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IMPLICACIÓN DE DYRK1A, UN GEN CANDIDATO PARA EL
SÍNDROME DE DOWN EN LA PATOLOGÍA TIPO
ALZHEIMER Y CARACTERIZACIÓN DE LOS EFECTOS
NEUROPATOLÓGICOS Y COGNITIVOS DE
PROTOFIBRILLAS CITOTÓXICAS DE PÉPTIDOS
DERIVADOS DE PROTEÍNAS AMILOIDES NATURALES EN
MODELOS MURINOS DE DYRK1A
Investigadores principales:
Dra. Mara Dierssen Sotos
Centre de Regulació Genòmica
Dr. José Ramon Naranjo Orovio
Centro Nacional de Biotecnología. Madrid
Dr. Salvador Martínez Pérez
Institut de Neurociències UMH
Duración: 3 años
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1. Resumen
La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurodegenerativo con
una elevada prevalencia en el síndrome de Down (SD), de forma que es un
modelo de estados predemenciales de la EA. Sin embargo, todavía se
desconocen los factores genéticos y epigenéticos que contribuyen a los
trastornos cognitivos de estos pacientes. Dyrk1A es un gen candidato para
SD que participa en neurogénesis, diferenciación neural, alteraciones
cognitivas y procesos neurodegenerativos. En el núcleo de algunas
neuronas del córtex de pacientes con EA se ha observado un incremento de
expresión de Dyrk1A, por lo que se podría considerar como un posible factor
genético común entre ambas patologías.
En este proyecto, nuestro principal objetivo consistió en establecer el papel
de Dyrk1A en los procesos cognitivos y neuropatológicos del SD en la EA y
en la cascada amiloidogénica. Como objetivo secundario, se estudio la
posible acción sinérgica de otros dos genes presentes en el cromosoma 21
(BACE2 y APP) sobre el proceso neurodegenerativo relacionado con la EA.
Este es un proyecto multidisciplinario que ha aunado el esfuerzo de
expertos en diversas metodologías, como modelos animales, bioquímica,
histología o cultivos celulares.
2. Resultados
Implicación de Dyrk1A en el proceso neurodegenerativo asociado a
la EA
El estudio del proceso de envejecimiento en el ratón TgDyrk1A reveló un
deterioro neurológico y cognitivo similar al observado en modelos de EA. El
deterioro de la marcha es uno de los primeros signos neurológicos del
desarrollo de demencia en los pacientes adultos con SD; sin embargo, los
signos más notables se refieren al declive de la función cognitiva. Ambos
aspectos resultan severamente afectados con la edad en los ratones
TgDyrk1A.
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A nivel neuroquímico se realizó un estudio detallado del sistema colinérgico,
relacionado con la retención y la memoria reciente y cuya degeneración es
patognomónica en la EA. En los ratones TgDyrk1A el análisis histológico de
las neuronas colinérgicas del prosencéfalo basal mostró una acusada
pérdida neuronal asociada con la edad. Probablemente, la pérdida de
neuronas colinérgicas pueda ser debido a una alteración en el transporte
retrógrado de NGF, factor trófico aportado por las regiones diana del
sistema colinérgico y necesario para la supervivencia de estas neuronas, y
que observamos en la corteza y el hipocampo de los ratones TgDyrk1A
(figura 1).
Figura 1. Análisis esterológico de las poblaciones colinérgicas en ratones TgDyrk1A jóvenes y viejos
Interacción entre Dyrk1A y DREAM como posible mecanismo
patogenético
Uno de los posibles mecanismos a través de los cuales Dyrk1A podría
participar en los procesos neurodegenerativos es a través de la regulación
transcripcional. La proteína DREAM- calsenilin-KchIP3 es una proteína
multifuncional dependiente de calcio, que se expresa principalmente en
córtex e hipocampo. DREAM ejerce varias funciones dependiendo de su
localización subcelular. En el núcleo, DREAM se une a dominios DRE
(Downstream Regulatory Element) para reprimir la transcripción de genes
específicos. Con objeto de profundizar en la relación funcional entre Dyrk1A
y DREAM, hemos investigado su posible corregulación en modelos
transgénicos con sobreexpresión independiente de Dyrk1A o mutantes
dominantes activos de DREAM en neuronas.
