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Investigación
Ciencia & Desarrollo
LA ENZIMA FOSFOFRUCTUQUINASA EN HÍGADO
DE ALPACA
Raúl Paredes Medias)
RESUMEN
Se ha investigado la enzima fosfofrucoquinasa (PKF) en la célula del hígado de alpaca,
midiendo su actividad en un espectrofotómetro en la región ultravioleta a 340 manómetros.
Las curvas obtenidas muestran que esta enzima es alostérica de actividad reguladora de
cooperatividad positiva y negativa. En el citosol del hígado de alpaca estaría regulando
la conservación de la fructosa 6 fosfato (F6P) en fructosa 1;6 difosfato (F-1;6-di P). Al ser
una enzima alostérica es posible que posea, además del centro catalítico, el `otro espacio'
al que se estaría enlazando el efecto o modulador.
INTRODUCCIÓN
Las enzimas son proteínas sintetizadas por las
células queactúan como catalizadoras de las reacciones
biológicas. Se caracterizan por su capacidad catalítica
y gran especificidad. Actúan sobre sustancias
denominadas sustratos. La actividad de cierto número
deenzimas requiere la presencia deotros componentes
químicos: los cofactores o coenzimas. Cada enzima
cataliza sólo un tipo de reacción.
El centro activo es la región de la enzima en la
que transcurre la catálisis, uniéndose a él, el sustrato y
los cofactores. Esta unión puedeoriginarmodificaciones
estructurales, tanto en la enzima como en el sustrato.
El modelo de Michaelis-Menten ha tenido un
gran impactosobreel desarrollada laquimicaenzimática
por su simplicidad y amplia aplicabilidad. Sin embargo
laspropiedades cinéticasdemuchas enzimasno pueden
explicarse por el modelo de Michaelis-Menten. Un
importantegrupoestá formado parlas llamadas enzimas
alostéricas que, a menudo, muestran gráficas
sigmoidales de velocidad de reacción v, frente a la
concentración de sustrato [s], en vez de gráficas
hiperbólicas que son las predichas por la ecuación de
Michaelis-Menten.
Las enzimas alostéricas son oligoméricas que
Magister en ingeoieria química
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actúan como reguladoras del metabolismo. La
modulación en la actividad catalítica es consecuencia
de la unión no covalente de una molécula específica
(ligando) a un centro de la enzima, distinto del centro
catalítico.
La fosfofructoquinasa (PKF) es una enzima
alostérica con peso molecular bastante elevado (380
000). Contienecierto númerodesubunidadesy muestra
una dependencia compleja de su velocidad de reacción
con la concentración de sus sustratos.
La PKF resulta inhibida por concentraciones
elevadas deadenosín trifosfato (ATP), de citrato y de
ácidos grasos de cadena larga. Por otra parte, la PKF
es estimulada por el adenosín difosfato (ADP) o por el
adenosín monofosfato (AMP). Por esto, cuando se
produce en la célula una concentración elevada de
ATP, o cuando se dispone de otros combustibles tales
como los ácidos grasos o el citrato, la 6fosfofructoquinasa se inhibe, interrumpiéndose la
glucólisis. Inversamente, si la concentración de ATP
desciende y predominan, por tanto, las de AMP y ADP,
o cuando la concentración de otros combustibles como
el citrato o los ácidos grasos es baja, entonces se
estimula la actividad de la 6-fosfofructoquinasa. Asi, el
comportamiento cinético de la 6-PKF, aunque muy
complejo, se halla extraordinariamente bien adaptado a
la regulación de esta importante etapa de la glucólisis.
En el presentetrabajo, se medirá la actividad de
la enzima fosfofructoquinasa purificada del hígado de
alpaca, variando la concentración del sustrato (fructuosa-
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6-fosfato). Se realizará dos mediciones a pH diferentes
y a partir de los datos se harán los análisis
correspondientes.
2 MATERIAL Y MÉTODOS.
Se trabajó con enzima extraída y purificada del
hígado de alpaca.
