe emplearse distinto material de laboratorio (batas, pipetas, puntas…, etc)
para evitar la contaminación de las muestras con el ADN amplificado, lo que podría conducir a falsos
diagnósticos positivos. El flujo de trabajo debe ir siempre en una única dirección, desde la zona de prePCR hasta la zona de post-PCR y nunca en dirección opuesta. Se debe evitar el flujo de material y
personal desde la zona post-PCR a la zona pre-PCR. Además, a fin de evitar la contaminación con
productos de PCR previos, se incluye en el kit la enzima Cod-UNG, que degrada productos de PCR que
contengan dUTP.
Se recomienda incluir controles negativos de amplificación que contengan todos los reactivos
manejados en el kit, desde la extracción hasta la amplificación, con excepción de la muestra de
ADN/ARN, con objeto de detectar y controlar cualquier posible contaminación de los reactivos con
muestras problema o con productos amplificados. La hibridación en membrana de este control debe
ser negativa, marcándose solo el control de hibridación y el control exógeno de amplificación. De este
modo se comprueba que no existe contaminación de ADN de pacientes y/o de ADN amplificado en la
zona de pre-PCR.
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PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Y DEL PRODUCTO
7.1
Toma de muestras
Viral CNS Flow Chip ha sido validado con material genético purificado de líquido cefalorraquídeo (LCR).
El LCR debe recolectarse en un recipiente estéril y ser transportado a 2-8 °C, según directrices del Centro
para el control de enfermedades y prevención (CDC). Este material debe guardarse a 2-8 °C durante un
máximo de 3 dias o a -70 °C para periodos mayores de tiempo, con la finalidad de presevar la viabilidad
viral.
7.2
Extracción de ácidos nucleicos desde el LCR
EL LCR debe tratarse como un posible agente infeccioso. Las recomendaciones para el manejo de este tipo
de muestras se pueden encontrar en las publicaciones de la CDC. Se deben manejar todos los materiales
contaminados con agentes biológicos y peligrosos de forma aceptable según las recomendaciones del
centro de trabajo.
Viral CNS Flow Chip ha sido ensayado con material genético purificado de líquido cefalorraquídeo
humano. Este kit ha sido validado con ADN/ARN de partida obtenido a partir de los siguientes sistemas de
extracción:
•
MagNA Pure 96 System (Roche Diagnostics)
•
NucliSENS® easyMag® (bioMérieux S.A.)
•
VERSANT kPCR Molecular System (Siemens)
Nota: El sistema no ha sido validado con otros sistemas de extracción de ADN, por tanto si se emplea otro sistema de
purificación diferente éste debe verificarse previamente.
8
PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS
8.1
Reacción de amplificación de ADN/ARN vírico
•
La mezcla de reacción se prepara siguiendo indicaciones de la Tabla 4 en un volume final de 50 µl y
en las tiras de tubos (Ref: MAD-003900ST-HS24) o placas (Ref: MAD-003900P-HS24) indicadas
para ello. Se recomienda preparar la mezcla con una reacción extra (ej: preparar mezcla para 5
tests si necesitas 4 reacciones).
Nota: Es muy importante utilizar exclusivamente las tiras de tubos o placas suministradas por Master
Diagnóstica S.L., placas de PCR con código de barras, tiras de tapas y papel adhesivo (Ref: MAD-003900PHS24) y tiras de tubos y tapas de PCR para HS24 (Ref: MAD-003900ST-HS24).
•
•
Descongelar el vial de One Step RT-PCR Mix en hielo. Mezclar bien invirtiendo el tubo varias veces
y centrifugar durante unos segundos. One Step RT-PCR mix permite un máximo de 10 ciclos de
congelación y descongelación.
Centrifuga brevemente el vial de Reverse Transcriptase mix 100x.
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•
Mezcla bien mediante pipeteo los volúmenes adecuados de One Step RT-PCR Mix y Reverse
Transcriptase 100x de acuerdo a las siguientes instrucciones:
Componente
1 reacción
5 reacciones
One Step RT-PCR Mix
Reverse transcriptase mix 100x
Total volume before the addition of DNA/RNA
44.5 µl
0.5 µl
45 µl
222.5 µl
2.5 µl
DNA/RNA sample
5 µl
Tabla 4: Reactivos y volúmenes necesarios para preparar la reacción de RT-PCR con la muestra problema.
