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Análisis de enterovirus en aguas superficiales
Control durante el proceso de potabilización
1.
Introducción
El agua tiene una larga historia como agente transmisor de enfermedades infecciosas, tradicionalmente
asociadas a suministros contaminados o no tratados. Sin embargo, se están acumulando muchas
pruebas de que incluso aguas potables tratadas por métodos aceptados como eficientes, pueden jugar
un papel significativo en la transmisión de microorganismos patógenos (Akin 1984, Rose y col 1986,
Bosch y col 1991, Craun 1991, Payement y col 1991, Parmelee 1993). Los datos disponibles muestran
que los virus y ciertos parásitos intestinales son los agentes implicados con más frecuencia en estas
circunstancias (Williams y Akin 1986, Bosc y col 1991, Regli y col 1991, Parmelee 1993) y ponen en
evidencia las limitaciones de los programas de control utilizados habitualmente. Los virus y los quistes de
parásitos intestinales como Giardia y Cryptosporidium difieren de los indicadores comúnmente utilizados
como indicadores de contaminación fecal, como por ejemplo las bacterias coliformes, en términos de
estructura, composición, morfología, así como en términos de resistencia, comportamiento e incidencia
en el agua. Por lo tanto no debe sorprender que los indicadores bacterianos utilizados actualmente
presenten muchas limitaciones para asegurar la ausencia de parásitos y virus. Puesto que la transmisión
de enfermedades a través del agua continúa, y en algunas situaciones incluso aumenta, en todo el
mundo, se está prestando una atención creciente al desarrollo de procesos de tratamiento de agua y a la
formulación de categorías de control y de sistemas indicadores (Grabow 1990, Regli y col 1991).
Alcanzar estos objetivos es complejo dado que, por una parte, aumenta la población humana y el
número de animales domésticos, y por otra aparecen restricciones en la aplicación de algunos
tratamientos clásicos, como por ejemplo la cloración. Aigües Ter Llobregat (ATLL) es la empresa pública
de la Generalitat de Catalunya, encargada de gestionar la captación, potabilización y distribución del
agua captada de los ríos Llobregat y Ter, este último a partir del sistema de embalses Sau-SusquedaPasteral (Figura 1).
Fig. 1. Cuencas de los ríos Ter y Llobregat. Ubicación de puntos de muestreo.
En el río Llobregat la ETAP de Abrera tiene una capacidad nominal de tratamiento de 3 m3/seg, mientras
que en la ETAP del Ter en Cardedeu es de 8 m3 /seg. Entre las dos plantas se abastecen varios
municipios de las comarcas de Barcelona y la capital, en total una población potencial de 4.5 M de
personas a través de unos 400 km de tuberías distribuidas en aproximadamente 500 km2. Dadas las
implicaciones sanitarias del abastecimiento es fundamental ampliar el conocimiento de los factores
microbiológicos que puedan afectar a la calidad del agua, más allá de los indicadores bacteriológicos
clásicos. En las dos ETAPs (Figura 2), el tratamiento se realiza mediante cloración por encima del punto
de ruptura, floculación/decantación, filtración por arena y carbón (ETAP del L1obregat) o sólo por carbón
(ETAP del Ter), postcloración-l, almacenamiento en depósitos, postcloración-2 y posterior distribución
(Valero 1996). En el presente trabajo se aporta en primer lugar información sobre los virus entéricos
{ENT) humanos, con la finalidad de resaltar su interés desde el punto de vista sanitario así como la
dificultad de su análisis. En segundo lugar, se presentan los resultados del control de ENT en las ETAPs
del Llobregat y del Ter, así como de determinados puntos de control correspondientes a los ríos que las
abastecen, para el período 1993-1996. El estudio se acompaña de análisis bacteriológicos en los
mismos puntos, con independencia del control diario realizado en las diferentes etapas correspondientes
al tratamiento en cada una de las ETAPs.
Figura 2 .Líneas de tratamiento y puntos de muestreo en las ETAPs del Llobregat y del Ter (actualmente
3
de 3 depósitos, capacidad total 265.000m
2.
