Download Bacterias endofiticas y simbióticas de las plantas de fresa y

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS
Informe técnico final (SIP 20080322):
Bacterias endofiticas y simbióticas de las plantas de
fresa y fríjol
Director del proyecto: Dr. En Tao Wang Hu
MEXICO D.F.
OCTUBRE 2008
Resumen
Con objetivo general de conocer las interacciones entre genotipos de planta, condiciones de
suelo y las bacterias asociadas a las plantas, se cuantificaron, aislaron y caracterizaron las
bacterias endofíticas de las plantas de fresa y las bacterias simbióticas de las plantas de
fríjol en México. Las bacterias aisladas se caracterizaron con los métodos moleculares y
bacteriológicos. Los resultados demostraron que: 1) Las poblaciones de rhizobios en suelo
ácido y suelo neutro son diferentes, indicando la existencia de biogeografía de éstas
bacterias asociadas a frijol en México; 2) La abundancia de los rhizobios asociados con
diferentes cultivares de frijol varía mucho en suelo neutral, y se mantuve un nivel bajo para
todos los cultivares en suelo ácido, demostrando que los genotipos de frijol y el pH de suelo
tienen efectos sobre la población de rhizobios; 3) Las plantas de fresa tienen bacterias
endofíticas hasta un abundancia de 7 millones UFC/g de tejitos frescos de la planta, entre
ellas hay una gran proporción que tienen el potencial de mejorar el crecimiento de su
huésped por solubilización de fósforo y fijación de nitrógeno; 4) Ambos las cepas de
rizobios y de bacterias endofíticas forman una base para hacer más investigaciones sobre la
bibliografía y interacciones entre las bacterias, condiciones de suelos y genotipos de las
plantas. Estos resultados ampliaron el conocimiento de la diversidad de rizobios asociados
con frijol en México y forman una base buena para más estudio sobre la interacciones entre
las bacterias, plantas asociadas y suelos.
INTRODUCCIÓN
Fresa y fríjol son dos plantas agrícolas importantes del mundo, específicamente para
México. Como una fruta, fresa es uno de los principales productos mexicanos para
exportar. In adición, fresa también tiene compuestos con bioactividad que inhiben las
patógenas de humanos (Puupponen-Pimiä et al. 2005: Zafra-Stone et al. 2007). Hubo una
investigación sobre microorganismos epifiticos de fresa (Fragaria ananassa cv. Elsanta)
(Krimm et al. 2005), pero todavía los microbios endofiticos de esa planta no se estudian.
Los microorganismos endofiticos se definieron como los que viven dentro las plantas sin
causa de daño visible al huésped. Estos microorganismos pueden dar beneficios a las
plantas asociadas por la fijar nitrógeno, disolver fósforo, producir fitohormonas, inhibir los
patógenos por producción de antibióticos, etc. También se reportó que los endofitos de las
plantas medicinas podrían producir los compuestos bioactivos.
Como un alimento principal de los mexicanos, fríjol (Phaseolus vulgaris) es una rica fuente
de fibra, proteínas, hidratos de carbono, ácidos grasos de poliinsaturados, e vitamina del
complejo B, la riboflavina, el ácido fólico, tiamina y los minerales. Esta planta leguminosa
es nativa a México y se ha cultivado más que 6000 años. Existen múltiples variedades de
fríjol que se caracterizan por su tamaño, forma, el color de su semilla y su tipo de
crecimiento. Fríjol forma nódulos con las bacterias fijadoras de nitrógeno (rizobios), y se
identifica como una planta con baja capacidad de fijación de nitrógeno. Pero esta capacidad
se varia mucho en diferentes cultivares de planta, cepas de rizobio y condiciones de suelo.
ANTECEDENTES
Hasta la fecha, no hubo estudio sobre las bacterias endofiticas de la planta de fresa, pero ya
reportaron varias bacterias patógenas de esa planta, incluyendo Xanthomonas fragariae y
X. arboricola (Weller et al. 2007), y Erwinia amylovora (Atanasova et al. 2005). Nuestro
grupo de investigación en laboratorio de ecología microbiana, ENCB, junto con un grupo
(Dr. Raúl Cárdenas Navarro) en la Universidad Michoacán, realizamos un trabajo sobre el
efecto de inoculación de Glomus intraradices, un hongo micorrizico, sobre la planta de
fresa durante 2006-2007. Como un trabajo adicionado del este proyecto, se cuenteó las
bacterias endofiticas de las plantas de fresa y encontramos que esa planta contuvo 10
millones de las bacterias en sus raíces. Pero no podemos identificarlas y verificar sus
impactos sobre la planta.
