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Química Biológica 2110. Microbiología y Técnico de Laboratorio. Año 2008
Trabajo Práctico N° 10: Estudios Cinéticos de Fosfatasa Acida de P. fluorescens
C: Determinación del tipo de inhibición ejercida por el tetrametilamonio (TMA)
SE DEBE TRAER PAPEL MILIMETRADO
Objetivos:
 Adquirir destreza en la determinación práctica de parámetros cinéticos.
 Adquirir destreza en el manejo de diferentes ecuaciones para determinar dichos
parámetros.
Introducción:
Cualquier sustancia que reduce la velocidad de una reacción catalizada por enzimas,
puede ser considerado un inhibidor. El proceso de inhibición enzimática es uno de los
principales mecanismos de regulación en las células.
Los estudios de inhibición son importantes porque brindan información acerca de la
especificidad de una enzima, del mecanismo de reacción, y de la arquitectura química y
física del sitio activo. Para el estudio de inhibición enzimática, en esta materia vamos a
asumir que un solo sustrato esta involucrado en la reacción y que solo un tipo de
inhibidor esta presente. Existen 3 tipos de sistemas de inhibición simple:
a) Inhibición competitiva
El equilibrio que describe este tipo de inhibición se muestra en el siguiente esquema:
Un inhibidor competitivo es capaz de unirse a la enzima libre en el mismo sitio donde
se une el sustrato, impidiendo de esta manera su unión. Es decir, sustrato e inhibidor son
exclusivos mutuamente. Generalmente el inhibidor competitivo es un análogo no
hidrolizable del sustrato, un sustrato alternativo o el mismo producto de la reacción. El
resultado de esto es que la velocidad máxima de reacción que se alcanza es la misma en
presencia o ausencia de inhibidor, pero en presencia del inhibidor, el Km para el
sustrato aumenta debido a que parte de la enzima esta acomplejada al inhibidor y por lo
tanto no disponible para el sustrato.
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a) Inhibición no competitiva
Los equilibrios que describen este tipo de inhibición son los siguientes:
En este sistema de inhibición, el inhibidor no tiene efecto sobre la unión del sustrato, ya
que se une en otro sitio de la enzima. El sustrato y el inhibidor se unen al
reversiblemente, azarosamente e independientemente a diferentes sitios. Esto significa
que el inhibidor I se puede unir tanto a la enzima libre como al complejo ES. De igual
modo el sustrato S se puede unir a la enzima libre y al complejo EI. Sin embargo el
complejo ESI es improductivo, esto es, no se cataliza la formación de producto. De
modo que la afinidad de la enzima por el sustrato no se verá afectada y por lo tanto el
Km será el mismo en presencia o ausencia del inhibidor. Mientras que la Vmax que
alcance la enzima en presencia de inhibidor será menor ya que siempre habrá parte de
enzima formando el complejo ESI improductivo.
a) Inhibición acompetitiva
El equilibrio que describe este último tipo de inhibición es el siguiente
Un inhibidor acompetitivo clásico es aquel que se une reversiblemente al complejo ES
generando un complejo ESI improductivo. El inhibidor no es capaz de unirse a la
enzima libre. La consecuencia de esto es que en presencia del inhibidor, la enzima es
mas afin por el sustrato, disminuyendo el Km, sin embargo la Vmax en presencia del
inhibidor será siempre menor, ya que siempre habrá enzima formando el complejo ESI
improductivo.
En el pasado TP, se determinaron los parámetros cinéticos de la enzima fosfatasa ácida
para el sustrato p-NPP. En este TP se analizará los efectos del compuesto
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tetrametilamonio (TMA) sobre la actividad AcPasa y se establecerá el tipo de inhibición
ejercida. A continuación se muestra la estructura del sustrato verdadero de esta enzima
(fosforilcolina, PCh) y del inhibidor, TMA.
Fosforilcolina
TMA
Compare las estructuras de ambos compuestos y elabore una hipótesis acerca de la
inhibición que espera encontrar para el compuesto TMA sobre la actividad de AcPasa.
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
Curva de sustrato p-NPP en presencia de TMA
Solución
[p-NPP] 0 mM
Buffer AcH/AcNa
250 l
pH 5
0.25mM
0.5 mM
1 mM
2 mM
5 mM
10 mM
250 l
250 l
250 l
250 l
250 l
250 l
MgCl2 35 mM
30 l
30 l
30 l
30 l
30 l
30 l
30 l
p-NPP
-
200l (1)
200l (2)
200l (3)
200l (4)
200l (5)
200l (6)
TMA
10 l
10 l
10 l
10 l
10 l
10 l
10 l
Muestra
10 l
10 l
10 l
10 l
10 l
10 l
10 l
H2 O
200 l
-
-
-
-
-
-
0
0.003
0.005
0.01
0.02
0.04
0.08
DO observada
DO blanco
DO corregida
Soluciones madres de sustrato:
1- p-NPP 0.625 mM
2- p-NPP 1.25 mM
3- p-NPP 2.5 mM
4- p-NPP 5 mM
5- p-NPP 12.5 mM
6- p-NPP 25 mM
Graficar los valores obtenidos según la ecuación de Michaellis-Menten y Lineweaber-Burk (o Hanes o Eadie-Hofstee según prefiera) y
determinar Km y Vmax en presencia del inhibidor. Definir que tipo de Inhibición ejerce el TMA.
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