Virus entéricos humanos
Una gran variedad de virus pueden ser transmitidos potencialmente por el agua y causar un elevado
número de enfermedades (Tabla 1). Los virus son muy resistentes a procesos de tratamiento y su dosis
infecciosa mínima puede ser tan baja como una sola partícula vírica (Williams y Akin 1986, Grabow
1990, Craun 1991, Regli y col 1991). Las diferencias existentes entre virus y bacterias, implican que los
indicadores clásicos como las bacterias coliformes fecales presenten muchas limitaciones como
indicadores de la presencia de virus. Por ello, el control de la calidad del agua, debería incluir
rutinariamente análisis virológicos. Sin embargo, las pruebas para la detección de virus en agua son
caras, complicadas y largas, y requieren asimismo de instalaciones relativamente sofisticadas y de
personal bastante especializado. Además, muchos de los virus implicados en enfermedades de
transmisión hídrica, como por ejemplo el virus de la hepatitis A y el virus de Norwalk, no son detectables
por las técnicas virológicas de cultivo celular convencionales. Esta complejidad de análisis relacionada
con la detección de virus presentes en agua pasa por una primera etapa de recuperación de pequeñas
cantidades de virus a partir de grandes volúmenes de agua. Para ello se han desarrollado un buen
número de técnicas de concentración, la mayoría de ellas basadas en las propiedades que comparten
virus y macromoléculas. Entre estas técnicas destacan: ultrafiltración, precipitación, floculación,
separación de fases, ultracentrifugación y adsorción. En muchos casos esta reducción de volumen no es
aún suficiente para la detección, y entonces es necesaria una reconcentración. No existe una
metodología universal para concentrar virus a partir de muestras de aguas naturales, dado que su
heterogeneidad (debida a factores como el contenido en materia orgánica, sólidos en suspensión,
concentración en sales y pH), condiciona los rendimientos de los diferentes métodos de concentración,
los cuales además varían según los virus que se quieran concentrar. No hay ni en España ni en la Unión
Europea métodos oficiales para la concentración de virus, indicados en las directivas en que se
recomienda o exige el análisis de virus (directiva 80/778/CEE para aguas de consumo; directiva
76/160/CEE para aguas de baño). Por ello a la hora de concentrar virus se escogen métodos empleados
por investigadores de prestigio. La mayoría de técnicas para aguas dulces, ya sean de río o aguas
tratadas, se basan en el principio de adsorción a un sustrato sólido y posterior elución en un volumen
mucho menor de solución eluyente (Lucena y col 1991). La reconcentración posterior puede hacerse por
diversos métodos. Uno de los más utilizados es la floculación orgánica. Todos estos procesos implican
unas pérdidas más o menos importantes de virus. Una vez se ha procedido a la concentración, hay una
etapa de eliminación de la muestra de aquellos microorganismos o productos químicos que puedan
interferir en la posterior detección de los virus, última etapa que tradicionalmente se realiza sobre un
cultivo de células perteneciente a una línea celular estable. Sin embargo, no hay ninguna línea celular
que detecte todos los tipos de virus presentes en el agua. Se utilizan, líneas celulares como la BGM, MA104 ó PLC/PRF/5 que detecten el mayor número posible de virus de origen entérico humano presentes
en el agua (Grabow 1995). La línea celular BGM recomendada en Standard Methods (APHA 1992) es la
más empleada, ya que detecta un grupo de virus que en su conjunto son un buen indicador de la calidad
virológica de una muestra de agua determinada. Por conveniencia se acostumbra a llamar "ENT" a los
virus detectados por esta línea celular. No obstante hay que señalar que la línea celular BGM no detecta
todos los ENT y en cambio detecta algunos otros virus como por ejemplo reovirus (Tabla 1), pero no
detecta algunos de los virus que mayor interés tiene como es el caso del virus de la hepatitis A y el de
Norwalk. En el caso de que se quieran identificar los virus que han crecido sobre la línea celular BGM
hay que añadir una etapa posterior de identificación.
En los últimos años se han producido grandes avances en algunas técnicas moleculares, sobre todo
aquellas relacionadas con la amplificación y reconocimiento de ácidos nucleicos víricos, que nos
permiten la detección e identificación directa de los virus presentes en agua. La más sensible y útil de
estas técnicas es la PCR (reacción en cadena de polimerasa) . Esta técnica permite la detección de virus
que no pueden ser detectados por las líneas celulares disponibles y a su vez es más sensible, más
específica y más rápida que la detección por cultivo celular. Sin embargo, tiene el inconveniente que no
permite distinguir entre virus infecciosos y no infecciosos (Puig y col 1994). Estas dificultades técnicas,
sumadas a la falta de definición sobre el riesgo sanitario ligado a la presencia de pequeñas cantidades
de virus en el agua, han impedido que, más allá de recomendaciones concretas de algunos expertos o
grupos de investigación de determinados países, existan hasta el momento normativas claras respecto a
la presencia de virus en aguas como las que existen, por ejemplo, para bacterias y substancias químicas
peligrosas.