Las bacterias simbióticas de fríjol ya se estudiaron por muchos años y se encontraron las
bacterias de Rhizobium etli y Rhizobium gallicum en México. Pero más especies se
reportaron en otros regiones: Sinorhizobium meliloti en Africa (Mnasri et al. 2007),
Bradyrhizobium en un suelo acido (Han et al. 2005), Rhizobium leguminosarum and R.
tropici en Brasil (Andrade et al. 2002), R. giardinii y R. lusitanum en Europa (Valverde et
al., 2006). En nuestro trabajo reciente (SIP 20070538), encontramos que R. leguminosarum
y R. giardinii fueron predominantes en un suelo mexicano, y que el número de rizobios
asociado a las seis cultivares de frijol varió mucho en mismo suelo. Esos resultados
indicaron que las bacterias que nodulan frijol son diferentes, dependiente a la variedad de
frijol y a los suelos.
Como antecedentes, nuestro grupo de investigación también tenemos muchas experiencias
de estudios sobre las bacterias endofiticas y simbióticas de las leguminosas. Con base en
nuestros trabajos, hemos publicados más que 40 artículos científicos en distintas revistas
internacionales, sobre las bacterias simbióticas y endofiticas de las leguminosas, y sobre las
endifiticas fijadoras de nitrógeno en unas plantas de pasto (arroz, caña de azúcar) (ver el
Currículo Vitae).
Justificación
Con nuestros trabajos anteriores, hemos encontraron las bacterias endofiticas de fresa, pero
no sabemos su identidad taxonómica ni sus impactos potenciales sobre el crecimiento de su
huésped. Además, estas bacterias endofiticas también podrían tener algunos bioactividades.
Considerando que esta planta es importante a la economía del nuestro país, y el estudio de
las bacterias endofiticas puede ofrecer conocimientos importantes sobre la interacción entre
las bacterias y las plantas, es valioso a hacer más investigaciones sobre estas bacterias.
En otro lado, todos los trabajos sobre las bacterias simbióticas de frijol no ofrecen
suficientes informaciones sobre la interacción entre bacteria, cultivares, y tipo de suelo.
Nuestros trabajos anteriores ya forman una base para hacer trabajos sobre eso y mas
investigaciones avances podrían producir conocimientos nuevos sobre la biogeografía de
las bacterias simbióticas de frijol en México. Y se podría estimar si el pH de suelo se un
factor determinado sobre la distribución geográfica de estas bacterias.
Aquí, combinamos las bacterias endofiticas y simbióticas de las dos plantas en un proyecto
solo, porque ambos se pueden medir en un objetivo común: para conocer las interacciones
entre plantas, su microbiota endofitica, y los ambientes. Además, es para incluir mínimo
dos alumnas de posgrado en este proyecto, una va a realizar trabajo de bacterias endofiticas
de fresa, y otra va a seguir su tesis sobre las bacterias simbióticas de frijol.
El objetivo general del proyecto fue conocer las bacterias endofiticas y simbióticas
asociadas a las plantas y sus impactos a las plantas. Para cumplir este objetivo,
se cuantificaron y aislaron las bacterias endofiticas de fresa creciendo en diferentes zonas
en México; se cuantificaron y aislaron las bacterias simbióticas asociadas a distintas
cultivares de fríjol en suelos con diferentes pH; y se caracterizaron e identificaron las cepas
bacterianas aisladas de fresa y de fríjol por métodos moleculares y bacteriológicos.
MATERIALES Y MÉTODOS
1. Muestreo. Para aislar las bacterias endofiticas de fresa, se tomaron muestras de plantas
de fresa junto con suelo rizosférico en campos de fresa en Irapuato del Estado de
Guanajuato y en Ixtapan del Estado de México, los cuales son regiones principales de
producción de fresa en México. Para cuantificar y aislar las bacterias simbióticas, se
tomaron suelo de pH acido (pH4.4) en campo de frijol en Hidalga y suelo neutral (pH7.3)
en municipio de Sombrerete, Zacatecas. Mientras se colectaron las semillas de seis
cultivares de frijol: Negro Perla, Negro 8025, Flor de Durazno, Flor de Mayo M 38,
Bayomex, y Bayo INIFAP. Sus características se presentan en la tabla siguiente. Las
muestras se transportaron al laboratorio en bolsas negras de plástico y se conservaron en
refrigerador hasta se usaron.
Características de los cultivares de Phaseolus vulgaris utilizados en el estudio.
CULTIVAR
CLASE
HÁBITO
Bayomex
I
Bayo
Bayo INIFAP
III
Flor de Durazno
Flor de Mayo
I
Flor de Mayo M38
III
Negro Perla
Negro
I
Negro 8025
III
2. Caracterización de las muestras. En laboratorio, se midieron de los suelos el pH,
humedad, contento de materia orgánica, nitrógeno total, fósforo, potasio y textura.
3. Cuantificación y aislamiento de las bacterias endofiticas y simbióticas. Para las
bacterias endofiticas, se pesó 1 g de las raíces y 1 g de hojas de una planta fresca de fresa.