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Mediante experimentos de RT-PCR cuantitativa empleando sondas
específicas TaqMan hemos cuantificado los niveles de expresión basal de
DREAM en varias áreas cerebrales de los ratones transgénicos Dyrk1A. Los
resultados muestran una reducción significativa de los niveles de DREAM
endógeno en hipocampo y estriado que se corrobora a nivel de proteína
(figura 2).
Figura 2. Interacción DREAM/Dyrk1A. Panel izquierdo: niveles de proteína DREAM en TgDyrk1A. Panel
derecho: RT-PCR cuantitativa de los niveles de Dyrk1A mRNA en áreas cerebrales de cinco líneas de
ratones transgénicos sobreexpresando distintos mutantes de DREAM
Al determinar los niveles de Dyrk1A en ratones que sobreexpresan un
dominante activo DREAM con tres mutaciones que los hacen insensibles a
calcio y cAMP, se observa una caída significativa de Dyrk1A en hipocampo,
mientras que en corteza los valores son similares a sus respectivos
controles (figura 2).
Estudio de la citotoxicidad inducida mediante protofibrillas APP y
tau
Desde hace varios años se ha establecido que moléculas relacionadas con la
EA como son APP y tau son sustratos de Dyrk1A, sugiriendo que a través de
este mecanismo la sobreexpresión de Dyrk1A podría estar favoreciendo la
temprana instauración de EA en los individuos con SD. Uno de los objetivos
de este proyecto consistía en inducir patología similar a la EA en nuestro
modelo TgDyrk1A empleando protofibrillas citotóxicas derivadas de péptidos
amiloides y/o tau, considerando las protofibrillas especies intermedias de
las fibras maduras. Los ensayos de citotoxicidad (MTT) se realizaron en
cultivos primarios corticales de TgDyrk1A a DIV6 empleando protofibrillas
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de tau y beta-amiloide obtenidas mediante sonicación. Los cultivos
TgDyrk1A mostraron una menor resistencia citotóxica, sugiriendo un
incremento en la sensibilidad hacia las especies tóxicas implicadas en la EA
debido a la sobreexpresión de Dyrk1A (figura 3, panel izquierdo).
Figura 3. Toxicidad de especies intermedias sobre cultivos celulares de ratones TgDyrk1A. Panel
izquierdo: estudio de viabilidad en presencia de concentraciones crecientes de protofibrillas Abeta. Panel
derecho: efecto de la exposición a protofibrillas sobre la neuritogénesis en cultivos de células PC12.
A pesar de que diversos estudios han determinado que las fibras maduras
de tau podrían interferir en el proceso de neuritogénesis, el efecto de las
especies intermedias no ha sido todavía establecido. Los experimentos
iniciales, analizando la morfología de células PC12 transfectadas con EGFP,
sugieren que las protofibrillas de tau podrían interferir en el proceso de
elongación de las dendritas durante la neuritogénesis (figura 3, panel
derecho).
Estudio del desarrollo cortical y la implicación de la sobreexpresión
de Dyrk1A
En una patología neurodegenerativa de las características del SD, es
necesario conocer los factores estructurales y funcionales que pueden
constituir elementos predisponentes de la neurodegeneración asociada a la
edad. Por ello, para entender el proceso neurodegenerativo en el síndrome
de Down, resulta relevante el estudio del desarrollo del SNC desde la
neuritogénesis hasta la formación de las estructuras cerebrales.
