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UNIVERSIDAD DE SALAMANCA
CENTRO HISPANO-LUSO DE INVESTAGACIONES AGRARIAS
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGÍA VEGETAL
Papel del ácido salicílico en la interacción entre el hongo beneficioso
Trichoderma harzianum y la planta modelo Arabidopsis thaliana
Jorge Poveda Arias
Trabajo Fin de Grado. Curso 2012-2013
ABREVIATURAS
ABA
Ácido abscísico
MQ
Mili-Q
BA
Ácido benzoico
MTI
Inmunidad activada por MAMP
BA2H
Ácido benzoico 2-hidrolasa
ORF
Fase de lectura abierta
BRs
Brasinoesteroides
PAL
Fenilalanina amonio liasa
BSMT1
BA/SA carboxilo metiltransferasa 1
PCR
Reacción en cadena de la polimerasa
cDNA
DNA complementario
PDA
Patata dextrosa agar
CKs
Citoquininas
PDB
Caldo de patata dextrosa
CM
Corismato mutasa
PGPRs
Rizobacterias promotoras del
CP
crossing points
CTAB
Bromuro de hexadeciltrimetilamonio
DEPC
Dietil pirocarbonato
DNA
Ácido desoxirribonucleico
dNTPs
Desoxirribonocleótidos trifosfato
EDTA
Ácido etilendiamino-tetracético
EE.UU.
Estados Unidos
ET
Etileno
FAA
Formalin-acetato-alcohol
GAs
Giberelinas
GFP
Proteína verde florescente
HR
Respuesta hipersensible
ICS
Isocorismato sintasa
IPL
Isocorismato piruvato liasa
ISR
Respuesta sistémica inducida
JA
Ácido jasmónico
M
Molar
MAMPs
Patrones moleculares asociados a
crecimiento
Phe
Fenilalanina
PR
Relacionadas con la patogénesis
RNA
Ácido ribonucleico
ROS
Especies reactivas de oxígeno
SA
Ácido salicílico
SAG
2-O-β-D-glucosidasa
SAR
Respuesta sistémica adquirida
SDS
Dodecil sulfato sódico
TBS
Tampón tris salino (Tris Buffered
Saline)
microorganismos
t-CA
Ácido trans-cinámico
Tris
Tris-(hidroximetil)-aminometano
UGT
UDP-glucosiltransferasa
UV
Ultravioleta
v/v
Volumen/Volumen
w/v
Peso/Volumen
ÍNDICE
INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 1
1.- CONTROL BIOLÓGICO. .............................................................................................................. 1
2.- EL GÉNERO Trichoderma.............................................................................................................. 1
2.1.- Trichoderma como agente de control biológico. ...............................................................2
2.1.1.- Micoparasitismo. ..........................................................................................................2
2.1.2.- Antibiosis. .....................................................................................................................3
2.1.3.- Competición con el patógeno. .....................................................................................3
2.1.4.- Promoción del crecimiento de la planta. ....................................................................3
2.1.5.- Incremento de la tolerancia de la planta a estreses abióticos. .................................4
2.2.6.- Inducción de las defensas de la planta frente a patógenos. ......................................4
3.-EL ÁCIDO SALICÍLICO (SA). ...................................................................................................... 4
3.1.- Relación del SA con otras hormonas. ...............................................................................6
3.2.- Papel del SA frente a la colonización por hongos. ...........................................................7
4.- HIPÓTESIS DE PARTIDA Y OBJETIVOS. ............................................................................. 9
5.- JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO............................................................................................ 10
MATERIALES Y MÉTODOS................................................................................. 11
1.- MATERIAL BIOLÓGICO UTILIZADO. ................................................................................ 11
1.1.- Semillas. .............................................................................................................................11
1.2.- Microorganismos. .............................................................................................................11
2.- CONDICIONES DE GERMINACIÓN...................................................................................... 11
2.1.- Siembra de semillas. .........................................................................................................11
2.2.-Obtención de plántulas. .....................................................................................................11
3.-MANIPULACIÓN DE Trichoderma harzianum. ...................................................................... 12
3.1.- Medios de cultivo. .............................................................................................................12
3.2.- Cultivo de Trichoderma harzianum. ................................................................................12
3.2.1.- Recogida de esporas.......................................................................................................12
3.2.2.- Cultivo para la obtención de micelio. ................................................................................. 12
4.- CONSERVACIÓN DE CEPAS.................................................................................................... 13
4.1.- Hongos filamentosos. ........................................................................................................13
4.2.- Plantas................................................................................................................................13
i
5.- INOCULACIÓN E INFECCIÓN DE PLANTAS CON Trichoderma harzianum............ 13
6.- ANÁLISIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS. .................................................................................... 13
6.1.- Extracción de DNA genómico. .........................................................................................13
6.2.- Extracción de RNA total. .................................................................................................13
6.3.-Cuantificación de ácidos nucleicos. ..................................................................................14
6.4.- Obtención de cDNA: Transcriptasa inversa. .................................................................14
6.5.- Electroforesis de ácidos nucleicos. ..................................................................................14
6.6.- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR). .................................................................14
6.6.1.- PCR a tiempo real (Real-time PCR). .......................................................................14
6.6.3.- Oligonucleótidos utilizados. ......................................................................................15
6.6.4.- Diseño de oligonucleótidos. .......................................................................................15
7.- OBRTENCIÓN DE MUTANTES DE T-DNA. ........................................................................ 15
8.- MICROSCOPÍA CONFOCAL DE BARRIDO. ...................................................................... 16
9.- LOCALIZACIÓN DE CALOSA EN CORTES HISTOLÓGICOS. ................................... 16
10.- ANÁLISIS Y PRESENTACIÓN DE DATOS. ....................................................................... 16
10.1.- Análisis informático. .......................................................................................................16
10.2.- Presentación de datos. ....................................................................................................17
RESULTADOS .......................................................................................................... 18
1.- COLONIZACIÓN DE LA RAÍZ POR Trichoderma harzianum. ........................................ 18
2.- EXRESIÓN DE LOS GENES DE DEFENSA .......................................................................... 21
3.- EFECTO DE Trichoderma harzianum GFP22 EN EL CRECIMIENTO Y
DESARROLLO DE Arabidopsis................................................................................................... 22
DISCUSIÓN ............................................................................................................... 23
CONCLUSIONES ..................................................................................................... 26
BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................................... 27
ii
INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
1.- CONTROL BIOLÓGICO.
Se conoce como Control Biológico a la utilización de organismos naturales o modificados,
genes o productos génicos, para reducir los efectos de organismos y productos indeseables y para
favorecer el desarrollo de organismos útiles para el hombre, tales como cultivos, árboles, animales y
organismos beneficiosos (Hjeljord & Tronsmo, 1998).
Las enfermedades de las plantas, a menudo provocadas por diferentes patógenos así como
diferentes situaciones de estrés abiótico, provocan grandes pérdidas en la agricultura tanto a nivel
de producción como de calidad.
El objetivo principal del Control Biológico, el cual actúa de forma menos agresiva para el
medio ambiente que los métodos químicos, es reducir las enfermedades y plagas de las plantas y se
caracteriza por:
 No elimina la enfermedad sino que mantiene al patógeno dentro del equilibrio natural. Al
contrario, los fungicidas químicos, matan al patógeno y a sus enemigos naturales, de modo
que si reaparece el patógeno, el daño que causa es mucho mayor.
 Cada relación planta-patógeno es absolutamente única, producto de su coevolución en el
tiempo, por lo que sus posibilidades son limitadas.
 Si se realiza adecuadamente, los efectos perjudiciales para organismos beneficiosos son
prácticamente nulos.
 Es un procedimiento duradero, barato e inocuo para la vida en general, por lo que a largo
plazo resulta más económico que los métodos hasta ahora utilizados, y enlaza perfectamente
con el concepto de desarrollo sostenible.
2.- EL GÉNERO Trichoderma.
El género Trichoderma agrupa hongos filamentosos pertenecientes a la División
Deuteromicota (Gams et al., 1987), en la cual se incluyen los hongos de los que sólo se conoce su
reproducción asexual (formación de conidios), careciendo de reproducción sexual o estado
teleomórfico, y dentro de ésta, a la clase de los Hifomicetos, ya que producen los conidios a partir
de células desnudas (Webster, 1980). Las cepas más utilizadas como agentes de control biológico
en agricultura pertenecen a cuatro especies: T. harzianum, T. atroviridae, T. virens y T. asperellum
(Monte, 2001; Lorito et al., 2010; Montero-Barrientos et al., 2011).