•
•
•
•
•
Agitar bien la mezcla para conseguir homogeneizar todos los componentes y centrifugar 5
segundos en microcentrífuga.
Dispensar la mezcla de reacción en alicuotas de 45 µl en las tiras de tubos o placas destinadas para
ello.
Añadir 5 µl de ADN/ARN de la muestra problema a cada tubo de reacción.
Cerrar las tiras de tubos o sellar las placas con la lámina de aluminio y colocarlas en el
termociclador.
Programar las condiciones de amplificación que figuran a continuación:
1 cycle
1 cycle
1 cycle
45 cycles
25°C
55°C
95°C
95°C
60°C
8°C
5 min
20 min
2 min
15 sec
1 min
∞
Tabla 5: Programa de RT-PCR.
Si no se van a procesar las muestras en el momento, se pueden almacenar en la zona de post-PCR a 4° C
durante 1-2 días. Para un almacenamiento más prolongado se recomienda congelarlas a -20 ° C.
Nota: Es importante que todo este proceso se lleve a cabo en hielo o placas frías para prevenir así la degradación
de las enzimas contenidas en el kit.
8.2
Preparación de los reactivos
Todos los reactivos se suministran en formato “listo para uso”.
La solución de revelado de la hibridación se suministra como dos reactivos (Reactivos E1 y E2) que deben
mezclarse en proporción 1:1 en el vial “Reactivo E”, justo antes de su uso, con volumen en función del nº
de muestras a procesar (ver tabla 6). Tras cada uso es necesario limpiar el vial con agua destilada para
evitar acúmulo de precipitados en usos sucesivos.
Los Chips son de un solo uso. Se deben manejar con guantes y alejados de cualquier fuente de
contaminación.
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8.3
Hibridación reversa por Flow-through
Todo el proceso de hibridación se realiza de forma automática en hybriSpot 24 (HS24). La gestión de las
muestras, la captura de las imágenes y el análisis e informe de los resultados se realizan a través del
software hybriSoft.
Nota: Configurar el instrumento siguiendo las instrucciones del manual de usuario (proporcionadas con el instrumento).
Antes de comenzar el proceso de hibridación:
•
•
Desnaturalizar los productos de PCR calentando a 95 °C durante 10 min en un termociclador y
enfriar rápidamente en hielo durante al menos 2 min.
Preparar el Reactivo E (Reagent E) en el momento de usar, mezclando en proporción 1:1 los
componentes 1 y 2 suministrados en el kit. En la siguiente tabla se indican los volúmenes
requeridos de reactivo E1 y E2 en función del número de tests:
vol (µl)/1 tests vol (µl)/4 tests vol (µl)/8 tests vol (µl)/12 tests vol (µl)/16 tests vol (µl)/20 tests vol (µl)/24 tests
E1
1200
1800
2300
3000
3800
4200
5000
E2
1200
1800
2300
3000
3800
4200
5000
Tabla 6: Volúmenes de reactivos E1-E2 que se deben mezclar en el vial E en función del nº de test a procesar.
•
•
9
Situar los tubos de PCR, los Viral CNS Chips y los reactivos en sus correspondientes posiciones del
hybriSpot 24.
Seleccionar el protocolo correspondiente en el equipo para que comience el proceso automático.
PROCEDIMIENTO DE CONTROL DE CALIDAD
El kit Viral CNS Chip consta de varios controles internos para evaluar la calidad de los resultados.
SONDA
CONTROL
B
Control hibridación
CI
Control de amplificación exógeno
BG
Control de amplificación endógeno
Tabla 7: Sondas control incluidas en Viral CNS Chip.
Control de hibridación: Tras el revelado de las membranas debe aparecer una señal intensa en las cinco
posiciones de control de hibridación (B) que sirve como control de calidad. Esta señal indica que los
reactivos de hibridación y revelado han funcionado correctamente. Si no aparece señal indicará que ha
habido un fallo durante el proceso de hibridación o que algún reactivo no se ha usado correctamente.
Además, esta señal permite que el software pueda orientar correctamente el panel de sondas para su
posterior análisis.