El estudio del efecto de la sobreexpresión de Dyrk1A sobre la neuritogénesis
realizado en cultivos primarios corticales reveló una menor complejidad
dendrítica y una reducción en la longitud de los segmentos terminales
axónicos debido este último a un enlentecimiento en la velocidad de
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crecimiento. La velocidad del crecimiento axónico depende de la efectividad
en la interacción entre el citoesqueleto de actina y los microtúbulos. En las
neuronas TgDyrk1A, la fracción de microtúbulos aparecía más retraída sin
llegar a integrarse en el cono axónico apuntando a una interacción con los
filamentos de actina menos efectiva. Estos resultados sugieren que Dyrk1A
podría estar actuando sobre proteínas reguladoras de la dinámica del
citoesqueleto como la proteína tau, afectando a la reorganización de los
microtúbulos con consecuencias en el crecimiento de las ramificaciones
durante la neuritogénesis,
Por otro lado, el estudio de la densidad sináptica en diferentes edades de
cultivo mostró una importante afectación de la sinaptogénesis en las
neuronas TgDyrk1A. Estos resultados sugieren una incapacidad en las
neuronas TgDyrk1A para el desarrollo total
de los contactos sinápticos con
implicaciones posiblemente en la correcta
conectividad y funcionalidad neuronal.
Además, el estudio morfológico de las
espinas TgDyrk1A maduras (DIV20) mostró
una disgenesia que se caracterizaba por
ser más inmaduras y aparecer en menor
número, similar al fenotipo observado en
las dendritas corticales de individuos con
SD. El análisis electrofisiológico de cultivos
maduros reveló una significativa reducción
en la frecuencia de disparo de las
neuronas. Las espinas dendríticas son estructuras inestables sometidas a
cambios constantes de morfología en función de la actividad neural y los
factores ambientales. Estos cambios estructurales dependen de la
reorganización del citoesqueleto de actina, ya que los monómeros de ésta
se difunden desde la dendrita para incorporarse a los filamentos de actina
presentes en la espina dendrítica. En nuestros cultivos estudiamos la
dinámica de la actina en las espinas mediante la técnica de recuperación de
la fluorescencia tras exposición intensa al láser (FRAP, fluorescente recovery
after photobleaching) con la ayuda de microscopía confocal. Las espinas
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TgDyrk1A muestran una alteración en la dinámica de la actina en las
espinas dendríticas que estaría afectando a procesos asociados a la
plasticidad sináptica (figura 4).
Los resultados obtenidos en cultivos corticales mostraron que Dyrk1A ejerce
un papel relevante en el desarrollo de las neuronas corticales tanto durante
la neuritogénesis como en la sinaptogénesis. Sin embargo, era importante
determinar si la sobreexpresión de Dyrk1A modifica a su vez el desarrollo y
arquitectura cortical in vivo. El estudio morfológico de la corteza en
diferentes estadios embrionarios no reveló alteraciones estructurales
relevantes en el ratón TgDyrk1A en comparación con el control, indicando
un desarrollo morfológico normal de la neocorteza. Sin embargo, a E11.5 en
los embriones TgDyrk1A, se observó un incremento de imágenes mitóticas,
indicando un aumento de células en proliferación en la región ventricular
acompañado de un menor número de neuronas diferenciadas, sugiriendo un
retraso en la maduración de esta región. El estudio de la proliferación
neuronal en los embriones TgDyrk1A mediante inyecciones de BrdU a la
madre gestante, reveló un retraso proliferativo en las etapas tempranas
(E12.5) que no se mantenía en estadios posteriores (E14.5). Entre E12.5 y
E18.5 se forman las proyecciones córtico-talámicas y tálamo-corticales en el
prosencéfalo de los ratones. El hecho de que en el tálamo dorsal a E12.5 se
observara una reducción en el número de células proliferativas (BrdU
positivas) y de células calbindina positivas, sugería un retraso en el
nacimiento de las interneuronas GABAérgicas. Los resultados obtenidos
sugieren un retraso en el desarrollo cortical de los animales que
sobreexpresan Dyrk1A. Posiblemente el retraso en la proliferación
observado tanto en la corteza como en el tálamo estará afectando al
establecimiento de las conexiones córtico-talámicas, fundamentales para la
correcta integración y procesamiento de la información (figura 5).