1
INTRODUCCIÓN
Comprende un grupo de hongos de rápido crecimiento que son habituales en suelos
forestales, agrícolas y pastizales, y se han aislado en todos los continentes (Hermosa et al., 2004;
Sadfi-Zouaoui et al., 2009). En general, hablamos de unos microorganismos con gran capacidad
adaptativa a distintos ambientes y sustratos, lo cual daría a Trichoderma ventaja sobre otros muchos
hongos filamentosos durante la colonización de los suelos cuando se utiliza en formulados para el
control de hongos fitopatógenos.
2.1.- Trichoderma como agente de control biológico.
Fue Weindlig en 1932 quién describió por primera vez la capacidad antagonista de
Trichoderma lignorum (hoy T. viridae) sobre el patógeno Rhizoctonia solani. Actualmente T.
harzianum, sola o en combinación con otras especies de Trichoderma, está siendo utilizada en
preparaciones comerciales como TUSAL ® para el control de numerosas enfermedades de plantas
producidas por hongos (Cook, 1997; Grondona et al., 2001).
Los mecanismos de acción de Trichoderma spp. como agente de biocontrol son mostrados a
continuación:
2.1.1.- Micoparasitismo.
Relación en la que Trichoderma (hongo parásito) se beneficia del hongo hospedador, del
que obtiene nutrientes sin aportarle nada a cambio, causándole estrés o incluso la muerte. Cuando
ocurre esto último se habla de parasitismo necrotrofo para diferenciarlo del parasitismo biotrofo, en
el que se mantiene relación entre células vivas durante largos períodos de tiempo.
A
B
C
Figura 1: Vista a microscopio electrónico de barrido del micoparasitismo ejercido por
Trichoderma sp. sobre Rhizoctonia solani. (A) Hifa de Trichoderma (T) enroscándose en una hifa
de R. solani (R). (B) Apresorios formados en la interacción Trichoderma-Rhizoctonia (la barra
equivale a 10 µm). (C) Hifa de R. solani (de la que se ha retirado la hifa de Trichoderma) con los
poros provocados por el micoparásito. (Adaptado de Harman et al., 2004).
El micoparasitismo se entiende como un proceso secuencial. En primer lugar, Trichoderma
localiza al patógeno y comienza a crecer por quimiotropismo hacia él (Lu et al., 2004). Una vez que
2
INTRODUCCIÓN
los hongos entran en contacto, Trichoderma puede enroscarse alrededor de su presa y formar
estructuras especializadas de tipo apresorio, con las que podrá penetrar en el interior de las hifas del
patógeno (Inbar & Chet, 1996; Rocha-Ramírez et al., 2002; Harman et al., 2004). Finalmente
Trichoderma entra al interior del micelio hospedador y digiere el contenido intracelular del hongo
(Benhamou & Chet, 1996). (Figura 1).
2.1.2.- Antibiosis.
La antibiosis consiste en la inhibición del crecimiento de un organismo por el producto
metabólico de otro, sin que medie contacto físico entre ellos. Este proceso ocurre cuando se
producen interacciones entre antibióticos secretados por Trichoderma, de modo que se inhibe el
crecimiento de otros microorganismos.
2.1.3.- Competición con el patógeno.
Se entiende por competición el desigual comportamiento de dos o más organismos ante un
mismo requerimiento o recurso, de manera que la utilización de éste por uno de ellos reduce la
cantidad disponible para los demás. La ubicuidad de Trichoderma en suelos de todo el mundo
demuestra que es un buen competidor por el espacio y por los nutrientes disponibles (Hermosa et
al., 2004). A pesar de todo, es difícil determinar hasta qué punto Trichoderma es capaz de ejercer su
acción antagonista sólo a través de la competición, o si otros mecanismos, como el micoparasitismo
o la antibiosis, preparan el escenario para que la competición se lleve a cabo de una forma eficaz
(Harman, 2006).
2.1.4.- Promoción del crecimiento de la planta.
Algunas cepas pertenecientes a especies como T. harzianum, T. atroviride y T. virens han
mostrado capacidad para promover el crecimiento y el desarrollo de las raíces de las plantas (Chang
et al., 1986; Yedidia et al., 2001), lo cual implica un incremento de la productividad en los cultivos
(Harman et al., 2004). Para explicar este hecho se habían sugerido varios mecanismos como son la
producción de factores de crecimiento y vitaminas, el control de patógenos menores, o la
conversión de material no utilizable (metales como zinc, manganeso, hierro, cobre) en formas que
puedan ser asimiladas por las plantas (Altomare et al., 1999).
En los últimos años, varios trabajos que incluyen mutantes de plantas y transformantes de
Trichoderma han demostrado que algunas cepas de este hongo pueden producir ácido indol acético
(IAA), la auxina vegetal, regulando los niveles de esta hormona en la rizosfera (Contreras-Cornejo
et al., 2009), incrementar la capacidad fotosintética (Vargas et al., 2009), o modificar la arquitectura
de la raíz, aumentando el número de raíces secundarias y pelos radicales, favoreciendo así la toma
3
INTRODUCCIÓN
de nutrientes (Samolski et al., 2012). Además, su capacidad para reducir la disponibilidad de etileno
en las plantas, disminuyendo los niveles de su molécula precursora, promueve el crecimiento de las
mismas (Viterbo et al., 2010).
2.1.5.- Incremento de la tolerancia de la planta a estreses abióticos.
Son bien conocidos los efectos beneficiosos de Trichoderma en plantas, si bien muchos de
los múltiples mecanismos por los que ejerce estos beneficios son todavía desconocidos.
Recientemente se ha demostrado que ese incremento de tolerancia es debido, al menos en parte, a
que T. harzianum reduce la acumulación de ROS (especies reactivas de oxígeno) en las plantas y
también a que aminora los daños provocados por estreses como sequía, salinidad, frío y calor
(Mastouri et al., 2010).
2.2.6.- Inducción de las defensas de la planta frente a patógenos.
Se ha demostrado que, al colonizar las raíces, Trichoderma estimula los mecanismos de
defensa de la planta, lo que conlleva un incremento de su resistencia frente a varios
microorganismos (Harman et al., 2004). La respuesta de la planta incluye la secreción de
peroxidasas, síntesis de fitoalexinas (Howell et al., 2000), expresión de genes que codifican
proteínas PR (relacionadas con la patogénesis: proteínas producidas por la planta como respuesta a
patógenos y heridas), biosíntesis de compuestos terpénicos (Howell, 2006), o la modificación de los
niveles de ácido jasmónico, etileno y ácido salicílico (Shoresh et al., 2005; Djonovic et al., 2007;
Segarra et al., 2007; Morán-Diez et al., 2012).
Además, varios trabajos han demostrado el “priming” de Trichoderma en ausencia de
patógeno, es decir, estimular a la planta para responder de forma más rápida y más intensa frente al
ataque de un patógeno (Conrath et al., 2002; Tucci et al., 2011; Malmierca et al., 2012).
3.-EL ÁCIDO SALICÍLICO (SA).
El ácido salicílico es una molécula señal que induce mecanismos de defensa en las plantas
frente a gran variedad de patógenos (Yalpani & Raskin, 1993; Klessig et al., 2000; Shah, 2003;
Halim et al., 2006; Vlot et al., 2009). Este compuesto se sintetiza a partir del corismato, un producto
final de la ruta del shikimato, a través de dos rutas diferentes (Dempsey et al., 2011) (Figura 2):
1.
Ruta PAL:
El corismato pasa a ácido prefénico a través de la enzima corismato mutasa (CM) para
posteriormente transformarse en fenilalanina (Phe), que se convertirá en ácido trans-cinámico
(t-CA) por la acción de la fenilalanina amonio liasa (PAL). A partir de este punto la ruta puede
4
INTRODUCCIÓN
seguir cuatro caminos diferentes, dependientes de cada especie de planta, que culminarán con
la formación del SA (Chong J, 2001; Tamaoki M, 2008; Dempsey et al., 2011; Hara 2012).
2.
Ruta IC:
Esta ruta ocurre en los cloroplastos de las plantas. En ella, el corismato se transforma en
isocorismato a través de la enzima isocorismato sintasa (ICS) (Dempsey et al., 2011). La ICS1
se une con una gran afinidad al corismato, activándose para, posteriormente, ser importada al
estroma del cloroplasto (Strawn et al., 2007). Esta afinidad es suficiente para permitir a ICS1
competir con otras enzimas inducidas por patógenos que también utilizan el corismato como
sustrato. Por último, el isocorismato a través de la isocorismato piruvato liasa (IPL), se
convertirá en SA y piruvato (Dempsey et al., 2011; Hara 2012).