Setdilizaron:unacentrilugadora, untermostato,
espectofotómetro Gilford 240, cronómetro y además,
materiales de laboratorio.
Se usaron: una solución protectora (ATP-FDPDTT). ATP a,5 mM, AMP 2,0 mM, NACH, TPL, G3PD,
aldolasa, F6P, {NH4) SO4 50%, KCN 1 mM, solución
Poner, NaOH y agualpidestilada.
La enzima fosfofnictoquinasa purificada se
obtuvo del hígado de alpaca por centrifugación y se
mantuvosuspendida en sulfatode amonio. Dos mililitros
centrifugaron por 30 minutos, separándose el
sobrenadantedel precipitado, el cual se suspende en 4
mi de una solución protectora que contiene ATP-FDPDTT.
El medio de ensayo para la reacción se preparó
con los siguientes componentes:
Medio de ensayo
ATP
: 1,5 mM
AMP
: 2,0 mM
NADH
: 0,17 mM
KCN
: 1 mM
Sol. Potter
TPI G3PD
Aidolasa
Agua bidestilada
Para una determinación
2,86mg
unapizca
0,375mg
0,195 mg
1,5m1
0,01m1
0,01m1
2,8ml
Se lleva á pH 6,8
Medio de ensayo
ATP
: 1,5 mM
AMP
: 2,0 mM
NADH : 0,17 mM
KCN
: 1 mM
Sol. Poner (1
TPI G3PD
Aldolasa
Agua bidestilada
Para 25 ensayos
75 mg
una pizca
9,5 mg
5,0 mg
45ml
0,15 ml
0,05 ml
70m1
Se lleva a pH 6,8
Para la medición de la actividad se procedió
delasiguiente manera:
1)En una celda de 3,0 ml de capacidad se colocaron los
siguientes reactivos:
Primera Medición
Medio de ensayo 2,8 ml
Enzima
0,08 ml
Sustrato
0,003 ml
Agua bidestilada 010117 ml
Segunda Medición
2,8ml
0,015 ml
0,003 ml
0,182 ml
2)Sepreincubó a30°C en baño Maríaporcinco minutos.
3)La reacción se inicia con F6P (sustrato) poniendo 3
lambdas, correspondientes a 0,003 ml.
4)La actividad de la PKF se determinó midiendo el
cambio de absorbancia a 340 nm (en la región
ultravioleta) en el espectrofotómetro Gilford 240.
3. RESULTADOS
CUADRO No. 01 : ABSORBANC1A.9
pH 6,8
F - 6P
(8) (8)61
A/min
0,0125
0,0250
0,0500
0,1000
0,2000
0,3000
0,4000
0,5000
0,0005
0,0010
0,0030
0,0090
0,0180
0,0250
0,0280
0,0320
pH 8,0
F-6-P
A/min
(S) (mM)
0,025
0,050
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0,600
0,0145
0,0250
- 0,0330
0,0370
0,0370
0,0420
0,0420
0,0420
CALCULOS
ACTIVtDAD DE LA PEK (En u ml)
La unidad de enzima (u) es la cantidad de
transformación de un mol de sustrato por minuto en
condiciones normalizadas.
La actividad de la fosfofructoquinasa se ha
calculado empleando la siguiente relación:
~in
A (u)
2,07 x alícuota de enzima
donde: Las alícuotas de enzima son para 0,015 ml a pH
6,8 y para 0,030 ml a pH 8,0.
(t)La solución Poner se lleva a pH 8,0 con NaOH y se
completa a 45 mi con agua bidestilada.