Se las cortaron en piezas de 5 cm y desinfectaron por emergerlas en 95% (v/v) de etanol a
30 s, en 0.01% de HgCl2 a 5 min., y 6 lavados con agua destilada estéril. Se siguió por
moler en 9 ml de agua destilada estéril (la dilución 10-1). Con este extracto, se preparó una
dilución decimal hasta 10-5 en agua destilada estéril. Se sembró una alícuota de 0.1 ml. de
cada dilución de 10-2 a 10-5 en una caja de Petri con medio de cultivo (CPS) (en triplicado).
En cada zona de muestreo, se analizaron 5 plantas individuales. Se incubaron las cajas
sembradas a 28°C a 2 a 5 días y se chantaron las colonias totales y por grupo de morfología
y se calculó la proporción de cada grupo. Se tomaron las diferentes colonias para
purificarlas por método de estría cruzada. Las cepas puras se conservaron en glicerol (20%
w/v) a -70°C.
Para cuantificación de rizobios asociados a frijol, se usó el método da captura por planta de
huésped (Vincent et al. 1970). Se sembraron tres semillas de frijol desinfectadas y pregerminadas en un vaso con vermiculita estéril humeada por solución nutriente sin nitrógeno
de planta. Se crecerán las semillas en invernadero hasta la formación de las primero hojas
reales. Se mantendrán dos plantas normales. Se pesó 1 g de suelo y se realizó una dilución
decimal con la muestra de suelo. Y se inoculó 1 ml de cada dilución en un vaso con dos
plantas (0.5 ml por planta), en cinco repeticiones por dilución. Las plantas sin inoculación
se incluieron como control negativo. Se mantuve el crecimiento de las plantas y los nódulos
se observaron después de un mes. Si en un vaso observó la formación de nódulo, este vaso
se notó cono positivo, y si no se recortó cono negativo. Los resultados se usaron en cálculo
de número más probable (NMP).
Después del cuanta de NMP, los nódulos se usaron en el aislamiento y purificación de las
bacterias simbióticas con los métodos iguales que se usó para las endofirticas, pero
ocupando el medio de cultivo PY. Cada cultiva en cada suelo se aislaron 10 nódulos si es
posible. En caso de que las plantas no tienen 10 nódulos, se aislaron todos los nódulos. Se
incubaron 3 a 14 días para seleccionar las colonias porque las bacterias como
Bradyrhizobium necesitan 7 a 14 días para formar colonias visibles.
4. Caracterización molecular de las cepas aisladas. En este caso, todas las cepas aisladas
de los nódulos se usaron en los análisis de RFLP (restricción fragmento longitud
polimorfolismo) de los DNA espacio ínter génico (IGS) entre 16S y 23S rDNA y
secuenciación del gen de rRNA 16S.
4.1. Extracción del DNA. Las cepas se incubaron en 5 ml de caldo de PY a 28°C con
agitación por una noche. Las células se precipitaron por centrifuga y se usaron en
extracción de DNA por método de CTAB (Zhou et al. 1999).
4.2. Análisis de restricción de DNA ribosomal amplificado (ARDRA) y secuenciación
del gen de rRNA 16S. El gen de rRNA 16S se amplificó de DNA con los iniciadores
universales de fD1 y rD1 (Weisburg et al. 1991) y protocolo de PCR. Los productos de
PCR se digirieron con las endonucleasas MspI, HhaI, HinfI y Sau3AI como reportado
anteriormente. Los patrones de ARDRA se usaron en análisis de agrupación por el método
de UPGMA en el paquete Gelcompar II software (Vauterin and Vauterin 1992). Cepas con
patrones idénticos se definieron como un tipo de rRNA. Con los mismos iniciadores y
protocolo, se amplificó el gen de rRNA 16S de las cepas representativas de cada tipo de
rRNA y se usó el producto de PCR en secuenciación directa (Hurek et al. 1997). Las
secuencias obtenidas se compararon por el programa de BLAST con las relativas en la base
de dato de GenBank. Para identificar las bacterias a géneros o especies, árboles de filogenia
de las bacterias endofiticas y simbióticas se construirán con el programa en paquete Cluster
X (Nick et al. 1994; Thompson et al. 1997) usando el método neighbor-joining y el modelo
Jukes-Cantor. El análisis estadístico de bootstrap con 1000 replicados de cada secuencia se
realizó por el programa en paquete Treeconw (Van de Peer and Wachter 1994).
4.3. Amplificación de IGS. Los DNAs se usaron como blanco en amplificación por PCR
de DNA IGS entre los genes de rRNA 16S y 23S usando los iniciadores de FGPS6 (5´GGA
GAG TTA GAT CTT GGC TCA-3´) y 23S-38 (5´-CCG GGT TTC CCC ATT CGG-3´), y
el protocolo de Rasolomampianina et al. (2005). Los productos de PCR se digerirán con
cada una de las endonucleasas de restricción MspI, CfoI y HaeIII. Los fragmentos de
restricción se separaron, visualizaron y analizaron por métodos iguales que en ARDRA.