Así como ejemplos de recomendaciones, Melnick propuso que no se aceptara más de 1 virus por
4001itros de agua de bebida (Rao and Melnick 1986), mientras que un grupo de expertos de la OMS
propuso en su momento que se considerara la necesidad de la ausencia de ENT en 100 ó 1000 litros de
agua de consumo (Anónimo 1979). Como ejemplo cercano de normativa, la legislación española relativa
a la calidad de aguas de consumo (R.D. l l38/199D, como adaptación de la legislación española a la
directiva 80/778/CEE) recomienda el análisis de ENT en aguas de consumo, para garantizar un aspecto
normativo como es la ausencia de patógenos. La mayoría de estos límites, como en su momento lo fue
el límite de coliformes, se basan fundamentalmente en los criterios de comisiones de expertos
reconocidos, que en algunos casos venían determinados por las disponibilidades técnicas de medida
(Metclaf y col 1995). Sin embargo recientemente, se han desarrollado modelos matemáticos,
posiblemente perfeccionables, que describen la relación entre el nivel de exposición a un
microorganismo infeccioso en agua de bebida y el riesgo de infección (Regli y col 1991). Así por ejemplo,
algunos de estos modelos muestran que para un riesgo de infección anual por debajo de 10-4, es decir
de menos de una infección anual por cada 10.000 habitantes, el número de virus patógenos en agua
debe ser inferior a 4500 por m3 (Regli y col 1991). Un riesgo inferior a 10-4 para Giardia y para virus ha
sido prescrito por la USEPA a través del Surface Water Treatment Rule (SWTR) (Anónimo 1989). Ello
hace necesario el análisis de grandes volúmenes de agua para determinar si un agua de bebida está por
debajo de un riesgo de infección aceptable para una sociedad occidental. Así pues, el control de la
presencia de virus en volúmenes de hasta 1.000 litros de agua de consumo es únicamente práctico para
determinar si existe un nivel de riesgo muy elevado, no para determinar si un suministro de agua de
consumo es razonablemente seguro .
Resultados de los parámetros estudiados a lo largo de la Cuenca del Llobregat
Figura 2 .Líneas de tratamiento y puntos de muestreo en las ETAPs del Llobregat y del Ter (actualmente
3
de 3 depósitos, capacidad total 265.000m
Ello hace que haya una tendencia cada vez mayor a enfocar el problema desde otra perspectiva, que
consiste en determinar la concentracion de virus en las aguas brutas y establecer unos tratamientos que
garanticen una eliminacion del virus y asi cumplir los límites preestablecidos en agua de consumo. Así
por ejemplo, en Estados Unidos, la SWTR promulgada en 1989, exige que el tratamiento de aguas
superficiales debe garantizar la eliminación de 4 unidades logarítmicas de virus del agua bruta (Anónimo
1989). Eliminaciones mayores pueden ser necesarias, dependiendo de las densidades de estos
patógenos en el agua bruta (Von Huben H 1991), De ello se deduce que para poder determinar los
tratamientos se hará necesario conocer los niveles en las aguas brutas, objetivo central de los datos
expuestos en el presente trabajo, para las ETAPs del Llobregat y del Ter.
3.
Material y métodos
3.1.
Muestreos.- Durante 1os años 1993/1996 se han efectuado controles mensuales en
diferentes puntos del tratamiento de las ETAPs del Llobregat y del Ter (Figura 2). Además,
con el fin de conocer la evolución de la contaminación en el punto de captación en ambas
plantas se ha estudiado en este caso trimestralmente y cuenca arriba del punto de captación
(Figura 1), los niveles de contaminación bacterio- lógica fecal así como los niveles de ENT.
3.2.
Ríos: cuenca del Llobregat.- En la cuenca del Llobregat se han muestreado tres puntos
trimestralmente (Figura 1): en el río Cardener en Castellgalí (a unos 29 km de la captación
de la Planta del Llobregat), y en el río Llobregat, en el Pont de Vilomara (a 32 km); después
de estos puntos se unen río y afluente a unos 28 km de la captación. El siguiente punto de
muestreo es la Presa de El Cairat, cerca de Monistrol a 12 km de la ETAP.
3.3.