Figura 2: Ruta biosintética del ácido salicílico en plantas. CM, corismato mutasa; BA2H, ácido
benzoico 2-hidrolasa; ICS, isocorismato sintasa; IPL, isocorismato piruvato liasa. (Adaptado de
Dempsey et al., 2011).
5
INTRODUCCIÓN
El SA, al igual que otras hormonas, va a sufrir modificaciones como glucosilación,
metilación o conjugación con aminoácidos, procesos que van a controlar tanto espacial como
temporalmente la disponibilidad de la forma activa de la hormona.
El papel del SA como hormona de defensa es totalmente necesario en la respuesta de la
planta frente a diferentes estreses (abióticos y bióticos). Es crucial para desencadenar la muerte
celular producida por la respuesta hipersensible (HR), lo cual frecuentemente va acompañado de la
inducción en la planta de la respuesta sistémica adquirida (SAR). Además, la aplicación exógena de
la hormona es capaz de inducir la expresión de genes que codifican proteínas PR (Chen, 1995).
3.1.- Relación del SA con otras hormonas.
Las hormonas vegetales tienen un papel fundamental en el crecimiento y desarrollo de la
planta, teniendo efectos en su fisiología, incluso en los tejidos diferenciados.
La resistencia de la planta frente a patógenos está controlado por dos rutas principales, que
al mismo tiempo son antagonistas; mientras que el SA promueve la resistencia frente a patógenos
biotrofos, el ácido jasmónico (JA) junto con el etileno (ET) lo hace frente a patógenos necrotrofos.
Se sabe que, las auxinas y citoquininas inducen la ruta de resistencia frente a patógenos necrotrofos
(JA/ET), mientras que, las giberelinas (GAs) realizan el efecto contrario, induciendo la ruta de
resistencia frente a patógenos biotrofos (SA) (Robert-Seilaniantz et al., 2007) (Figura 3).
Adicionalmente, las GAs, inducen la síntesis de SA durante las primeras horas del crecimiento post
germinativo, teniendo un papel muy importante en la respuesta de las plantas a diferentes
situaciones de estrés abiótico (Alonso-Ramírez et al., 2009).
El papel del ABA en este sentido es más complicado, ya que parece que actúa como
regulador negativo de las rutas de defensa de la planta, sin embargo, es muy importante en la
respuesta frente a estreses abióticos. Lo que parece indicar, que la planta prioriza su respuesta hacia
los estreses abióticos (Robert-Seilaniantz et al., 2007) (Figura 3).
Por último, los brasinoesteroides, parece que promueven la resistencia frente a patógenos
biotrofos de un modo independiente de SA (Robert-Seilaniantz et al., 2007) (Figura 3).
6
INTRODUCCIÓN
Figura 3: Posible modelo de interacción entre las diferentes rutas de señalización
hormonal. SA, ácido salicílico; JA, ácido jasmónico; ET, etileno; CKs, citoquininas; GAs,
giberelinas; ABA, ácido abscísico; BRs, brasinoesteroides. (Adaptado de Robert-Seilaniantz et al.,
2007).
3.2.- Papel del SA frente a la colonización por hongos.
Como ya se ha comentado anteriormente, la interacción del hongo Trichoderma con las
raíces de la planta provoca en ésta una serie de cambios metabólicos que estimularán el crecimiento
y desarrollo, las defensas frente a patógenos y la tolerancia a estreses abióticos (Harman et al.,
2004; Shoresh et al., 2010; Lorito et al., 2010). La penetración de las hifas del hongo en la raíz
alcanzan únicamente las capas externas de ésta sin llegar a penetrar en el haz vascular. Además de
la única presencia del hongo en la epidermis, cabe destacar que la penetración del hongo se limita al
apoplasto, como consecuencia de la deposición de lignina y/o de glucano (Yedidia et al., 2000;
Chacón et al., 2007) (Figura 4).
7
INTRODUCCIÓN
Figura 4: Vista a microscopio confocal de la colonización de raíces de tomate por T.
harzianum GFP22. La fluorescencia en verde causada por la expresión de GFP indica la presencia
del hongo, mientras que la fluorescencia roja causada por el yoduro de propidio muestra las células
vegetales. (A) Las hifas han entrado en las raíces y colonizado el espacio intercelular de la
epidermis 10 horas después de la inoculación del hongo en plantas de 3 semanas. (B) Las hifas han
crecido entre las células de la epidermis y están rodeadas por paredes celulares de la planta. (C) En
algunos casos, las hifas mostraban en su extremo una punta hinchada, que fue identificada como
una vesícula no septada. (D) Tras 24 horas de la inoculación se observa una amplia colonización de
la superficie de la raíz por parte del hongo. (Adaptado de Chacón et al., 2007).
El reconocimiento entre la planta y sus invasores implica numerosas respuestas moleculares.
Un estudio pionero demostró que la colonización de la raíz de la planta por parte de Trichoderma
iba a acompañada de la elicitación de respuestas sistémicas (De Meyer et al., 1998); posteriormente
estas respuestas se relacionaron con la inducción de genes de defensa a través de las rutas del ácido
jasmónico (JA) y del etileno (Yedidia et al., 2003; Shoresh et al., 2005; Korolev et al., 2008).
Numerosos estudios han puesto de manifiesto que este hongo beneficioso es capaz de activar las
defensas tanto a nivel local (Brotman et al., 2008) como sistémico (Van Wees et al., 2008; MoránDiez et al., 2009; Soresh et al., 2010), incluso durante periodos de tiempo relativamente largos
(Tucci et al., 2011), lo que sugiere que se puede producir tanto un retraso como un solapamiento en
la expresión de genes relacionados con las diferentes rutas defensivas de la planta (Salas-Marina et
al., 2011). Por tanto, parece que Trichoderma sería percibido como hostil por parte de la planta y la
activación de las defensas de la planta limitaría la penetración del hongo a las capas celulares más
externas de la raíz. Recientes estudios transcriptómicos (Morán-Diez et al., 2012; Brotman et al.,
2013) han demostrado que durante las primeras horas de interacción entre el hongo y la planta se
produce una amplia reprogramación genética, precedida por un descenso transitorio de la respuesta
inmune de la planta, lo que probablemente permite la colonización de la raíz.
8
INTRODUCCIÓN
También hay evidencias de que por parte de microorganismos beneficiosos es necesario
evadir, al menos parcialmente, las respuestas defensivas de la planta para establecer una asociación
mutualista, de manera similar a lo que ocurre cuando los patógenos atacan a sus hospedadores
(Zamioudis & Pieterse, 2012). El SA juega un papel fundamental en las respuestas de las plantas
frente a patógenos biotrofos, que normalmente viven en los espacios intercelulares (Glazebrook,
2005), aunque se necesita una acumulación transitoria durante las primeras fases de la colonización
de la raíz por parte del microorganismo beneficioso (Herrera-Medina et al., 2003). Por ejemplo, se
ha comprobado que para que ocurra la asociación entre micorrizas y plantas se necesita una
supresión de la respuestas dependientes de SA (Pozo & Azcón-Aguilar, 2007; López-Ráez et al.,
2010). Resultados similares también se han descrito durante la interacción entre Piriformospora
indica y Arabidopsis (Jacobs et al., 2011), asi como para asociación entre Rhizobium y leguminosas
(Peleg-Grossman et al., 2009; Stacey et al., 2006).
4.- HIPÓTESIS DE PARTIDA Y OBJETIVOS.
La interacción entre el hongo beneficioso Trichoderma harzianum y la planta implica el
reconocimiento molecular de los dos individuos a través de la interacción entre diferentes rutas de
señalización. Este proceso conlleva la capacidad del hongo para adherirse a la raíz y penetrar en el
interior de sus células, además de ser capaz de resistir la toxicidad de diferentes metabolitos
defensivos producidos por la planta en respuesta a esta invasión. Los organismos beneficiosos
tienen que ser capaces de minimizar la estimulación de las respuestas defensivas de las plantas para
establecer esta asociación mutualista. Por su parte, la planta tiene que reconocer al microorganismo
invasor, bien para limitar su penetración o bien para permitir esta asociación. Aunque Trichoderma
no es un organismo patógeno para las plantas, debe sintetizar moléculas señalizadoras, que, al
menos en parte, deben ser similares a las producidas por microorganismos patógenos, lo que
explicaría por qué en ambos casos las respuestas iniciales son similares, aunque la respuesta final es
completamente diferente, provocando en un caso la respuesta inmune de la planta y en el otro la
simbiosis. En un análisis transcriptómico previo realizado por nuestro grupo de investigación se
observó que durante las primeras horas de la interacción se produce un descenso en las defensas
mediadas por ácido salicílico (SA), una de las hormonas claves en las respuestas defensivas de las
plantas, que a tiempos más largos se restablecían. Estos datos sugieren que esta bajada de defensas
permitiría y limitaría la penetración del hongo en la capa de células más externas de la raíz.