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Figura 5. Proyecciones tálamo-corticales en embriones TgDyrk1A
Desarrollo de cortezas cerebrales quiméricas
El transplante de progenitores neuronales de ratones transgénicos GFPbeta-actina a E14 en córtex e hipocampo de embriones TgDyrk1A a E14
mostró un gran número de células ectópicas en el hipocampo (CA),
sugiriendo que la información posicional o las interacciones celulares que
regulan la migración están alteradas por la sobreexpresión de Dyrk1A
(figura 6).
Figura 6. Progenitores neuronales control integrados en el cerebro de ratones TgDyrk1A
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Estudio de la neurodegeración en un modelo murino de
sobreexpresión de APP y BACE2
Con el fin de conocer el papel que la acción sinérgica de la sobreexpresión
de dos genes presentes en el cromosoma 21 podrían tener sobre el proceso
neurodegenerativo, se realizó el análisis conductual del modelo transgénico
TgAPP/BACE2. La proteína de membrana APP sufre una sucesión de
procesos proteolíticos que en condiciones patológicas promueven la
producción del péptido beta-amiloide que tiende a acumularse
extracelularmente formando las placas seniles patognomónicas de EA. Por
otro lado, BACE2 es una secretasa que podría participar en el
procesamiento del APP. En nuestro trabajo, no se observó ni deterioro
cognitivo asociado a la edad ni diferencias significativas en la cantidad de
péptido beta-amiloide presente en hipocampo y corteza de los ratones
TgAPP/BACE2. Estos resultados muestran que la sobreexpresión de APP per
se no es suficiente para inducir el proceso neurodegenerativo y que
posiblemente BACE2, a pesar de estar involucrado en el procesamiento de
APP, no estaría implicado en la vía amiloidogénica.
3. Relevancia y posibles implicaciones clínicas de los resultados
finales obtenidos
Los datos obtenidos en este proyecto implican a Dyrk1A en la aparición
temprana de procesos degenerativos observados en los individuos con SD.
Así, la sobreexpresión de Dyrk1A incrementa la vulnerabilidad cerebral al
desarrollo de fenómenos patológicos relacionados con la EA, como la
degeneración colinérgica o la citotoxidad del péptido amiloide y de las
formas hiperfosforiladas de tau. Sin embargo, los fenotipos observados no
engloban en su totalidad el cuadro patológico de esta enfermedad, por lo
que probablemente Dyrk1A podría estar actuando en sinergismo con otros
genes del cromosoma 21 que se encuentren sobreexpresados de manera
similar en el SD. Si bien se desconocen las causas que desencadenan la
precocidad en la aparición de los signos patológicos de la EA en las
personas con SD, el hecho de que se trate de un cerebro previamente
alterado podría hacerlo más vulnerable y sensible a los mecanismos
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patológicos. En este trabajo se ha demostrado que Dyrk1A no sólo tiene un
papel relevante durante la etapa adulta, sino que a nivel embrionario
participa en procesos de neuritogénesis, sinaptogénesis y establecimiento
de conexiones corticales. El conjunto de estas evidencias convierten a
Dyrk1A en una molécula a tener en cuenta a la hora de establecer nuevas
estrategias terapéuticas. Así, la actuación sobre su expresión y/o actividad
podría modular parte de los procesos patogénicos de la EA en los individuos
con SD. De hecho, hemos iniciado un primer ensayo clínico piloto con
tratamiento con un inhibidor de Dyrk1A, la epigalocatequina del té verde
con el fin de mejorar la función cognitiva a través de la normalización de la
actividad de Dyrk1A.
4. Publicaciones
Benavides-Piccione R, Dierssen M, Ballesteros-Yáñez I, Martínez de
Lagrán M, Arbonés ML, Fotaki V, DeFelipe J, Elston GN.