Las cepas con patrones idénticos se designaron como un tipo de IGS. Y las cepas se
agruparon por análisis de UPGMA.
4.4. Amplificación de los genes simbióticos. Se usaron los primers nodCF (5’-AYG THG
TYG AYG ACG GTTC-3’) y nodCI (5´-CGY GAC AGC CAN TCK CTA TTG-3’) para
gen de nodC, y nifHF (5’-TAC GGN AAR GGS GGN ATC GGC AA’3’) y nifHI 5’-AGC
ATG TCY TCS AGY TCN TCCA’3’) para nifH, donde Y= C o T; H = A, C o T; R= A o
G; S = C o G; K = G o T; N = A, C, G o T; I = inosina. Los protocolos de Laguerre et al.,
(2001) se emplearon en la amplificación por PCR de estos dos genes. El gen nifH codifica
para la unidad dimérica de la dinitrogenasa reductasa que consta de dos subunidades
idénticas. Ya se usó este gen para verificar la capacidad de fijación de nitrógeno en las
bacterias (Laguerre et al., 2001). El tamaño promedio del amplificado es de ~780 pb. El
gen de nodulación nodC codifica para una n-acetilgucosamintransferasa determinante de la
longitud de la cadena de oligosacáridos de los factores Nod, responsables en gran parte de
la señalización que se lleva a cabo al iniciar la simbiosis. La amplificación de éste gen
produce una única banda de ~950 pb, tal como se reporta en la literatura (Laguerre et al.,
2001). Su amplificación se usa para confirmar si una cepa bacteriana es simbiótico o no.
5. Caracterización genotípica de las bacterias endofíticas. Muchas bacterias endofíticas,
como Bacillus, Pseudomonas, Serratia y Rhizobium, tienen la capacidad de disolver
fósforo, producir fitohormonas, y fijar nitrógeno, las cuales pueden mejorar el crecimiento
de las plantas asociadas con estas bacterias. Por eso, la determinación de estas capacidades
se usó para estimar el potencial de las bacterias como promotores de crecimiento de planta.
5.1. Solubilización de fósforo. Fósforo es un nutriente mineral esencial y es un factor
límite de crecimiento de las plantas en muchos suelos. Algunas bacterias endofíticas y
rizosféricas tienen la capacidad de disolver de fósforo por la producción de ácidos
orgánicos o la degradación de materia orgánica con fósforo. En este análisis, se usó el
medio NBRIP (Nautiyal 1999), el cual tienen fósforo precipitado, para estimar la capacidad
de disolver fósforo inorgánico. Las bacterias endofíticas se sembraron por picadura en las
cajas de Pétri con el medio y se incubaron a 28°C por 2 a 7 días. Las cepas que forman un
halo transparente alrededor de sus colonias se identificaron como positivo de disolver
fósforo.
5.2. Fijación de nitrógeno. Este análisis se realizó en medio mineral sin nitrógeno. Las
bacterias se inocularon por picadura en tubos con 10 ml de medio semisólido y se
incubaron a 28°C por 2 a 7 días. El crecimiento (formar colonia in superficie, o turbidez en
subsuperficie y foundo) se consideró como positivo.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
1. Caracterización de las muestras de suelo. Los resultados se presentan en la Tabla 1.
Estos datos demostraron que los suelos de fresa son ácidos con nivel de nitrógeno
adecuado pero bajo de fósforo. Pero el suelo de Edo. de México tiene alta salinidad. Y
el suelo de Zacatecas tiene alta concentración de fósforo. Estos datos indicaron que el
suelo ácido es común en México.
Característica
Tabla 1. Características del suelos usados en este estudio
Suelos de fresa
Suelos de frijol
Edo. México
Guanajuato
Zacatecas
Hidalgo
5.7
6.4
7.38
4.4
0.13%
0.13%
0.216%
0.114%
Fósforo
9.5 mg/kg
7.34 mg/kg
1310 mg/kg
37.36 mg/kg
Potasio
4,193.4 mg/kg
224.7 mg/kg
ND*
3123.59 mg/kg
pH
Nitrógeno total
*. ND: no determinado.
2. Cuantificación y aislamiento de las bacterias
2.1. Cuantificación de los rizobios de frijol. Los datos presentados en la Tabla 2
indicaron las abundancias de rizobios asociados a diferentes cultivares de frijol en
distintas suelos. La comparación de números de rizobios asociados a los cultivares
en dos suelos (Fig. 1) demostraron las interacciones entre tipo de suelo, genetipo de
frijol y población de rizobio. Estos resultados demostraron que en suelo
ligeramente alcalino de Zacatecas hubo mayor cantidad de rizobio de frijol que en
suelo ácido de Hidalgon en general; y que la capacidad de nodulación se varió
mucho entre diferentes cultivares. Estos resultados demostraron que ambos de
cultivares y tipos de suelo afectaron el tamaño poblacional de rizobios de frijol.