Para confirmar esta hipótesis, en este trabajo hemos realizado un análisis al microscopio
confocal de la interacción de un transformante de este hongo que sobreexpresa el gen de la proteína
9
INTRODUCCIÓN
verde fluorescente (GFP) con una variedad mutante de Arabidopsis (mutante sid2) incapaz de
sintetizar SA. Al mismo tiempo hemos observado al microscopio óptico la deposición de calosa,
que es una de las primeras y principales barreras defensivas de la planta así como el grado de
colonización de la raíz por parte del hongo y también hemos analizado los niveles de expresión de
diferentes genes de defensa de la planta.
5.- JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO.
Desde un punto de vista de la agricultura sostenible es necesario el uso de estrategias más
respetuosas con el medio ambiente con el objetivo de reducir el uso de pesticidas. Por ello, el uso de
agentes de control biológico como rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal o especies
fúngicas como micorrizas o Trichoderma spp se ha convertido en una excelente aproximación para
conseguir estos objetivos.
Trichoderma es un género fúngico que incluye especies con un gran impacto en la
agricultura debido a su capacidad para antagonizar otros hongos (biocontrol) y producir otra serie
de efectos beneficiosos para las plantas, los cuales se producen tras la colonización de la raíz de
manera endofítica por este hongo beneficioso en los tejidos más externos de las células de la raíz;
sin embargo, se sabe muy poco sobre cómo se produce esta interacción.
El entendimiento de cómo se produce esta interacción permitirá seguir profundizando en el
conocimiento de por qué este hongo produce respuestas beneficiosas para las plantas con sus
posibles aplicaciones en el campo de la agricultura.
10
MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES Y MÉTODOS
1.- MATERIAL BIOLÓGICO UTILIZADO.
1.1.- Semillas.
En la realización de este trabajo se han empleado semillas de la especie Arabidopsis
thaliana ecotipo Columbia (Col-0), que forma parte de la colección Arabidopsis Information
Service.
1.2.- Microorganismos.
Para el presente trabajo se ha utilizado la cepa Trichoderma harzianum T34, CECT 2413
(Colección Española de Cultivos Tipo, Valencia, España).
Para los análisis de microscopia confocal se utilizó una cepa de T. harzianum que expresaba
el gen GFP (proteína verde fluorescente) de Aquarea victoria, cedida amablemente por la Dra. T.
Benítez (Universidad de Sevilla), (Chacón et al., 2007).
2.- CONDICIONES DE GERMINACIÓN.
2.1.- Siembra de semillas.
Las semillas de A. thaliana fueron esterilizadas y lavadas superficialmente, antes de ser
sembradas en medio MS, tal y como describe Rubio et al. (2012), cuyo proceso se desarrolla más
exhaustivamente en el documento “Materiales y métodos” del Anexo.
En los ensayos realizados tanto para la observación en el microscopio confocal (Apartado 8)
como para los análisis de PCR a tiempo real (Apartado 6.6) la siembra se llevó a cabo en cajas
Phytatray II (Sigma), en cuyo interior se colocó una lámina de acero inoxidable junto con una gasa
estéril, se añadieron 50 ml de MS líquido y se depositaron 200 semillas. Finalmente, las cajas se
precintaron con esparadrapo quirúrgico Micropore Scotch 3M, y se colocaron en agitación (90 rpm)
en una cámara de luz con las mismas condiciones mencionadas anteriormente.
2.2.-Obtención de plántulas.
Las plántulas de A. thaliana, que habían sido germinadas in vitro en medio sólido MS
durante 10-12 días, se pasaron a alveolos para su crecimiento en suelo, que contenía tierra (Sustrato
profesional, TREF) y vermiculita exfoliada (TERMITA) en la proporción 3:1.
Las bandejas de alveolos estuvieron sometidas a irrigación continua para mantener un nivel
de humedad adecuado. Cada alveolo se destinó al cultivo de una sola planta, que había sido
11
MATERIALES Y MÉTODOS
trasplantada desde una placa Petri en la que había permanecido durante los primeros días de su ciclo
de vida. Las plántulas completaron su desarrollo en invernadero, manteniéndose cubiertas con
plástico durante los 3-4 primeros días con el fin de mantener niveles altos de humedad.
3.-MANIPULACIÓN DE Trichoderma harzianum.
3.1.- Medios de cultivo.
Los distintos tipos de medios empleados en la propagación de las cepas de T. harzianum
fueron los siguientes:
 Patata Dextrosa Agar (PDA): (Sigma). Presentación en polvo, se resuspendieron 39 g
en 1 L de agua destilada.
 Caldo de Patata Dextrosa (Potato Dextrose Broth, PDB): (Sigma). Presentación en
polvo, se resuspendieron 324 g en 1 L de agua destilada.
Todos los medios se esterilizaron en autoclave a 121ºC y 1 atm, durante 15-20 min,
manteniéndolos a 4ºC hasta su utilización.
3.2.- Cultivo de Trichoderma harzianum.
3.2.1.- Recogida de esporas.
Para la obtención de esporas, Trichoderma se cultivó en medio PDA a 25-30ºC durante 7
días, tiempo suficiente para que la superficie de la placa estuviera cubierta de esporas. Éstas fueron
recogidas añadiendo 5 ml de agua destilada estéril por placa y raspando la superficie de la misma
con la propia punta de la pipeta. A continuación, se filtró la suspensión de esporas a través de un
eppendorf con lana de vidrio para eliminar restos de micelio. Las esporas se almacenaron a 4ºC
hasta su posterior uso.
3.2.2.- Cultivo para la obtención de micelio.
Se utilizaron matraces de 1 litro que contenían 400 ml de medio PDB, inoculados con
esporas de Trichoderma a una concentración final de 106 esporas/ml, que se incubaron a 28ºC
durante 48 h y en agitación (250 rpm). La biomasa obtenida se recogió mediante filtración por vacío
a través de papel de filtro. El micelio se lavó con agua destilada estéril y se utilizó inmediatamente
(Apartado 6.1.2).
12
MATERIALES Y MÉTODOS
4.- CONSERVACIÓN DE CEPAS.
4.1.- Hongos filamentosos.
La conservación de las cepas de T. harzianum se llevó a cabo con resiembras en placas Petri
con medio PDA. Método descrito en mayor profundidad en el documento “Materiales y métodos”
del Anexo.
4.2.- Plantas.
Las semillas de A. thaliana se mantuvieron a temperatura ambiente en tubos eppendorf,
hasta su posterior uso.
5.- INOCULACIÓN E INFECCIÓN DE PLANTAS CON Trichoderma harzianum.
Para la inoculación de las plantas con T. harzianum se midió la concentración de esporas
obtenidas por conteo en cámara de Thoma.
Cada planta de A. thaliana en tierra fue inoculada con 1 ml de solución de esporas a una
concentración de 2×107 esporas/ml. La solución se inoculó introduciendo la pipeta en la tierra y
procurando soltar las esporas lo más cerca posible de la raíz principal.
Para la inoculación de las plántulas obtenidas en las cajas Phytatray II se utilizó micelio de
T. harzianum (Apartado 3.2.1.2).
6.- ANÁLISIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS.
6.1.- Extracción de DNA genómico.
La obtención de DNA genómico de A. thaliana se realizó utilizando el kit “DNA from Plant
Tissue (Mini)” (Quiagen) siguiendo el protocolo suministrado por el proveedor, tal y como
describen Alonso-Ramírez et al. (2009), cuyo método se desarrolla más exhaustivamente en el
documento “Materiales y métodos” del Anexo. El material de partida fueron 100 mg de tejido
vegetal que se homogeneizaron con nitrógeno líquido.
6.2.- Extracción de RNA total.