Alterations in the phenotype of neocortical pyramidal cells in the
Dyrk1A+/- mouse.
Neurobiol Dis. 2005, 20: 115-22. I.F. = 4.518
Ferrer I, Barrachina M, Puig B, Martínez de Lagrán M, Martí E, Avila J,
Dierssen M.
Constitutive Dyrk1A is abnormally expressed in Alzheimer disease, Down
syndrome, Pick disease, and related transgenic models.
Neurobiol Dis. 2005, 20: 392-400. I.F. = 4.518
Martinez de Lagran M, Bortolozzi A, Millan O, Gispert JD, Gonzalez JR,
Arbones ML, Artigas F, Dierssen M.
Dopaminergic deficiency in mice with reduced levels of the dual-specificity
tyrosine-phosphorylated and regulated kinase 1A, Dyrk1A(+/-).
Genes Brain Behav. 2007, 6: 569-78. I.F. = 3.795
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Arqué G, de Lagrán MM, Arbonés ML, Dierssen M.
Age-associated motor and visuo-spatial learning phenotype in Dyrk1A
heterozygous mutant mice.
Neurobiol Dis. 2009, 36: 312-9. I.F. = 4.518
Dierssen M, Herault, Y, Estivill, X.
Aneuploidy: from a Physiological Mechanism of Variance to Down
Syndrome.
Physiol Rev. 89: 887-920, 2009. I.F. = 37.726
Lott IT, Dierssen M,
Down syndrome: Neurological Complications and Cognition.
The Lancet Neurology, 2010, 9: 623-33. I.F. = 18.126
Fillat C, Dierssen M, Martinez de Lagran M, Altafaj X.
Insights from Mouse Models to Understand Neurodegeneration in Down
Syndrome.
CNS & Neurolog Disord-Drug Targets, 2010, 9: 429-38. I.F. = 3.571
Azkona G, Levannon D, Groner Y, Dierssen M.
In vivo effects of APP are not exacerbated by BACE2 co-overexpression:
behavioural characterization of a double transgenic mouse model.
Amino Acids. 2010, 39: 1571-80.
Azkona G, Amador-Arjona A, Obradors-Tarragó C, Varea E, Arqué G,
Pinacho R, Fillat C, de la Luna S, Estivill X, Dierssen M.
Characterization of a mouse model overexpressing BACE2 reveals a new
role for BACE2.
Genes Brain Behav, 2010, 9: 160-72. I.F. = 3.795
Toiber D, Azkona G, Ben-Ari S, Torán N, Soreq H, Dierssen M.
Engineering DYRK1A overdosage yields Down syndrome-characteristic
cortical splicing aberrations.
Neurobiol Dis. 2010, 40: 348-59. I.F. = 4.518
12
Martínez de Lagrán Benavide-Piccione R, Ballesteros-Yanez Y, Calvo M,
Morales M, Fillat C, De Felipe J, Ramakers GJ, Dierssen M,
Single overexpression of Dyrk1A recapitulates the dendritic abnormalities
of Down syndrome patients. (Submited to Cerebral Cortex) I.F. = 6.979
Basson MA, Echevarria D, Petersen Ahn C, Sudarov A, Joyner AL, Mason
IJ, Martinez S, Martin GR.
Specific regions within the embryonic midbrain and cerebellum require
different levels of FGF signaling during development.
Development, 2008, 135, 889-898 I.F. = 7.194
Perez-Balaguer A, Puelles E, Wurst W, Martinez S.
Shh dependent and independent maintenance of basal midbrain.
Mechanisms of Development 2009, 126: 301-313 I.F. = 2.827
Moreno-Bravo JA, Perez-Balaguer A, Martinez S, de Puelles E.
Dynamic expression patterns of Nkx6.1 and Nkx6.2 in the developing
mes-diencephalic basal plate.
Developmental Dynamics 2010, 239:2094-2101 I.F. = 2.833
13