Tabla 2. Abundancia de rizobios de frijol en dos suelos mexicanos
Cultivar
Negro Perla
Negro 8025
Flor de Durazno
Flor de Mayo M 38
Bayomex
Bayo INIFAP
NMP de rhizobios por gramo de suelo seco
Zacatecas (pH 7.3)
Hidalgo (pH 4.4)
180
220
250
110
540
46
1610
170
210
220
350
250
NM
P de rizobios por
g de
suelo
Rhizobios
por
gramo
NMP de rhizobios por gramo de suelo
1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
Suelo Zacatecas
Suelo Hidalgo
Negro
Perla
Negro
8025
Flor de
Durazno
Flor de Bayomex
Mayo M
38
Bayo
INIFAP
Fig. 1. Abundancia de los rhizobios asociados a c.v.
diferentes
cultivares en suelo neutro y ácido.
de frijol
2.2. Cuantificación de las bacterias endofíticas de plantas de fresa. En la Tabla 3 se
presentan los resultados de cuantificación de bacterias endofíticas asociadas a
plantas de fresa. Estos datos demostraron que en raíces vivieron las bacterias 100 a
100000 veces más que las en hojas; y que el pH y salinidad de suelo no afectaron la
cantidad de bacterias endofíticas el las plantas.
Tabla 3. Abundancia de las bacterias endifíticas de las plantas de fresa
Planta
Estado de México
(pH5.7, potasio 4,193.4 mg/kg)
Hoja
Raíz
Estado de Guanajuato
(pH6.3, potasio 224.7 mg/kg)
Hoja
Raíz
1
8 X 102
6.7 X 105
2 X 102
1.3 X 105
2
6 X 102
5.3 X 107
2.5 X 102
2.3 X 105
3
2.5 X 103
2 X 105
3 X 102
6 X 104
4
3 X 102
4 X 105
7 X 103
5.3 X 107
5
2 X 103
1.1 X 107
1 X 103
7.6 X 106
2.3. Aislamiento de los rizobios. Se aislaron 120 cepas de bacterias simbióticas de
frijol, incluyendo 60 de cada tipo de suelo. Todos estos aislados mostraron una
morfología colonial similar. Todas formaron colonias redondas, de 1 mm de
diámetro, blancas, de bordes enteros y mucoides en 3 días, por lo cual se clasifican
dentro del grupo de Rhizobium o Sinorhizobium que son considerados rizobios de
rápido crecimiento. Así se descarta que pudieran tratarse de Bradyrhizobium, los
cuales son rizobios de lento crecimiento y se aislaron de los suelos ácidos en China
(Han et al. 2005)
2.4. Aislamiento de las bacterias endofíticas. Se obtuvieron 120 cepas de bacterias
endofiticas de fresa, incluyendo 60 de cada muestra de suelo. Estas bacterias se
dividieron en 4 tipos de colonia (Tabla 4) con diferentes proporciones (Fig. 2).
Fig. 2. Constructura poblacional de
las bacterias endofíticas en plantas de
fresa porlas morfologías.
Tabla 4. Tipos de morfología de las bacterias endofíticas de fresa
MORFOLOGÍA COLONIAL
Aislados Color
MICROSCÓPICA
Forma
Borde
Elevación
Consistencia
Rizada
Lobulado
Convexa
Mucoide
4
Beige
18
Transparente Circular Entero
Plana
Suave
17
Blanco
Circular Entero
Plana
Mucoide
6
Blanco
Rizada
Convexa
Suave
22
Blanco
Circular Entero
Plana
Mucoide
8
Transparente Irregular Ondulado
Convexa
Suave
10
Amarilla
Rizada
Rugosa
Suave
5
Amarilla
Circular Entero
Rugosa
Mucoide
2
Blanco
Circular Entero
Rugosa
Suave
2
Beige
Circular Entero
Mucoide
4
Blanco
Circular Entero
Dura
1
Café
Circular Entero
Dura
1
Naranja
Circular Entero
Dura
Ondulado
Ondulada
Forma
Gram
Bacilo
+
Bacilo
-
Coco
+
Micelio
+
3. Caracterización de los rizobios. En el análisis de RFLP del gen rRNA 16S, la
combinación de los patrones producidos por las enzimas nos produce hasta el momento
5 genotipos distintos distribuidos entre los 6 cultivares de frijol, encontrándose 3 de
éstos en el cultivar Flor de Durazno. Esto podría ser indicativo de que las relaciones
simbióticas con esta planta se basan en la capacidad de aceptar diferentes bacterias
simbióticas en sus raíces, aunque éstas no sean efectivas en su nodulación, como se
pudo observar en la cantidad de nódulos por planta. Éste fenómeno podría estar dado
también por que la planta pudiese necesitar de una cantidad realmente alta de rhizobios
en su rizósfera para poder iniciar la señalización que llegue a una nodulación exitosa
(González et al., 2003).