Ríos: cuenca del Ter y embalses.- Se ha realizado un muestreo trimestral en los siguientes
puntos de la cuenca de río Ter (Figura 1): río Ter antes de recibir su afluente el Gurri, el río
Gurri, la entrada del embalse de Sau (Rodade Ter), la entrada del embalse de Susqueda y el
embalse del Pasteral, desde donde se deriva una conducción subterránea de 60 km. (de 2.5
m de diámetro) hacia la ETAP del Ter.
3.4.
Análisis de Virus:
3.4.1.
Volumen de agua concentrado.- En 1as muestras correspondientes a los ríos se han
concentrado 50 litros de agua. En el resto de las muestras de aguas superficiales
(embalses) se han concentrado volúmenes que varían entre 100 y 250 1 en función de la
turbidez del agua. En todas las mues tras de las ETAP del Ter y del Llobregat, excepto
en su punto de captación, se han concentrado 1.000 l de agua.
Tabla 3. Resultados de los parámetros estudiados a lo largo de la Cuenta del Ter.
3.4.2.
Método de concentración.– Se ha realizado la concentración sobre el terreno, siguiendo
la metodología estándar de adsorción/elución sobre cartuchos electropositivos - Zeta
Plus (Cuno), con un caudal de 2-3 litros/min. (Lucena y col 1991). Acabada la filtración,
el filtro se transporta inmediatamente al laboratorio en contacto con una solución de
extracto de carne al 3%, pH 7.0-7.2, refrigerado a 4 ºC. La elución se llevó a cabo con
1.000 ml de tampón glicina a pH 9.5 con un 3% de extracto de carne. Estos 1.000 ml
eluidos se reconcentraron por floculacién orgánica, (Lucena y col 1991). Se ajusta el pH
a 3.5, se agita suavemente a temperatura ambiente durante 30 minutos, centrifugándose
a 4.500 r.p.m. durante 20 minutos. El sedimento se resuspende en 50 ml de PBS
(tampón fosfatos). La descontaminación y detoxificación del concentrado final ser realizó
por mezcla con cloroformo al 30% v/v, agitación durante 30 minutos, decantación y
separación de las fases y aireación con aire filtrado (0.1 micras), para eliminar los restos
de cloroformo.
3.4.3.
Detección de virus.- Previamente a la titulación se realizaron unos controles de
esterilidad y de toxicidad del concentrado. Cuando se hizo necesario se realizó una
segunda descontaminación-detoxificación. La titulación de la totalidad del concentrado,
se realizó sobre un cultivo confluente de células BGM, a razón de 10 ml de concentrado
por cada 175 cm de monocapa de células, determinándose el efecto citopático al cabo
de 5-7 días, enumerándose las unidades formadoras de calva.
Tabla 4.Evolución de los parámetros estudiados en el proceso de tratamiento en la ETAP del Llobregat
(M.A.: Media aritmética)
3.5.
4.
Análisis Los coliformes fecales (CF) se analizaron por filtración del agua de muestra, e
incubación de la membrana a 44 ºC sobre el medio mFC Agar (Difco).
Los estreptococos fecales (EF) se analizaron por filtración del agua de muestra, e
incubación de la membrana a 37 ºC sobre el medio Enterococcus Agar (Difco). Las
esporas de clostridios sulfitoreductores (ECS) se analizaron por inoculación en masa del
agua de muestra (previo tratamiento de la misma a 80 ºC durante 5 minutos) en Sulfite
Polymyxin Sulfadiazin Agar.
Resultados
Los resultados se presentan ordenados por tablas, con la finalidad de poder observar diferencias a lo
largo de las cuencas y de línea de tratamiento en las ETAPs. Se indican los datos referentes a: CF, EF, y
ECS todos ellos expresados en ufc/100 ml. Los ENT, se presentan en las unidades explicadas según el
apartado de Material y Métodos. En la Tabla 2 se indican los análisis realizados en la cuenca del río
Llobregat, mientras que los análisis realizados en el complejo de embalses Sau-Susqueda-Pasteral, y en
la zona alta del Ter se muestran en la Tabla 3. En la Tabla 4 se recogen los resultados de los análisis de
la captación de la ETAP del Llobregat y de la entrada a la ETAP del Ter. En las dos ETAPs del Llobregat
y Ter, se realizó en las mismas fechas que para los análisis de sus captaciones, el muestreo en el agua
decantada, filtrada y en la salida de planta, no observándose la presencia de ENT en ninguna de las
muestras analizadas. Los resultados se presentan en la Tabla 5 (ETAP del Llobregat) y Tabla 6 (ETAP
del Ter).