Control de amplificación exógeno (CI): Sonda para la detección del ADN sintético incluido en la mezcla de
PCR. Este ADN se co-amplificará junto con el material genético de la muestra. Las dos posiciones positivas
en el Control de amplificación exógeno (CI) indicarán que la reacción de RT-PCR ha funcionado
correctamente.
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Control de amplificación endógeno (BG): Sonda para la detección del gen de la beta-globina humana
contenido en la muestra problema, que es co-amplificado durante la PCR. Todas las muestras donde el
ADN problema se haya amplificado correctamente tendrán una señal positiva en el Control de
amplificación endógeno (BG). Esta señal es indicativa de la calidad/cantidad del ADN empleado en la
amplificación. Una señal positiva indica que la amplificación ha funcionado correctamente y que la calidad
y cantidad del ADN de partida han sido óptimas. La ausencia de señal para este control nos indica fallos
durante la amplificación, baja calidad/ cantidad del ADN utilizado en la amplificación o ausencia de ADN
humano en la muestra. Este último caso es posible cuando el líquido cefalorraquídeo no contenga células
humanas y en el análisis automático con el software hybriSoft aparece un aviso de “ausencia de DNA
humano”. Si no se observa señal para este control de amplificación endógeno, el usuario debería verificar
que el proceso de extracción del ADN/ARN de la muestra de partida se ha realizado correctamente,
añadiendo un ADN humano exógeno a la muestra de líquido cefalorraquídeo antes de la extracción (p. ej.
200-500 ng de ADN genómico humano, en función del volumen final de elución del método).
Cuando una muestra es positiva para alguno de los virus incluidos en el kit, con resultado negativo para los
controles de amplificación exógeno y endógeno, en el informe de análisis automático de los resultados
con el software hybriSoft aparece un aviso de “ausencia de ADN genómico humano/presencia de
inhibidores de PCR” para que el usuario realice las verificaciones oportunas antes de validar el resultado.
El usuario es responsable de determinar los procedimientos de control de calidad apropiados para su
laboratorio y cumplir con la reglamentación aplicable.
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10 ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
En el siguiente esquema se muestra la disposición de las sondas en el Viral CNS Chip:
“B”: control de hibridación
“CI”: Control de amplificación exógeno
“BG”: Control de amplificación endógeno (fragmento ß-Globina humana)
“X”: Sondas específicas para cada virus
Todas las sondas están duplicadas para garantizar la fiabilidad en el análisis automático de los resultados. El control
de hibridación (B) está repetido en 5 posiciones y permite que el software pueda orientar correctamente el panel de
sondas para su posterior análisis.
A continuación se muestra la distribución de las diferentes sondas incluidas en el VIRAL CNS Chip así como
los posibles resultados esperados.
1
A
B
C
D
E
F
G
H
I
B
B
CI
BG
2
3
4
5
6
7
8
B
HSV-1
EBV
HSV-2
VZV
EV
CMV
TOSV
HPeV
B
CI
BG
CMV
TOSV
HPev
HSV-1
EBV
EV
HSV-2
VZV
B
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Tabla 8a: posición de las sondas en el panel de Viral CNS Chip.
Sonda /Posicionamiento
Resultado esperado
Virus
B
CI
BG
Positivo Virus Herpes simple 1
2C-6E (HSV1)
1A-1B-2I-5E-8A
1C-5F
-- / 1D-5G
Positivo Virus Herpes simple 2
2E-6G (HSV2)
1A-1B-2I-5E-8A
1C-5F
-- / 1D-5G
Positivo Citomegalovirus
2G-6C (CMV)
1A-1B-2I-5E-8A
1C-5F
-- / 1D-5G
Positivo Virus de Epstein-Barr
3C-7E (EBV)
1A-1B-2I-5E-8A
1C-5F
-- / 1D-5G
Positivo Virus Varicela-Zoster
3E-7G (VZV)
1A-1B-2I-5E-8A
1C-5F
-- / 1D-5G
3G-7C (TOSV)
1A-1B-2I-5E-8A
1C-5F
-- / 1D-5G
4E-8E (EV)
1A-1B-2I-5E-8A
1C-5F
-- / 1D-5G
4G-8C (HPeV)
1A-1B-2I-5E-8A
1C-5F
-- / 1D-5G
Negativo
--
1A-1B-2I-5E-8A
1C-5F
-- / 1D-5G
Muestra no válida (PCR inhibida)
--
1A-1B-2I-5E-8A
--
--
Muestra negativa (ausencia de ADN genómico humano)
--
1A-1B-2I-5E-8A
1C-5F
--
Error de hibridación
--
--
--
--
Positivo Virus Toscana
Positivo Enterovirus
Positivo Parechovirus
Tabla 8b: Posicionamiento de las sondas incluidas en Viral CNS Chip e interpretación de resultados.