Para la extracción de RNA de plántulas de A. thaliana se utilizó el preparado “TRI
Reageant®” (Ambión), siguiendo las instrucciones del suministrador, de igual manera a lo descrito
por Morán-Díaz et al., (2012), cuyo método se desarrolla más exhaustivamente en el documento
“Materiales y métodos” del Anexo. El material de partida para la extracción fueron plántulas
crecidas durante 21 días en tierra e infectadas con Trichoderma 3 días antes de la recogida del
13
MATERIALES Y MÉTODOS
material. Se utilizaron 100 mg de tejido congelado en nitrógeno líquido, que se disgregó en un tubo
eppendorf utilizando una varilla estéril.
6.3.-Cuantificación de ácidos nucleicos.
La determinación de las concentraciones de ácidos nucleicos presentes en las diferentes
muestras se realizó utilizando un espectrómetro ultrasensible de medición de ácidos nucleicos
(Nanodrop Technologies Inc.), que a través de un programa informático, proporciona los ng/μl de
DNA o RNA presentes en la muestra.
6.4.- Obtención de cDNA: Transcriptasa inversa.
Para la síntesis de la primera cadena de cDNA a partir de RNA se empleó el kit comercial de
TAKARA PrimeScriptTM RT reagent Kit, tal y como describen Alonso-Ramírez et al. (2009), y
cuyo método es descrito más exhaustivamente en el documento “Materiales y métodos” del Anexo.
6.5.- Electroforesis de ácidos nucleicos.
El análisis de los fragmentos de DNA y RNA obtenidos, se realizó por electroforesis en
geles de agarosa a una concentración 1% (w/v). En la preparación de los geles y el desarrollo de
las electroforesis se siguieron los procedimientos convencionales descritos por Sambrook &
Russel (2001), los cuales se desarrollan con mayor profundidad en el documento “Materiales y
métodos” del Anexo.
6.6.- Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
6.6.1.- PCR a tiempo real (Real-time PCR).
La PCR a tiempo real de las muestras de DNA se llevó a cabo utilizando la química Brilliant
SYBR Green QPCR Master Mix (Roche), y el equipo StepOne PlusTM (Applied Biosystems), tal y
como describen Morán-Díez et al. (2012), y cuyo proceso se detalla más exhaustivamente en el
documento “Materiales y métodos” del Anexo.
Las condiciones de amplificación consistieron en un ciclo inicial de desnaturalización a
95ºC durante 10 min, seguido de 40 ciclos que incluían: 15 seg a 95ºC (desnaturalización), 30 seg a
la temperatura establecida empíricamente para cada par de oligonucleótidos (anillamiento). Se
realizó una medida continua de la fluorescencia emitida en un rango de 60-95ºC aumentando la
temperatura 0,2ºC por seg. Finalmente las muestras se mantuvieron a 4ºC.
14
MATERIALES Y MÉTODOS
Se determinaron los crossing points (CP) para cada transcrito, la eficacia de la Real-time
PCR y el nivel (ratio) de expresión relativa de los genes, tal y como describe Pfaffl (2001), cuyo
método es descrito en mayor profundidad en el documento “Materiales y métodos” del Anexo.
6.6.3.- Oligonucleótidos utilizados.
Los oligonucleótidos utilizados en este trabajo fueron suministrados por Sigma Life Science,
y se recogen en la Tabla 1.
Nombre
Secuencia
Act-Ara-F
CTCCCGCTATGTATGTCGCC
Act-Ara-R
TTGGCACAGTGTGAGACACAC
Lox1-F
GTAAGCTCTGATGTTACTGATTC
Lox1-R
CTGCGGTTAACGACGTGATTG
CallS5-F
CTTTGCTGGTTTCAACTCAACTC
CallS5-R
AATGTTTGCTCTCCGTTTCC
Pr1-F
GGCTAACTACAACTACGCTG
Pr1-R
GGCTCTGGTTCACATAATTC
Ics1-F
GATCTAGCTAACGAGAACGG
Ics1-R
CATTAAACTCAACCTGAGGGAC
Act-Tri-F
ATGGTATGGGTCAGAAGGA
Act-Tri-R
ATGTCAACACGAGCAATGG
Tabla 1: Oligonucleótidos utilizados.
6.6.4.- Diseño de oligonucleótidos.
El diseño de oligonucleótidos se llevó a cabo con el programa PearlPrimer. La búsqueda de
marcos de lectura abierta (Open Reading Frames, ORFs) sobre las secuencias de DNA se realizó
mediante el programa EditSeq, que forma parte del paquete informático Lasergene (DNASTAR
INC., Madison, EE.UU.).
7.- OBRTENCIÓN DE MUTANTES DE DE T-DNA.
Para evaluar el papel del gen Ics1 (Isocorismato sintasa 1) se utilizó el mutante de inserción
de T-DNA, At1g74710 (SALK_088254), denominado sid2 (Salicylic Acid Induction Deficient 2),
cedido amablemente por la Dra. García-Agustin (Universidad Jaime I, Castellón), que es incapaz de
sintetizar ácido salicílico.
15
MATERIALES Y MÉTODOS
Trabajos previos en el laboratorio chequearon el mutante con los oligonucleótidos
específicos del gen.
8.- MICROSCOPÍA CONFOCAL DE BARRIDO.
Las raíces de las plántulas de Arabidopsis que estuvieron en contacto con Trichoderma
durante 3 días en las cajas Phytatray (Apartado 5.1) se visualizaron en el microscopio confocal
Leica SP5. Para ello, se cortaron las raíces, se lavaron bien con agua destilada estéril para eliminar
todo el hongo externo y se montaron en portaobjetos. Las muestras se guardaron a -20ºC hasta su
uso. La longitud de onda de excitación utilizada fue de 488 nm (láser argón/criptón) y las longitudes
de onda de emisión fueron de 500-550 nm. Las imágenes se visualizaron con un objetivo de 40x y
fueron procesadas por el software de Leica LSM Image Browser.
9.- LOCALIZACIÓN DE CALOSA EN CORTES HISTOLÓGICOS.
Para la localización de los depósitos de calosa, se realizaron cortes histológicos de raíces
de plántulas de Arabidopsis, previamente fijados e incluidos en paraplast, tal y como describen Clay
et al. (2009), y cuyo método se describe más exhaustivamente en el documento “Materiales y
métodos” del Anexo.
La tinción de los cortes histológicos se realizó cubriendo los portas con unas gotas de una
solución de azul de anilina (Sigma) al 0,005% en H2O durante 2 min. A continuación se retiró el
exceso de colorante, y se procedió a una deshidratación de los tejidos mediante dos lavados con
etanol 70% y 90% durante 3 min, un lavado en etanol absoluto durante 4 min y un lavado en xilol
100% durante 5 min. Finalmente, los cortes se montaron utilizando la solución de montaje Entellan
(Merck, Alemania), dejándose secar un par de horas antes de su visualización.
Para la observación y fotografía de los cortes se utilizó un microscopio DMLS2 (Leica,
Alemania), equipado con una cámara Canon Power Shot S50.
10.- ANÁLISIS Y PRESENTACIÓN DE DATOS.
10.1.- Análisis informático.
Las secuencias de nucleótidos obtenidas fueron visualizadas mediante la aplicación
EditView (ABI PRISM™; Perkin Elmer), y se analizaron por comparación con la base de datos
GENEMBL (http://www2.ebi.ac.uk/fasta 3), que engloba a las bases de datos GenBank, EMBL
16
MATERIALES Y MÉTODOS
(general) y EPLN (específica de plantas) y utiliza el programa FASTA (Pearson & Lipman,
1988) de comparación de secuencias.
10.2.- Presentación de datos.
Las representaciones gráficas se han realizado, con las aplicaciones Cricket Graph 1.3.2
(Cricket Software) y Microsoft Excel XP para hojas de cálculo y realización de gráficas.
En el CD adjunto al trabajo se han añadido dos versiones en pdf más detalladas, tanto de
Materiales y Métodos como de la Bibliografía (Carpeta: Anexo), por supuesto junto con el pdf
correspondiente al trabajo original presentado.
A lo largo de toda la memoria, las referencias en el texto se ordenan cronológicamente,
siguiéndose un orden alfabético para autores de artículos publicados en el mismo año.
Las abreviaturas empleadas en esta memoria para referirse a unidades de medida se
corresponden con las del Sistema Internacional. Se ha procurado aplicar la normativa de la
IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) en lo referente a la formulación
química y a las denominaciones de los compuestos empleados en este trabajo.
17
RESULTADOS
RESULTADOS
Uno de los principales objetivos de este trabajo es analizar el papel del SA en la interacción
Trichoderma-raíz y tratar de averiguar por qué el hongo es incapaz de penetrar hasta el tejido
vascular, limitándose a las capas más externas de la raíz.