Tabla 5. Resultados de los parámetros estudiados en la Captación de la ETAP del Llobregat y en la
Captación, ETAP del Ter
Tabla 6. Evolución de los parámetros estudiados en el proceso de tratamiento en la ETAP del Ter.
5.
Discusión
El análisis de la presencia de ENT en los río Ter y Llobregat indica unos porcentajes de muestras
positivas y unos niveles de virus que no difieren sustancialmente de los valores de otros ríos europeos
(Block 1983). Estos resultados pueden observarse en el caso de la cuenca del Llobregat (Tabla 2) y en la
captación de ETAP del Llobregat (Tabla 4) . Los valores de ENT presentes en el curso medio del río
llobregat hasta Abrera, si bien indican en el análisis bacteriológico, valores elevados en la zona de
Castellgalí (en donde se producen históricamente, vertidos puntuales con origen en granjas animales,
que junto al resto de residuos urbanos e industriales son depurados en la EDAR de Manresa) , los
valores de ENT son del mismo orden o en todo caso un poco inferiores a los obtenidos por otros autores
hace unos años (Ribas 1991). Ello no debe sorprender demasiado, ya que desde entonces se han
tomado algunas medidas correctoras en el río Llobregat (básicamente con la entrada en funcionamiento
de nuevas EDARs o mejora de las existentes, gestionadas por la Junta de Sanejament), y también es
una constante en los países desarrollados una cierta disminución de ENT en agua, como consecuencia
de la disminución de la población infantil, debido a que la mayoría de este tipo de virus en aguas son de
origen vacunal (p.e. poliomielitis), y que generalmente la vacunación se realiza en la población infantil.
Debe destacarse que en los periodos de otoño - invierno, el aumento del caudal de los ríos por efecto de
las riadas, han podido alterar los resultados dado que la carga microbiana varía notablemente antes y
después de estos aumentos bruscos de caudal, que han afectado tanto al río Llobregat como al Ter.
Cabe destacar en este periodo las épocas de riadas siguientes: octubre 1994, Agosto - septiembre 1995,
enero 1996, Julio - Agosto 96 y de manera generalizada durante el invierno de 1996, periodo durante el
cual tanto el caudal del río Llobregat como el nivel de los embalses del Ter ha sido muy elevado.
Respecto del rio Ter (Tabla 3) en el tramo previo a la entrada en el sistema de embalse, los valores no
difieren sustancialmente respecto al río Llobregat, lo que era de esperar, ya que la población humana
que lo contamina no es muy diferente ni en numero ni en características. Es importante indicar que estos
son los primeros datos disponibles en lo que se refiere al río Ter. Un dato a destacar es el hecho de que
no se hayan aislado ENT en ningún caso después del sistema de embalses del río Ter, lo que demuestra
que es un buen sistema de eliminación. Sin embargo, los bajos números de virus presentes en la entrada
del sistema de pantanos no nos permite evaluar con precisión cual es la magnitud de la eliminación Para
ello haría falta o bien hacer una ingente y casi imposible labor de concentración de volúmenes enormes
de agua, o bien hacer un estudio con microorganismos modelo, como por ejemplo estudiar algunos
bacteriofagos (IAWPRC 1991, Jofre y col 1995).
En cuanto a las ETAPs, puede observarse que la captación de la Planta del Llobregat, que se produce
directamente del río, presenta una carga microbiana claramente superior a la entrada de la Planta del
Ter, debido al efecto del sistema de embalses de esta última. Además en ninguna de las 23
determinaciones realizadas en la ETAP de1 Ter se ha observado la presencia de ENT, mientras que en
8 de 44 muestras (18%) en la Captación de la ETAP del Llobregat resultaron positivas. En el agua
tratada por ambas ETAPs, no se han detectado ENT infecciosos sobre la línea celular BGM en ninguna
de las muestras de 1.000 litros de agua analizadas. Por tanto estas aguas cumplirían con las normativas
o recomendaciones actuales. Al no encontrar virus en el agua potabilizada, no se puede cuantificar la
eficiencia de eliminación de virus en las plantas estudiadas. Para cuantificar con precisión la eficiencia de
dichas plantas en cuanto a la eliminación de virus, habría que disponer de microorganismos modelo
(como por ejemplo bacteriófagos) o aplicar eliminaciones teóricas en cada una de las fases estudiadas
en una planta piloto.
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Por: Vidal A, Lucena F, Arza I , Valero F, Jofre J
Departament de Microbiología Aigües Ter Llobregat (ATLL)
Universitat de Barcelona c/Aribau 197-199, 08021 Barcelona.
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