11 CARACTERÍSTICAS DEL FUNCIONAMIENTO
11.1 Analítico
11.1.1 Repetitividad
La repetitividad del método se analizó ensayando el método un mínimo de siete veces para cada virus
incluido en el panel a dos concentraciones distintas. El ensayo se realizó por un mismo operador, en una
sola localización, en el mismo día y usando un mismo lote de reactivos.
Virus
HSV1
HSV2
EBV
CMV
VZV
EV
TOSV
HPeV
Concentración (copias/ul)
10
2.5
10
2.5
10
2.5
10
2.5
10
1
25
10
10
2.5
10
2.5
Número de positivos/testados
7/7
7/7
7/7
7/7
7/7
7/7
7/7
6/7
7/7
6/7
7/7
6/7
7/7
7/7
7/7
6/7
% positivos
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
85.7%
100%
85.7%
100%
85.7%
100%
100%
100%
85.7%
Tabla 9: Ensayo de repetitividad para cada uno de los virus incluidos en el panel.
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11.1.2 Reproducibilidad
La precisión del método se analizó variando dos factores que podrían diferir y contribuir a la imprecisión
del método: lotes diferentes de Viral CNS Flow Chip kit y operadores distintos. Se ensayaron cada uno de
los virus incluidos en el panel por duplicado y a dos concentraciones distintas por dos operadores distintos
y usando dos lotes diferentes de Viral CNS Flow Chip kit. Se incluyeron todos los resultados válidos para
calcular el porcentaje de resultados positivos. No se obtuvo ningún falso positivo. Los porcentajes de
resultados positivos se indican en la tabla 10. Los dos lotes ensayados resultan en el mismo porcentaje de
positivos, a excepción de CMV 10 copias, en el que el lote 007 obtiene menos porcentaje de positividad.
En cuanto al factor de variabilidad “operador” el operador número 1 tiende a obtener mayor número de
casos positivos que el operador número 2.
Virus
Nº copias plásmido recombinante
HSV1
40 copias
10 copias
HSV2
40 copias
10 copias
VZV
40 copias
4 copias
CMV
40 copias
10 copias
EBV
40 copias
10 copias
EV
100 copias
40 copias
TOSV
40 copias
10 copias
HPeV
40 copias
10 copias
Nº lote
Nº Lote
Positivos/Validos
007
010
007
010
007
010
007
010
007
010
007
010
007
010
007
010
007
010
007
010
007
010
007
010
007
010
007
010
007
010
007
010
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
3/4
3/4
4/4
4/4
1/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
%
Nº operador
Nº operador Positivos/Validos
%
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
75
75
100
100
25
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
1
2
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
75
50
100
100
75
50
100
100
100
50
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
100
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
3/4
2/4
4/4
4/4
3/4
2/4
4/4
4/4
4/4
2/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
Tabla 10: Ensayo de reproducibilidad para cada uno de los virus incluidos en el panel.
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11.1.3 Especificidad analítica
No se observaron reacciones cruzadas entre los 8 virus incluidos en el test.
Virus
Especificidad
HSV1
HSV2
EBV
VZV
CMV
EV (Echovirus 30)
TOSV
HPeV tipo 1 (Echovirus 22)
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
Tabla 11: Especificidad de Viral CNS Flow Chip.
No se observaron hibridaciones inespecíficas con ninguno de los patógenos relacionados evaluados.