Para ello hemos utilizado un
transformante de Trichoderma harzianum que expresa GFP y un mutante de A. thaliana (sid2),
incapaz de sintetizar SA debido a un defecto en la enzima isocorismato sintasa 1. La observación de
la interacción hongo-planta al microscopio confocal, el estudio de la acumulación de calosa, así
como los cambios en la expresión de diferentes genes relacionados con defensa nos ayudaron a
comprender el papel del SA en el proceso.
1.- COLONIZACIÓN DE LA RAÍZ POR Trichoderma harzianum.
Figura 5: Análisis por microscopía confocal de raíces de plantas de Arabidopsis thaliana de 17
días en cultivo hidropónico 72 h tras la inoculación con Trichoderma harzianum GFP22. (A, B
y C) Ecotipo Col-0. (D, E y F) Mutante sid2 deficiente en SA. (A y D) Microscopía confocal. (B y
E) Campo claro. (C y F) Ambas microscopías superpuestas. La flecha señala al haz vascular.
18
RESULTADOS
Como se observa en la figura 5, después de tres días de interacción, Trichoderma es capaz
de penetrar en las capas más externas de la raíz de Arabidopsis, como ya habían descrito Yedidia et
al., (1999). En el caso del ecotipo silvestre (Col-0), Trichoderma ha sufrido cambios morfológicos,
pasando a formar estructuras levaduriformes, que se quedan en las capas más superficiales de la raíz
(Figura 5). Sin embargo, en el mutante sid2 de Arabidopsis el hongo es capaz de penetrar en el
tejido vascular (Figura 5).
Para analizar con mayor profundidad la colonización de las raíces de Arabidopsis por parte
de Trichoderma se hicieron ensayos de PCR a tiempo real, utilizando los genes endógenos de
actina correspondientes para cada uno de los organismos. En la figura 6, se observa como en el
mutante sid2 los niveles de actina de Trichoderma son 10 veces más elevados que en el control, lo
cual nos indica que se está produciendo más colonización, y nos sugiere la importancia del SA en
este proceso.
Figura 6: Cuantificación de Trichoderma harzianum GFP22 en las raíces de Arabidopsis
thaliana de Col-0 y mutante sid2 por PCR en tiempo real. Las barras representan desviaciones
estándar de los valores medios de tres repeticiones biológicas. El asterisco indica diferencias
significativas (p≤ 0.05) entre el ecotipo Silvestre y el mutante sid2.
Para tener más información acerca del papel del SA en la colonización, se observó la
acumulación de calosa, una de las primeras y principales barreras defensivas de la planta, tanto en el
mutante sid2 como en el ecotipo silvestre después de la interacción con Trichoderma; para ello las
raíces recogidas se incluyeron en parafina, y los cortes obtenidos se tiñeron con una solución de
azul de anilina (Materiales y Métodos Apdo. 9). Se observó que mientras en el mutante sid2 la
19
RESULTADOS
presencia de calosa es prácticamente indetectable, en el tipo silvestre podía observarse claramente
tanto en células epidérmicas, como en la corteza y el haz vascular (Figura 7). Estos resultados
indican que este proceso es dependiente de SA y, por lo tanto, muestran el papel crucial que tiene
esta hormona en la interacción hongo-raíz.
Figura 7: Localización de calosa en plantas de Arabidopsis thaliana de 17 días en cultivo
hidropónico en Col-0 (A: sección transversal; C: sección longitudinal) y mutante sid2 (B:
sección transversal; D: sección longitudinal) después de 72 h tras la inoculación con
Trichoderma harianum GFP22. Ep: epidermis; p: parénquima; vt: tejido vascular; co: corteza.
Barra = 200 µm.
20
RESULTADOS
2.- EXRESIÓN DE LOS GENES DE DEFENSA
Una vez observado que T. harzianum era capaz de colonizar el tejido vascular de la raíz del
mutante en sid2 de Arabidopsis, y que el nivel de penetración en las raíces fue significativamente
mayor en comparación con las plantas del ecotipo silvestre, se analizaron en ambas interacciones
los niveles de expresión de diferentes genes de defensa relacionados con las respuestas a JA o SA
(Figura 8). De esta manera hemos podido observar que a los 3 días tras la inoculación de Col-0 con
T. harzianum GFP22 ocurre una activación en las plantas de los genes Lox1, PR-1, Ics1 y Cals5, los
cuales participan en la biosíntesis de JA, el mecanismo de acción del SA, la biosíntesis de SA y, la
biosíntesis de calosa, respectivamente.
Figura 8: RT-PCR de los genes Lox1, PR-1, Ics1 y Cals5 en raíces de Arabidopsis Col-0 y
mutante sid2 colonizadas, o no, con Trichoderma harzianum GFP22. Los valores corresponden a
las mediciones relativas frente a Arabidopsis sin T34 (2-CT = 1). Como gen de referencia interna
se utilizó el gen de Actina de Arabidopsis. Las barras representan desviaciones estándar de los
valores medios de tres repeticiones biológicas. El asterisco indica diferencias significativas (p≤
0.05) entre el ecotipo Silvestre y el mutante sid2.
En el caso del mutante deficiente en SA, tras la colonización de la raíz por T. harzianum,
aumentó de forma más significativa la expresión de los genes Lox1 e Ics1. Dado que el mutante
sid2 es incapaz de sintetizar SA este aumento en los niveles de expresión de Ics1 indican que la
planta intenta producir SA en respuesta a la colonización de las raíces por Trichoderma, pero que
finalmente, y debido a la mutación, la proteína correspondiente no se sintetiza y el SA no es
21
RESULTADOS
producido. Por el contrario, se observó una inhibición en la expresión de PR-1 y Cals5, ambos,
genes de respuesta al SA.
3.- EFECTO DE Trichoderma harzianum GFP22 EN EL CRECIMIENTO Y DESARROLLO
DE Arabidopsis
Los resultados del ensayo in vivo mostraron claramente que hay diferencias significativas
entre las plantas de Arabidopsis Col-0 y sid2, tratadas o no con el hongo (Figura 9). La altura de las
plantas del ecotipo silvestre Col-0 que habían sido tratadas con T. harzianum GFP22, era 10 veces
mayor que el de su correspondiente control (6,58 ± 1,2 cm y 0,65 ± 0,19 cm, respectivamente).
Además, el tratamiento con Trichoderma ejerce un efecto de precocidad en las plantas Col-0,
acelerando la floración, como puede observarse en la figura 9C (primordios florales). Por el
contrario, el tratamiento del mutante sid2 con GFP22 ejerce un efecto perjudicial en la altura de la
planta (0,38 ± 0,09 cm y 0,23 ± 0,05 cm, respectivamente), llegando incluso a producir su muerte.
A
B
C
D
Figura 9: Efecto del tratamiento de Arabidopsis Col-0 y sid2 con Trichoderma harzianum
GFP22, en un ensayo in vivo. Las plantas de Arabidopsis fueron inoculadas con 17 días, con agua
(A, Col-0; B, sid2) o con T. harzianum GFP22 (C, Col-0; D, sid2). Las fotografías fueron tomadas
7 días tras la inoculación.
22
DISCUSIÓN
DISCUSIÓN
El establecimiento de asociaciones beneficiosas entre plantas y microorganismos requiere el
reconocimiento de ambos y un alto grado de coordinación entre ellos. Un estudio reciente ha puesto
de manifiesto que el micoparasitismo fue el estilo de vida ancestral de este hongo (Kubicek et al.,
2011), que posteriormente colonizó las raíces de las plantas terrestres (Druzhinina et al., 2011),
debido a la gran cantidad de patógenos y de compuestos secretados por las raíces de las plantas,
como monosacáridos y disacáridos, que permitían el crecimiento de este hongo en la rizosfera
(Vargas et al., 2009; Rubio et al., 2012). Por tanto, el proceso de colonización requiere el
reconocimiento y la capacidad para adherirse a las raíces, la penetración en la planta, y tolerar los
metabolitos tóxicos que produce la planta en respuesta a la invasión (Hermosa et al., 2012).
Trabajos recientes indican que para que se produzca esta interacción, es necesario que se
produzca una supresión parcial de las defensas de la planta (Morán-Díez et al., 2012; Brotman et al.,
2013), al igual que se ha observado en otras asociaciones beneficiosas entre plantas y
microorganismos (Herrera-Medina et al., 2003; López-Ráez et al., 2010; Jacobs et al., 2011).