Según los resultados de la Tabla 5, los aislados obtenidos de suelo neutro de Zacatecas
son diferentes a las cepas de referencia R. tropici, R. giardinii, R. gallicum y R.
leguminosarum. Esto nos indica una diferencia entre la diversidad de rhizobios de suelo
neutro con la de suelo ácido, donde se encontró R. leguminosarum y R. giardinii
(nuestros datos no publicados). Así nos resulta clara la biogeografía o distribución
geográfica de los rhizobios asociados a frijol en suelo mexicano, así como se ha
reportado para el haba (Tian et al., 2007) y soya (Man et al., 2008; Han et al., 2008).
Tabla 5. Patrones de RFLP obtenidos con las 4 enzimas de los aislados de rizobios y cepas de referencia. Los
cuadros en blanco simbolizan aquellos resultados que aun no se obtienen.
Cepa de referencia
R. tropici CFN 299
R. tropici CIAT 899
R. giardinii bv. giardinii H152
R. gallicum R602 sp.
R. leguminosarum USDA2370
Aislado de rizobios
NP1, NP6, NP8
NP2, NP3, NP4, NP5, NP7, NP10
NP9
N81, N83, N84, N85, N87, N88, N89
N82, N86, N810
BI2
BI1, BI3, BI5, BI6, BI9, BI10
BI8
BI4, BI7
BM1, BM6
BM4
BM5
BM2, BM3, BM7, BM8, BM9, BM10
FD1, FD2, FD5, FD7, FD8, FD9, FD10
FD3, FD4
FD6
FM1, FM2
FM3
FM5
FM4, FM6, FM7, FM8, FM9
Origen Geográfico
HaeIII
C
B
B
A
B
México
Colombia
Francia
Francia
USA
Cultivar
Negro Perla
Negro 8025
Bayo Inifap
A
A
A
A
A
A
A
C
A
C
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
C
A
A
C
A
A
A
C
C
A
A
A
Bayomex
A
A
B
A
Flor de Durazno
Flor de Mayo M38
Patrón de RFLP
HinfI
AluI
B
A
A
A
A
B
A
C
A
MspI
A
A
A
A
A
B
A
A
A
A
D
A
A
A
A
En cuanto al aislado BM4 tanto su tamaño de 16S rDNA, ITS, así como el patrón de
RFLP nos sugiere que se trata de un aislado diferente del resto. Aun no se sabe si
pertenece al género Rhizobium o podría ser otro género capaz de fijar nitrógeno y que
se encontrara en el nódulo como un endofítico.
El espacio intragénico entre el 16S rDNA y el 23S rDNA, produce una banda de ~2500
pb en las cepas de referencia, al igual que en los aislados problema. El aislado BM 4
muestra una diferencia en su tamaño de espacio intragénico, siendo menor que el resto
(aprox. 1800pb). Con el análisis RFLP del espacio intragénico (ITS) hasta el momento
se ha logrado discernir 5 genotipos distintos utilizando solamente una enzima (HaeIII)
en 25 de los aislados (Fig. 3). Aún falta hacer el análisis con el resto de las enzimas y
los aislados para obtener la diversidad total de genotipos.
M
1
I
2
I
3
I
4
II
5
III
6
I
7
I
8
III
M
Fig. 3. Ejemplos de tres
patrones
(en
números
romanos) de RFLP de IGS
de los genes de rRNA 16S23S obtenidos en aislados
rizobianos de frijol Negro
Perla. M: Marcador de talla
molecular. Canal 1 a 8 son
aislados de rizobio. M:
marcador de peso molecular
de 100 pb.
El gen simbiótico nifH fue amplificado como una banda de ~780 pb en todos los
aislados, excepto en NP6 y N88, en los cuales no se ha podido amplificar este gen con
las condiciones establecidas (Figura no presenta). En los aislados BM1, BM3, BM5,
BM6, BM7, BM8, BM9, BM10, CIAT 899 y BI1 a BI10 se pudieron observar bandas
inespecíficas. Al elevar la temperatura de alineamiento, no era posible obtener el
amplificado del producto.
Por el momento se están esperando los resultados de la secuenciación de los genes 16S
rRNA, nifH y nodC, cuyas muestras ya fueron enviadas a un laboratorio de referencia.
4. Caracterización de las bacterias endofíticas. En este estudio, se encontraron en los
100 cepas bacterianas de fresa una porcentaje 35% tiene la capaz de solubilizar el
Ca3(PO4)2 y algunos ejemplos se presentan en Fig. 5. Hasta la fecha, se analizaron 30
aislados de la capacidad de fijación de nitrógeno y entre ellas 19 crecen en medio
mínimo sin fuente de nitrógeno combinado. Estos resultados demostraron que las
bacterias endofíticas tienen potencial para promocionar el crecimiento de la planta de
fresa. La identificación y más caracterización están en proceso como una parte de otro
proyecto.