Bacteria
Neisseria meningitidis
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus agalactiae
Haemophilus influenzae
Listeria monocytogenes
Escherichia coli
Virus
Mink enteritis virus
Mumps virus
Adenovirus
Parainfluenza 1
Parainfluenza 2
Parainfluenza 3
Influenza A
Influenza B
Respiratory syncytial virus
Rhinovirus
Tabla 12: Especificidad de Viral CNS Flow Chip.
11.1.4 Sensibilidad analítica
Se calculó el límite de detección del kit para cada uno de los virus analizados. La determinación del
número mínimo de copias víricas detectadas se realizó mediante diluciones seriadas de fragmentos
clonales de ADN de cada uno de los ocho virus detectados por el método amplificadas siguiendo protocolo
y analizadas con el software hybriSoft.
Virus
HSV1
HSV2
VZV
CMV
EBV
EV
TOSV
HPeV
Nº copias plásmido
recombinante (ADN/ARN)
40 copias
10 copias
40 copias
10 copias
40 copias
4 copias
40 copias
20 copias
10 copias
40 copias
10 copias
400 copias
40 copias
40 copias
10 copias
40 copias
10 copias
Nº positivos detectados/nº
positivos totales
21/21
21/21
21/21
21/21
21/21
29/32
22/22
20/21
7/20
21/21
21/21
20/20
20/21
21/21
21/21
21/21
20/21
Sensibilidad
100%
100%
100%
100%
100%
91%
100%
95%
35%
100%
100%
100%
95%
100%
100%
100%
95%
Intervalo de
confianza 95%
(84.5%-100%)
(84.5%-100%)
(84.5%-100%)
(84.5%-100%)
(84.5%-100%)
(75.8%-96.8%)
(85.1%-100%)
(77.3%-99.2%)
(18.1%-56.7%)
(84.5%-100%)
(84.5%-100%)
(83.9%-100%)
(77.3%-99.2%)
(84.5%-100%)
(84.5%-100%)
(84.5%-100%)
(77.3%-99.2%)
Especificidad
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
Intervalo de
confianza 95%
(98.8%-100%)
(98.8%-100%)
(98.8%-100%)
(98.8%-100%)
(98.8%-100%)
(98.8%-100%)
(98.8%-100%)
(98.8%-100%)
(98.5%-100%)
(98.8%-100%)
(98.8%-100%)
(84.5%-100%)
(84.5%-100%)
(98.8%-100%)
(98.8%-100%)
(98.8%-100%)
(98.8%-100%)
Tabla 13: Sensibilidad analítica. Concentración del virus en la muestra con el que se obtiene un 100% de resultados positivos
analizados con software hybriSoft y punto de corte de positividad en un valor de 4.
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11.1.5 Límite de detección
Se calculó también la sensibilidad del método en base al TCID50 calculado según el método de ReedMuench.
Virus
TCID50/100µl
LoD
HSV-1
HSV-2
CMV
VZV
EV (Echovirus 30)
TOSV
HPeV tipo1
HPeV tipo2
106.67
105.57
103.5
103.5
103.5
102
104
102.75
10-2.25TCID50/reacción
10-2.15 TCID50/reacción
10-2.78 TCID50/reacción
10-4.45 TCID50/reacción
10-1.69 TCID50/reacción
10-7.22 TCID50/reacción
10-3.92 TCID50/reacción
10-1.47 TCID50/reacción
Tabla 14: Sensibilidad (LoD) de Viral CNS Flow Chip.
11.1.6 Funcionamiento analítico en hybriSpot 24
Se validó el funcionamiento y robustez de Viral CNS Flow Chip en el equipo automático HS24 analizando
concentraciones límite de ADN/ARN plasmídico de todos los genotipos incluidos en el panel (10 copias
para HSV-1, HSV-2, VZV, EBV y TOSV, 40 copias para CMV y HPeV y 100 copias para EVB). Esta validación
demuestra la reproducibilidad de los resultados entre las posiciones 1 y 24 del equipo HS24 y la
reproducibilidad de los resultados con diferentes programas para distinto número de muestras.