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CUADRO N: 02; ACTIVIDAD DE LA PEK
CUADRO W 09: VELOCIDAD DE REACCIO N (phi 8,0)
( En U = u moles / min / ml )
pH6 8
pH8,0
Aminx102 Activ.(U) Aminx102 Activ.(U)
0,016
0,032
0,096
0,298
0,579
0,805
0,902
1,030
0,05
0,10
0,30
0,90
1,80
ZSO
2,80
3,20
1,45
2,50
3,30
3,70
3,70
4,20
4,20
4,20
0,233
0,402
0,531
0,596
0,596
0,676
0,676
0,676
v.,0-3
(S) X 10
inm
2,50
5,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
(u mol ¡ mm)
--i-ST
7,0048
12,0772
15,9420
17,8743
17,8743
20,2898
20,2898
20,2898
40,00
20,00
10,00
5,00
3,30
2,50
2,00
1,60
v
14,276
8,280
6,273
5,595
5,595
4,9285
4,9285
4,9285
VELOCIDADES DE REACCIÓN
Las velocidades de reacción se han calculado
empleando la relación siguiente:
A/min
v2,07
•
16
1
8
Cuadro No. 03
(S)x10
eF10
(u In°1/11
) los (S)
0,2415
0,4831
1,4493
4,3478
8,6956
12,0772
135.955
15,4593
125
2,50
5,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
-1,90
-1,60
-1,30
-1,00
-0,69
-0,52
-0,39
-0,30
4
1
G
aTc-v
1
(S)
--x10
v
-1,80
-1,49
- 0,98
-0,41
0,11
0,55
0,84
0.00
8500
40,00
213,00
10,00
5,00
3,33
2,50
2,00
414,7
206,9
68,9
23,0
11,5
8,3
7,4
6,0
donde: Vmax. = 15 4589 x 0 moles/min
o
10
20
30
40
I
50 (S)x10 -2
Flg. No. 01: CURVAS ALOSTERICAS DE LA PFK
CURVA A: apH 6,8
CURVA B: apH 8,0
log
v.-.
-¿:v
0,5
o
12
4
-0,5
1-ttpit%4
stimesti pi(
46
-0,904
-1.5
-0,5
-O 964
in=m50 =1,81
-2,0
Nig
upo de
-109 (S)
e:~
la (In
Fig. No. 02: coeficiente de HUI -1,31
( a pH 6,8)
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1
x 10
1191tROIICA
20
UNIBG
I
15
10
10
5
5
0 10 20 30 1
1
kM
-18,4
ki 1°
kmB
5
10
1
' •
KmB = 0, 88 a pH 6,8
Fig. N3 03: Valor de KrnA= 5,43 x 102 mM
( a 0413,0)
4. DISCUSIÓN
Al graficar las velocidades de reacción vda la
enzima fosfotructoquinasa del hígado de alpaca, en
función de la concentración de la fructosa-6-fosfato
(F6P) empleada corno sustrato, no se han obtenido las
clásicas curvas hiperbólicas de Michaehs-Menten, sino
más bien curvas típicas de enzimas alostéricas (fig. N°
01), es decir que esta enzima no muestra la relación
cinéticade Michaelis-Menten entrelaconcentración del
sustrato, la velocidad máxima y la constante Km.
La curva A, sigmoidal, obtenida a pH 6,8 es
típica de una enzima alostérica de cooperatividad
positiva, mientras que la curva B, obtenida a pH 8,0,
corresponde a una enzima alostérica de cooperatividad
negativa.
El coeficiente de Hill obtenido es de 1,81 (fig.
N°02), un valor por enzima de la unidad; parlo tanto, la
enzima fosfofructoquinasa del hígado de alpaca es una
enzima reguladora de cooperatividad positiva cuando
actúa en un medio cuyo pH es 6,8, de manera que
Flg. No. 04
estaría regulando en el citosol dala célula del hígado
de alpaca, la transformación de la fructosa-e-fosfato
en fructosa 1;6 difosfato (F-1;6-di P) en una
reacciónanaeróbica (sin oxigeno) de la glucólisis:
PFK
F-6-P + ATP
Ht Kt
—> f 6-di P + ADP
Una reacción típica de las quinasas
dependientes de ATF, requiere de magnesio o potasio
para la actividad y no cataliza la reacción inversa.