La Biogeografía es una disciplina que se encarga del estudio de los seres vivos
distribuidos en el mundo, así como las relaciones entre éstos y los factores climáticos,
edafológicos y humanos. Nos permite interpretar la estructura y la función de una
comunidad en el espacio. En los últimos años, la biogeografía aplicada a la microbiología
ha adquirido gran importancia ya que al identificarse nuevas especies, se incrementa el
número de interacciones descubiertas entre éstas y su medio ambiente. In el caso de rizobio,
Vargas et al. (1989) demostraron que había importantes efectos en el porcentaje de
ocupación de nódulos variando el cultivar de frijol, la cantidad de inóculo, el pH y la cepa
de Rhizobium. En China, se han investigado los rhizobios asociados a muchas leguminosas
cultivadas y silvestres durante las últimas 3 décadas. Basado los resultados de los estudios,
se encontró que las poblaciones de rhizobios asociados al misma leguminosa son diferentes
en diferentes eco-regiones, indicando la existencia de biogeografía en rhizobios de haba
(Tian et al., 2007), de soya (Man et al., 2008; Wang et al., 2008), y de frijol (Han et al.,
2005; Wang et al., 2008). Entonces, La distribución geográfica de los rhizobios no sólo
depende, como en la mayoría de las bacterias de vida libre, de factores como las
características propias de la cepa y los factores ambientales de su entorno; sino que además
influyen las características de su planta hospedera. Aunque todavía no hay mucha
investigación de la biogeografía de bacterias endofíticas, la situación de estas bacterias
debería similar que la de las semióticas.
Fig. 5. Foto de colonia bacteriana
demostrando la solubilización de
fósforo. La zona transparente
alrededor de la colonia indica la
solubilización de Ca3(PO4)2.
Debido a que México presenta amplia variedad de climas, orografía y de tipos de suelo, se
han desarrollado variedades de frijol para cada región del país, capaces de soportar
condiciones adversas predominantes en dichas zonas. Aún así el frijol por naturaleza es
poco resistente a condiciones extremas como pH alto o bajo, falta de nutrientes en el suelo
y escasa precipitación pluvial. La inoculación con rhizobios para establecer una simbiosis
con la planta ayuda a superar dichos obstáculos en parte, ya que la fijación de nitrógeno
consecuencia de dicha simbiosis o asociación entre planta de fresa y sus bacterias
endofíticas aumenta notablemente la productividad total de la planta, mientras que en la
rizósfera se generan condiciones menos agresivas para la planta que en ausencia de los
microorganismos.
El presente trabajo propone identificar las cepas de rhizobios que nodulan los diferentes
cultivares de frijol y las bacterias endofíticas de las plantas de fresa, tanto a un pH de suelo
neutro como a uno bajo. Identificando los microorganismos nativos de las regiones
estudiadas es posible establecer relaciones filogenéticas entre otras especies bacterianas ya
estudiadas y así aportar más hacia los estudios de evolución, diversificación y
especialización tanto de los rhizobios como del frijol y las bacterias endofíticas, puesto que
se tiene la teoría que tanto las bacterias como las plantas antes mencionadas evolucionaron
conjuntamente para establecer relaciones específicas huésped-bacterias.
Siendo México uno de los principales productores de frijol y de fresa, es importante
conocer los microorganismos que asocian con estas plantas, así como las condiciones a las
cuales se da esta asociación, para así poder elaborar una estrategia agrícola para la
utilización de microorganismos como fuente de nitrógeno en lugar de fertilizantes
nitrogenados, que a la larga inducen efectos nocivos en la planta y disminuyen la
productividad de los suelos.
Es de notarse la diferencia entre las cantidades de rhizobios en ambos suelos en los
cultivares Flor de Durazno y Flor de Mayo M38, donde puede observarse una disminución
de hasta 10 veces la cantidad de bacterias de un pH neutro a uno ácido. La variedad Flor de
Mayo M38 fue desarrollada en México (Acosta-Gallegos et al., 1995) con la capacidad de
crecer en suelos con baja fertilidad como los presentes en la zona Centro-Norte del país,
que comprende los estados de Zacatecas, Durango y Chihuahua. Siendo que Flor de Mayo
M38 es habitual en los suelos de éstas regiones, se podría explicar la gran cantidad de
rhizobios por gramo de suelo encontrados en ésta combinación de cultivar con muestra de
suelo, ya que al haber recurrencia de siembra de ésta variedad en el mismo suelo, el frijol
podría haber desarrollado cierta preferencia por los rhizobios nativos de esa zona. Por lo
tanto, en contacto con un suelo altamente ácido podría deteriorar las facultades simbióticas
de la planta. Vargas y Graham (1989) encontraron un efecto significativo en el porcentaje
de ocupación de nódulos debido a variaciones en el pH, cultivar de la planta hospedera y
radio de inoculación. El pH ácido del suelo afecta las fases iniciales de la formación de la
simbiosis, incluyendo la señalización entre las raíces de la leguminosa y las bacterias
simbióticas (Hungria y Stacey, 1997). Esto también explica el por qué en la mayoría de los
cultivares de frijol analizados disminuyó el numero de rhizobios por gramo de suelo en un
pH ácido. Aunque es posible que éstas diferencias en el NMP de rhizobios sean el
resultado de la intervención de otros nutrientes y iones como Ca, Mg, K; ha sido reportado
que dentro de las condiciones ambientales una de las que más influencia presenta en la
diversidad de microorganismos es el pH del ambiente (Fierer et al., 2005). Estos resultados
aumantan el conocimiento de la diversidad y la biogeografía de rizobios asociados con
frijol en México.