-
Reproducibilidad de resultados en programas para distinto número de muestras
Se realizaron réplicas de una muestra positiva que contenía una concentración límite de ARN de EV (100
GE). Estas réplicas se situaron en diferentes posiciones de la cámara de reacción del equipo HS24 y se
evaluaron diferentes protocolos:
Protocolo para 2 muestras (2 réplicas)
Protocolo para 12 muestras (3 réplicas)
Protocolo para 15 muestras (3 réplicas)
Protocolo para 24 muestras (4 réplicas)
Los resultados fueron analizados de forma automática con hybriSoft y no se detectaron diferencias entre
las distintas posiciones de la cámara de reacción ni entre los protocolos utilizados.
-
Reproducibilidad de resultados en diferentes posiciones de hibridación en HS24
Se realizaron cuatro réplicas para cada virus, situadas en diferentes posiciones de las dos cámaras de
reacción del HS24 y con el protocolo para 24 muestras. Los resultados fueron analizados de forma
automática con hybriSoft, demostrando un 100% de reproducibilidad para todos los virus analizados en
diferentes posiciones.
Virus
Nº GE/reacción
Positivos/testados
Diferencias entre posiciones
HSV-1
HSV-2
VZV
CMV
EBV
EV
TOSV
HPeV
HSV-1
HSV-2
10
10
10
40
10
100
10
40
10
10
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
4/4
No
No
No
No
No
No
No
No
No
No
Table 15: Reprodicibilidad de Viral CNS Flow Chip kit en HS24. Los resultados fueron analizados automáticamente con hybriSoft
estableciendo como punto de corte de positividad un valor de 4.
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11.2 Clínico
Casos clínicos (n=175) previamente analizados con un método de referencia se procesaron de forma
retrospectiva con el kit Viral CNS Flow Chip , además 149 casos de rutina diagnóstica se procesaron con el
kit en un estudio prospectivo en paralelo al método de referencia.
11.2.1 Especificidad Diagnóstica
La especificidad diagnóstica se expresa como un porcentaje (fracción numérica multiplicada por 100),
calculada como 100 × el número de valores verdaderos negativos (VN) dividido por la suma del número de
valores verdaderos negativos (VN) más el número de valores falsos positivos (FP), o 100 × VN/ (VN + FP).
Virus
VN
FP
Especificidad diagnóstica
HSV1
HSV2
EBV
CMV
VZV
EV
TOSV
HPeV
70
70
4
82
90
93
-
1
0
0
0
0
0
-
98.6%
100%
NT
100%
100%
100%
100%
NT
Tabla 15: Especificidad diagnóstica de Viral CNS Flow Chip . NT: No testado.
11.2.2 Sensibilidad Diagnóstica
La sensibilidad diagnóstica se expresa como un porcentaje (fracción numérica multiplicada por 100),
calculada como 100 × por el número de valores verdaderos positivos (VP) dividido por la suma del número
de valores verdaderos positivos (VP) más el número de valores falsos negativos (FN), o 100 × TP/(TP + FN).
Virus
VP
FN
HSV1
HSV2
EBV
CMV
VZV
EV
TOSV
HPeV
37
20
8
20
28
48
26
4
3
2
0
1
0
0
0
0
Sensibilidad diagnóstica
92.5%
91%
100%
95.24%
100%
100%
100%
100%
Tabla 16: Sensibilidad diagnóstica de Viral CNS Flow Chip .
12 LIMITACIONES
Utilización de muestras no adecuadas: el método ha sido validado con material genético purificado
procedente de LCR. El análisis de cualquier otro tipo de muestra no indicado en este manual puede
generar resultados erróneos o no concluyentes, por inhibición de la reacción de RT-PCR por agentes
químicos inhibitorios.
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13 PROBLEMAS Y SOLUCIONES
Problema
Posibles causas
Posibles soluciones
No se observa ninguna señal/
no hay señal de hibridación
Error en el protocolo de hibridación.
Comprobar que se han añadido todos los
reactivos de hibridación correctamente.
Verificar el funcionamiento del equipo HS24.
Repetir el test.
Reactivos de hibridación caducados o no
almancenados correctamente.
Verificar la fecha de caducidad así como el
correcto almacenamiento de los reactivos de
hibridación y Chips. Repetir el test.
Posible degradación del ADN de los Chips
durante el proceso de descontaminación de
superficies y material.
Problemas de contaminación en las zonas prePCR o post-PCR.