A partir de la F-16-di P hay sólo dos caminos
metabólicos subsiguientes: una vía es la ruptura de la
F-1;6-di P por acción de la aldolasa para continuar con
la glucólisis hasta la conversión en Glicerol fosfato; la
otra vía es la conversión de nuevo a F-6-P.
47
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centrosdiferenteseloscentroecatalíticos dependiendo
del tiempo de incubad/511,-1a temperatura y la
concentración del sustrato.
ATP ADP
F 1;8-di P
- 5. CONCLUSIONES
Aldolasa
n:Iceraldehicloa-P sibihidroxiacetonaP
NADH +
Pi
NAD-
Glicerol - P
Cuando sea necesario incrementarla actividad
de la fosfotructoquinasa del hígado de alpaca a un pH
68, será suficiente aumentar la concentración del
sustrato, con lo cual se lograría que la unión de la
primera molécula db sustrato con esta enzima,
intensifique la unión de las moléculas subsiguientes en
los otros centros aetivos a los que se fija á sustrato, en
vista de que los registros naestran una saturación y,
como consecuencia, las actividades ya no se
incrementan (Cuadro N°02).
Teniendo presentequelaconsiantedeMichaelis-Menten, Km es la medida de 'a runa o afinidad del
complejoenzima-sustrato (ES), se han calculado corno:
Km, e- 0,88 a pH 6,8 (Flg. N° 04) y Km, e 0,0543 a pH
8,0-(Fig. N°03), significa que a pH 6,81a anzima tiene
una débil ligazón al sustrato, mientras que a pH 8,0
tendrá una fuerte lio!!,!..ura, hecho que es coherente,
pues un centro acata- :atalaja° no es e! sitio donde se
une la enzima, sino t el otro sitio, teniendo presente
que a pl-I 6,8 la enzin en investigación es netamente
alostérica de coopera • dad positiva. Por otra parte, al
ser la enzimafosfofro: aquinasaalostérica puede estar
siendo alterada por n fléculas reguladoras, ligadas a
Se tia comprobado que la enzima
fosfofructoquinasa del hígado dé alpaca, es una enzima
alostérica de actividad reguladora de cooperatividad •
positiva y, corno tal, estimuladora, cuando actúa a pH
6,8, y de cooPeratividad negativa a pH 8,0.
En el citosól de la célula de hígado de alpaca, la
fostofructopuinasa estaría regulando lá conversión de
la 'fructosa &fosfato (F6P) en fructosa 1:6 difosfato (Eter-di P). • '
.
• La ioa-fofructoquinasa del hígado de alpaca, al
ser una enzima alostérica, es posible que posea, además
del centro catártico, el °otro espacio" al que se estaría
enlazando de modo reversible y no covalente, el efecto
o moduladcr.
Para incrementar la actividad de la enzima,
seránecesarioaumentar la concentración de sustrato a
fin delograr la unión de la primera molécula de sustrato
con la enzima.. Con ello se estaría intensificando la
unión de las moléculas subsiguientes en los otros
centros activos.
•
El 2,1 óptimo para la axil)n reguladora de la
fosfofructoquinasadel higadodealpacaestaríaalrededot
de 6,8
6. RECOMENDACIONES
La aldea Lama peces, de lafamiliaCamellidae,
es considerada dentro de los rumiantes. - más
propiamente "pseuderumiantee" - una especie de
camélido altoandino que muy poco ha merecido ser
investigada en el nivel celular y, más exactamente, en
el rl-el molecular. Si se denea mejorar la calidad de su
lana y same, así como su p acreación, es recomendable
realizar más investigaciones a partir de la unidad celular
de sus diversos órganos.
7. BIBLJOGFUkFIA.
Bohinski, Robert C. 1978, Bioquímica. Ed. Fondo
Educativo Interamericano S. A. Impreso en
E.U.A. p. 362-373.
48.
Letninger, Albert L. 1978, Bioquímica. Ed.
Omega S.A., Barcelona, 435 p.