Teniendo en cuenta estos antecedentes, así como resultados previos de nuestro grupo de
investigación (Morán-Diez et al., 2012), que mostraban que se producía un descenso en los niveles
de expresión de genes de defensa regulados por SA, tanto a nivel local como sistémico, el objetivo
de este trabajo consistía en profundizar en el papel de esta hormona en la interacción Trichodermaplanta. Para ello hemos utilizado una cepa de Trichoderma (GFP22) que sobreexpresa la proteína
verde fluorescente (GFP) y hemos analizado este proceso de interacción, en cultivo hidropónico, en
plantas de Arabidopsis de tipo silvestre (ecotipo Col-0) y un mutante afectado en la síntesis de SA
(sid2). Como era de esperar, la cepa GFP22 es capaz de penetrar en la capa de células más externas
de la raíz (epidermis y cortex), de manera similar a lo observado en trabajos previos realizados en
pepino y tomate (Yedidia et al., 1999; Chacón et al., 2007; Velázquez-Robledo et al., 2011), aunque
no se observa ningún tipo de colonización en el tejido vascular. Sin embargo, sí que se producía
colonización del tejido vascular en el mutante sid2 que, como hemos comentado anteriormente, es
incapaz de sintetizar SA; dicha invasión masiva de Trichoderma tuvo un efecto negativo en el
crecimiento de la planta y terminó por colapsarla (Figura 9). Esta diferencia en el grado de
colonización puede ser debida a las diferencias que hemos observado en los niveles de deposición
de calosa, la primera línea defensiva de la planta, lo que sugiere el importante papel que juega el SA
en el proceso de refuerzo de la pared celular y en la limitación de la colonización de Trichoderma a
las capas más externas de la raíz. Adicionalmente, cuando se utilizó una línea transgénica de
23
DISCUSIÓN
Arabidopsis que presentaba niveles muy elevados de SA endógeno (Alonso-Ramírez et al., 2009),
los depósitos de calosa eran evidentes incluso en ausencia del hongo (datos no mostrados) De una
manera similar se ha descrito que líneas de Arabidopsis incapaces de sintetizar o acumular SA
presentaban niveles muy bajos de calosa, lo que permitía la multiplicación de bacterias patógenas
(DebRoy et al., 2008). También se ha demostrado que la síntesis de calosa es necesaria para
incrementar la resistencia de las células vegetales al ataque de patógenos (Ellinger et al., 2013). Por
tanto, parece claro que Trichoderma tiene que evadir las respuestas defensivas de la planta durante
las primeras fases de la interacción, aunque posteriormente una activación de estas defensas limitará
el crecimiento de este hongo impidiendo su acceso al sistema vascular. Esta hipótesis se ve
reforzada por el hecho de que el grado de colonización de la raíz por este hongo beneficioso es
mucho mayor en las líneas mutantes que en el tipo silvestre lo que apoya el importante papel del SA
en esta interacción. Este resultado coincide con trabajos recientes donde se ha observado un grado
de colonización mayor en el mutante FMO1 de Arabidopsis (afectado en el mecanismo de acción de
esta hormona) que en el correspondiente tipo silvestre tras la colonización con T. asperelloides
(Brotman et al., 2013), o en diferentes mutantes deficientes en SA tras la colonización con
Piriformospora indica (Jacobs et al., 2011).
Además de las barreras físicas, como la deposición de calosa, las plantas van a activar un
complejo sistema inmune regulado por hormonas. Se sabe que Trichoderma es capaz de activar las
rutas de señalización mediadas por JA/ET de una manera similar a la que promueven las
rizobacterias promotoras del crecimiento (PGPRs) (Shoresh et al., 2010). Aunque se ha descrito que
el SA y el JA son hormonas antagónicas (Thaler et al., 2012), se ha demostrado que este hongo es
capaz también de incrementar la acumulación de SA (Velázquez-Robledo et al., 2011), así como de
inducir respuestas defensivas en la planta dependientes tanto de JA como de SA (Woo et al., 2006;
Salas-Marina et al., 2011). Nosotros, en este trabajo, hemos observado que GFP22 induce la
expresión del gen Lox1, implicado en la biosíntesis de JA, así como del gen PR-1, implicado en el
mecanismo de acción del SA, en raíces del tipo silvestre después de 72 h de la inoculación con el
hongo. Aunque hay evidencias de que las respuestas defensivas son similares en las hojas y en las
raíces (Jacobs et al., 2011), también se ha descrito que los patógenos activan respuestas específicas
en la raíz (Millet et al., 2010), aunque se sabe muy poco sobre las respuestas inmunes de las plantas
frente a microorganismos beneficiosos en la raíz (Zamioudis & Pieterse, 2012) y particularmente
frente a Trichoderma (Brotman et al., 2013). Por tanto, en este trabajo, pretendemos incrementar el
conocimiento en el papel del SA en las respuestas defensivas locales durante la interacción
Trichoderma-planta. El incremento significativo en los niveles de expresión del gen Lox1
24
DISCUSIÓN
inducidos por GFP22 en el mutante sid2, es coherente con su incapacidad para sintetizar SA. Por
otra parte, y dado que Trichoderma es capaz también de inducir las defensas a través de la ruta del
JA (Tucci et al., 2011), el considerable crecimiento del hongo que se detecta en el mutante sid2
puede también contribuir al incremento en genes implicados en la respuesta a esta hormona. De
manera similar, en un trabajo reciente se ha comprobado que se produce un incremento en la
expresión de este tipo de genes en plantas de Arabidopsis colonizadas por T. asperelloides
(Brotman et al., 2013). También hemos observado que GFP22 induce la acumulación de calosa en
raíces de plantas del tipo silvestre, aunque el conocimiento sobre este complejo mecanismo de
defensa en respuesta al ataque de patógenos todavía es muy escaso (Luna et al., 2011). Se sabe que
la síntesis de calosa regula negativamente la ruta de señalización del SA (Nishimura et al., 2003);
sin embargo, nosotros hemos observado que tras 72 h de interacción entre GFP22 y plantas del tipo
silvestre se produce una inducción en los niveles de expresión del gen Cals5, implicado en la
biosíntesis de calosa, al mismo tiempo que se observa un incremento en los niveles de expresión de
genes implicados tanto en la biosíntesis (Ics1) como en el mecanismo de acción del SA (PR-1).
Estos datos sugieren que el SA desempeña un papel importante en la acumulación de calosa.
La inducción del gen Ics1 en las raíces del mutante sid2 colonizadas por la cepa GFP22
indican que la planta necesitaría producir SA en respuesta a T. harzianum, como ocurre en el
ecotipo Col-0. Sin embargo y debido a la inserción de T-DNA en este gen en la línea mutada, la
proteína correspondiente no sería funcional y por lo tanto la hormona no se sintetizaría.
25
CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
Teniendo en cuenta todos los resultados presentados en este trabajo, al igual que ha sido
propuesto para otros microorganismos beneficiosos (Jacobs et al., 2011), indican que Trichoderma
necesitaría suprimir, al menos parcialmente, el sistema inmune de la planta para colonizar la raíz,
minimizando por tanto las defensas del hospedador. Posteriormente, se necesitaría una reactivación
de las defensas mediadas por SA para evitar una invasión masiva de la raíz por parte del hongo,
como hemos demostrado con los diferentes ensayos de colonización de la raíz en el mutante sid2. A
pesar de que T. harzianum es un microorganismo beneficioso para la planta, es reconocido
inicialmente como un agente invasor, y hemos comprobado que el SA juega un papel clave en esta
interacción, ya que en su ausencia, la planta no es capaz de evitar la entrada del hongo en el tejido
vascular, lo que provocaría la muerte posterior de la planta, comportándose como un patógeno.
AGRADECIMIENTOS
El presente Trabajo de Fin de Grado se engloba dentro de un proyecto de investigación
financiado por la Junta de Castilla y León (SA260A11-2) y los proyectos nacionales españoles
MICINN (AGL2009-13431-C02) y MINECO (AGL2012-40041-C02-01).
26
BIBLIOGRAFÍA
BIBLIOGRAFÍA
Alonso-Ramírez A, Rodríguez D, Reyes D et al. (2009). Plant Physiol 150: 1335-44.
Altomare C, Norvell WA, Bjorkman T et al. (1999). Appl Environ Microbiol 65: 2926-2933.
Benhamou N & Chet I (1996). Phytopathology 83: 1062-1071.
Brotman Y, Briff E, Viterbo A et al. (2008). Plant Physiol 147: 779-789.
Brotman Y, Landau U, Cuadros-Inostroza A et al. (2013). PLOS Pathogen 9: e1003221.