En el caso de bacterias endofíticas, su diversidad y efectos de condiciones de suelo sobre la
diversidad se necesitan más estudio y los resultados de este trabajo forman una base buena
para seguir.
CONCLUSIONES
1) Las poblaciones de rhizobios en suelo ácido y suelo neutro son diferentes, indicando la
existencia de biogeografía de éstas bacterias asociadas a frijol en México.
2) La abundancia de los rhizobios asociados con diferentes cultivares de frijol varía mucho
en suelo neutral, y se mantuve un nivel bajo para todos los cultivares en suelo ácido,
demostrando que los genotipos de frijol y el pH de suelo tienen efectos sobre la población
de rhizobios.
3) Las plantas de fresa tienen bacterias endofíticas hasta un abundancia de 7 millones
UFC/g de tejitos frescos de la planta, entre ellas hay una gran proporción que tienen el
potencial de mejorar el crecimiento de su huésped por solubilización de fósforo y fijación
de nitrógeno.
4) Ambos las cepas de rizobios y de bacterias endofíticas forman una base para hacer más
investigaciones sobre la bibliografía y interacciones entre las bacterias, condiciones de
suelos y genotipos de las plantas.
SUBPRODUCTOS
1) Por apoyo de este proyecto, tenemos xx publicaciones en revista internacional, como
trabajo junto con otros grupos de investigación:
i)
R.Z. JIA, J. GU, C.F. TIAN, C.X. MAN, E.T. WANG, W.X. CHEN (2008)
Screening of high effective alfalfa rhizobial strains with a comprehensive protocol.
Annals of Microbiology 58(4): 731-740 (pISSN: 1590-4261) (Italia)
ii) Wang H, Man CX, Wang ET, Chen WX (2009) Diversity of rhizobia and
interactions among the host legumes and rhizobial genotypes in an agriculturalforestry ecosystem. Plan Soil. 314(1): 169-182 (pISSN: 0032-079X) (Netherlands)
iii) Hou BC, Wang ET, Li Y, Jia RZ, Chen WF, Man CX, Sui XH, Chen WX (2009)
Rhizobial resource associated with epidemic legumes in Tibet. Microbial Ecol.
57(1): 69-81. (USA)
iv) Man CX, Wang H, Chen WF, Sui XH, Wang ET & Chen WX (2008) Diverse
rhizobia associated with soybean grown in the subtropical and tropical regions of
China. Plant and Soil 310(1):77-87. (Netherlands)
v) Zhao CT, Wang ET, Chen WF, Chen WX (2008) Diverse genomic species and
evidences of symbiotic gene lateral transfer detected among the rhizobia associated
with Astragalus species grown in the temperate regions of China. FEMS Microbiol
Lett. 286(2):263-73. (ISSN0378-1097) (Inglaterra)
vi) Lei X, Wang ET, Chen WF, Sui XH, Chen WX (2008) Diverse bacteria isolated
from root nodules of wild Vicia species grown in temperate region of China. Arch
Microbiol. 190(6):657-71. (pISSN: 0302-8933) (Alemania)
2) Con apoyo del proyecto, se presentaron x trabajos en dos congresos nacionales:
i) Verástegui MM, Lira E, Wang ET. Effecto del tipo de suelo y cultivar de la planta
sobre la simbiosis entre frijol y rhizobios. VIII Congreso Nacional de la Fijación
Biologica de Nitrógeno. Cuernavaca, 29-31 de octubre de 2008.
ii) Ibarra Sánchez CL, Wang Hu ET. Cuantificación y caracterización de bacterias
fijadoras de nitrogeno aisladas de suelos de chinampa. VIII Congreso Nacional de
la Fijación Biologica de Nitrógeno. Cuernavaca, 29-31 de octubre de 2008.
3) Con apoyo de este proyecto, tres alumnas están realizando tesis de posgrado con beca de
PIFI.
BIBLIOGRAFÍA
(no se presenta)