Limpiar con agua destilada abundante las
cámaras de reacción. Repetir el test.
Problemas en la amplificación por RT-PCR.
Comprobar que el programa del termociclador
es el adecuado, que la mezcla madre de RTPCR se ha preparado de forma adecuada y que
los reactivos se conservan correctamente.
Repetir el test.
Presencia de inhibidores de PCR en la muestra
problema.
Verificar el correcto funcionamiento del
sistema de extracción de ácidos nucleicos
empleado. Repetir el test.
Verificar que el sistema de extracción del
material genético empleado funciona
correctamente incluyendo un control de
extracción.
Presencia de virus en control negativo
Ausencia de control exógeno de amplificación
Ausencia
de
amplificación
control
endógeno
de
Precipitado de cromógeno en los Chips tras la
hibridación
Señales débiles en la hibridación
Cantidad insuficiente de ADN humado en la
muestra problema.
Presencia de inhibidores de PCR en la muestra
problema.
Mezcla de sustrato, E1 y E2, antigua, no
preparada justo antes de usar.
Vial de preparación “E” con restos
procedentes de un uso previo.
Reactivos de RT-PCR y/o hibridación
caducados o almacenados de forma
incorrecta.
Descontaminar (lejía 1%) las áreas de trabajo
y repetir el test.
Preparar una nueva mezcla de sustrato
mezclando los reactivos E1 y E2 (1:1) justo
antes de su uso. Repetir el test.
Lavar bien con agua el vial “E” antes de usarlo.
Repetir el test.
Comprobar la caducidad de los reactivos, la
conservación de mezcla de PCR y reactivos,
Error en el protocolo de hibridación.
Comrpobar las temperaturas y tiempos de
hibridación y verificar el funcionamiento del
equipo hybriSpot 24.
El producto de PCR no se desnaturalizó
correctamente antes de la hibridación.
Verificar que la desnaturalización se ha
realizado correctamente. Repetir el test.
Baja
calidad/cantidad
empleado.
Incrementar la cantidad de muestra o DN/RNA
de
partida.
Verificar
el
correcto
funcionamiento del sistema de extracción de
ácidos nucleicos empleado.
del
ADN/ARN
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Procedimientos en Microbiología Clínica.
Recomendaciones de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica. SEIMC. ISBN:
84-609-2287-1.
Máster Diagnóstica S.L.
Avda. Conocimiento, 100. P.T. Ciencias de la Salud. 18016. Granada (España).
Tel: +34 958 271 449. master@vitroweb.com ; www.masterdiagnostica.com
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Rev: 27/01/2016
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0318*
15 SÍMBOLOS DE LA ETIQUETA
Producto para uso de
diagnóstico in vitro
Fecha de caducidad
Número de catálogo
Límite de temperatura
Código de lote
Fabricante
Consúltese las instrucciones
de uso
Contenido suficiente para <n>
ensayos
16 GLOSARIO
CNS: sistema nervioso central
LCR: líquido cefalorraquídeo
HSV-1: Herpes simplex 1
HSV-2: Herpes simplex 2
CMV: Cytomegalovirus
EBV: Epstein-Barr Virus
VZV: Varicella-Zoster Virus
TOSV: Toscana Virus
EV: Enterovirus
HPeV: Parechovirus
ADN: ácido deoxirribonucleico
ARN: ácido ribonucleico
PCR: reacción en cadena de la polimerasa
RT-PCR: Transcripción inversa- reacción en cadena de la polimerasa
HS24: hybriSpot 24
NBT-BCIP: nitroblue tetrazolium chloride- 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate
Cod UNG: Cod Uracil-DNA Glycosylase
MgCl2: magnesium chloride
dNTPs: Deoxynucleotide triphosphates
DNases: deoxyribonuclease
RNases: ribonuclease
dUTP: Deoxyuridine Triphosphate
CSF: cerebrospinal fluid
GE: equivalentes de genoma
SEIMC: Spanish Society of Infectious Diseases and Clinical Microbiology
CDC: Centros para el control de enfermedades y prevención
TCID50: dosis infectiva media del cultivo
TP: verdaderos positivos
TN: verdaderos negativos
FP: falsos positivos
FN: falsos negativos
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