Chacón M, Rodríguez-Galán O, Benítez T et al. (2007). Int Microbiol 10: 19-27.
Chang YC, Chang Y, Baker R et al. (1986). Plant Dis. 70: 145-148.
Chen Z, Malamy J, Henning J et al. (1995). Proc Natl Acad Sci U S A 92: 4134–4137.
Chong J, Pierrel MA, Atanassova R et al. (2001). Plant Physiology 125: 318–328.
Clay NK, Adio AM, Denoux C et al. (2009). Science 323: 95-101.
Conrath U, Pieterse CM, Mauch-Mani B (2002). Trends Plant Sci. 7: 210-216.
Contreras-Cornejo HA, Macías-Rodríguez L, Cortés-Penagos C et al. (2009). Plant Physiol.
149: 1579-1592.
Cook RJ (1997). Proceedings of the international symposium of clean agriculture 35-48.
De Meyer G, Bigirimana J, Elad Y et al. (1998). Eur. J. Plant Pathol 104: 279-286.
DebRoy S, Thilmony R, Kwack YB et al. (2004). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101: 9927-9932.
Dempsey DA, Vlot AC, Wildermuth MC et al. (2011). The Arabidopsis Book 9: e0156. doi:
10.1199/tab.0156.
Djonovic S, Vargas WA, Kolomiets MV et al. (2007). Plant Physiol 145: 875-889.
Druzhinina IS, Seidl-Seiboth V, Herrera-Estrella A et al. (2011). Nat Rev Microbiol 9: 749-759.
Ellinger D, Naumann M, Falter C et al. (2013). Plant Physiol 161: 1433-44.
Gams W, Van der Aa HA, Van der Okaats-Niterink AJ et al. (1987). CBS Course of mycology
(Centralbureau voor Schimmel cultures, Berna, Suiza).
Glazebrook J (2005). Annu Rev Phypathol 43: 205-227.
Grondona I, Morales R, Hermosa R et al. (2001). J Plant Pathol 83: 483-485.
27
BIBLIOGRAFÍA
Halim VA, Vess A, Scheel D et al. (2006). Plant Biol (Stuttg) 8: 307-13.
Hara M, Furukawa J, Sato A et al. (2012). Abiotic Stress Responses in Plants pp 235-251.
Harman GE, Howell CR, Viterbo A et al. (2004). Nature Rev Microbiol 2: 43-56.
Harman GE (2006). Overview of mechanisms and uses of Trichoderma spp. Phytopathology 96:
190-194.
Hermosa R, Keck E, Chamorro I et al. (2004). Mycol Res 108: 897-906.
Hermosa R, Viterbo A, Chet I et al. (2012). Microbiology 158: 17-25.
Herrera Medina MJ, Gagnon H et al. (2003). Plant Science 164: 993-998.
Hjeljord LG & Tronsmo A (1998). Trichoderma And Gliocladium, Volume 2: Enzymes,
Biological Control and commercial applications. (ed. Harman GE, Hubicek CP) 131-152
(Taylor & Francis Ltd., London).
Howell CR, Hanson LE, Stipanovic RD et al. (2000). Phytopathology 90: 248-252.
Howell CR (2006). Phytopathology 96: 178-180.
Inbar J & Chet I (1996). Adv Exp Med Biol. 408: 229-231.
Jacobs S, Zechmann B, Molitor A et al. (2011). Plant Physiol 156: 726-740.
Klessig DF, Durner J, Noad R et al. (2000). ProcNatlAcadSci U S A 97: 8849-55.
Korolev N, David DR, Elad Y (2008). Biocontrol 53: 667-683.
Kubicek CP, Herrera-Estrella A, Seidl-Seiboth V et al (2011). Genome Biol 12: R40.
López-Ráez JA, Verhage A, Fernández I et al. (2010). J Exp Bot 61: 2589-2601.
Lorito M, Woo SL, Harman GE et al. (2010). Annu Rev Phytopathol 48: 395-418.
Lu Z, Tombolini R, Woo S et al. (2004). Appl Environ Microbiol 70: 3073-3081.
Luna E, Pastor V, Robert J et al. (2011). Mol Plant Microbe In. 24: 183-193.
Malmierca MG, Cardoza RE, Alexander NJ et al. (2012). Appl Environ Microbiol 78: 48564868.
Mastouri F, Björkman T, Harman GE (2010). Phytopathology 100: 1213-1221.
Millet YA, Danna CH, Clay NK et al. (2010). Plant Cell 22: 973-990.
Monte E (2001). Int Microbiol 4: 1-4.
28
BIBLIOGRAFÍA
Montero-Barrientos M, Hermosa R, Cardoza RE et al. (2011). Appl Environ Microbiol 77:
3009-3016.
Moran-Diez E, Hermosa R, Ambrosino P et al. (2009). Mol Plant-Microbe Interact 22: 10211031.
Morán-Díez E, Rubio B, Domínguez S et al. (2012). J Plant Physiol 169: 614-620.
Murashige T & Skoog F (1962). Physiol Plantarum 15: 473-497.
Nishimura M T, Stein M, Hou BH et al. (2003). Science 301: 969-972.
Pearson WR & Lipman DJ (1988). Proc Natl Acad Sci U S A 85: 2444-8.
Peleg-Grossman S, Golani Y, Kaye Y et al. (2009). PLOS ONE 4: e8399.
Pfaffl MW (2001). Nucleic Acids Res 29: 2003-2007.
Pozo MJ & Azcon-Aguilar C (2007). Curr Opin Plant Biol 10: 393-398.
Robert-Seilaniantz A, Navarro L, Bari R et al. (2007). CurrOpin Plant Biol 10: 372-379.
Rocha-Ramírez V, Omero C, Chet I et al. (2002). Eukaryot Cell 1: 594-605.
Rubio MB, Domínguez S, Monte E et al. (2012). Microbiology 158: 119-128.
Sadfi-Zouaoui N, Hannachi I, Rouaissi M et al. (2009). Can J Microbiol 55: 154-162.
Salas-Marina MA, Silva-Flores MA, Uresti-Rivera EE et al. (2011). Eur J Plant Pathol 131: 1526.
Sambrook J & Russel DW (2001). Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Nueva York, EE.UU).
Samolski I, Rincón AM, Pinzón LM et al. (2012). Microbiology 158: 129-138.
Segarra G, Casanova E, Bellido D et al. (2007). Proteomics 7: 3943-3952.
Shah J (2003). Curr Opin Plant Biol 6: 365-71.
Shoresh M, Yedidia I, Chet I (2005). Phytopathology 95: 76-84.
Shoresh M, Harman GE, Mastouri F (2010). Annu Rev Phytopathol 48: 21-43.
Stacey G, McAlvin CB, Kim SY et al. (2006). Plant Physiol 141: 1473-1481.
Strawn MA, Marr SK, Inoue K et al. (2007). J Biol Chem 282: 5919-5933.
29
BIBLIOGRAFÍA
Tamaoki M (2008). Plant Signal Behav 3: 166–174.
Thaler JS, Humphrey PT, Whiteman NK (2012). Trends Plant Sci. 17: 260-270.
Tucci M, Ruocco M, De Masi L et al. (2011). Mol Plant Pathol 12: 341-54.
Van Wees SCM, Van der Ent S, Pieterse CMJ (2008). CurrOpin Plant Biol 11: 1-6.
Vargas WA, Mandawe JC, Kenerley CM (2009). Plant Physiol 151: 792-808.
Velazquez-Robledo R, Contreras-Cornejo HA, Macias-Rodriguez L et al. (2011). Mol Plant
Microbe Interact 24: 1459-71.
Viterbo A, Landau U, Kim S et al. (2010). FEMS Microbiol Lett 305: 42-48.
Vlot AC, Dempsey DA, Klessig DF (2009). Annu Rev Phytopathol 47: 177-206.
Webster J (1980). Introduction to fungi (Cambridge University Press, Cambridge, Reino Unido).
Woo SL, Scala F, Ruocco M et al. (2006). Phytopathology 96: 181-5.
Yalpani N & Raskin I (1993). Trends Microbiol 1: 88-92.
Yedidia I, Benhamou N, Chet I (1999). Appl Environ Microbiol 65: 1061-1070.
Yedidia I, Benhamou N, Kapulnik Y et al. (2000). Plant Physiol Biochem 38: 863-873.
Yedidia I, Srivastva AK, Kapulnik Y et al. (2001). Plant and Soil 235: 235-242.
Zamioudis C& Pieterse CMJ (2012). Mol Plant Microbe Interact 25: 139-150.
30