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REVISTA IBEROAMERICANA DE
COORDINADORA CIENTIFICA DE REPRODUCCION H U M A N A
Evolución de los medios de cultivo embrionario en Técnicas de
Reproducción Asistida
Evolution of the culture media in assisted reproduction techniques
Dorado M, Marqués de Oliveira N, Lorenzo C, Vázquez G, Marco Y
Instituto de Reproducción Marques de Oliveira (IRMO)
Santa Cruz de Tenerife- Spain CP 38006.
Resumen
Desde que se iniciaron las Técnicas de Reproduccción Asistida, se intentó llevar a blastocistos los
embriones obtenidos, puesto que éste es el estadio en el cual el embrión se implanta en el útero. Los
dos sistemas de cultivo más extendidos son el cocultivo y el cultivo secuencial.
La técnica del cocultivo consiste en cultivar embriones sobre una monocapa de células, autólogas o
heterólogas, que le proporcionan las moléculas necesarias para el desarrollo del embrión hasta blastocisto. En el cultivo secuencial se cultivan embriones en diferentes medios en distinta composición
de nutrientes según el estadio embrionario.
El objetivo de esta revisión es dar a conocer la evolución que se ha llevado a cabo en los sistemas y
composición de los medios de cultivos para mejorar la calidad de los embriones cultivados in vitro.
Palabras clave: Fertilización in vitro. Medios de cultivo. Cocultivo. Cultivo secuencial.
Summary
Since Assisted Reproduction Techniques were initiated, embryos obtained were tried to carry to blastocyst stage, as in this stage is where the embryo is implanted in the uterus. Most extended culture
systems are co-culture and sequencial culture.
Co-culture consists of an embryo culture on a mono-layer of autologous or heterologous cells, which
provide the necessary molecules for embryo development until its blastocyst stage. In sequential culture, embryos are cultured in different media of different nutrients composition according to its embryonary stage.
The aim of this study is to present the evolution that has been carried out with systems and composition of the culture media to improve quality of embryos cultured in vitro.
Key words: In vitro fertilization. Culture media. Co-culture. Sequiential culture.
Correspondencia: Dra. Neuda Marqués de Oliveira
Calle Fernando Primo de Rivera nº 99
38006 Santa Cruz de Tenerife
neudam@hotmail.com
Vol. 23- nº 1 - Enero-Febrero 2006
Evolución de los medios de cultivo embrionario en TRA - 31
INTRODUCCIÓN
Desde que se iniciaron las Técnicas de Reproducción
Asistida, se intentó llevar los embriones a blastocisto.
El problema que plantea la transferencia en estadio
de blastocisto es la posible cancelación de dicha
transferencia. Además, si un embrión se bloquea a lo
largo de un cultivo, desconocemos si podría haberse
implantado se hubiera sido transferido en los primeros estadios de división (1).
El embrión in vivo pasa por diferentes estados de
desarrollo que tienen diferentes necesidades metabólicas. Por tanto, el cultivo in vitro requiere medios
con los nutrientes adecuados en cada fase del desarrollo. Algunos trabajos analizan la composición metabólica de los fluídos del oviducto y del útero, de
aquí la necesidad de elaboración de medios secuenciales (2).
Tras la fecundación y en las primeras divisiones
embrionarias el fluido es rico en lactatos y pyruvatos
y pobre en glucosa (3). Cuando el embrión alcanza el
estadio de 6-8 células aumenta sus necesidades de
glucosa y disminuyen las de lactatos y pyrvato, momento en que entra en la cavidad uterina.
EVOLUCIÓN E IMPACTO DE LOS MEDIOS
DE CULTIVO
Veamos de forma cronológica el desarrollo que se
ha llevado a cabo en los medios de cultivo:
Año 1980: Se utilizaba un medio natural que consistía en una solución salina y una fuente de energía
(HTF médium), o bien suplementado con aminoácido
adicionales (a.a), vitaminas y precursores de ácidos
nucleicos (2, 4-8).
Año 1990: Aparecieron algunas modificaciones
como la eliminación de glucosa y fosfato, y la inclusión de Taurina, Glutamina y EDTA (ácido etileno dinamino tetracético) (9-11).
Finales 1990: Gardner y Lave (12) demonstraron
la importancia de los a.a. esenciales y no esenciales
junto con las vitaminas en la fase de postcompactación para el desarrollo hasta blastocisto.
Quinn (5) y Pool (9) modificaron el HTF original.
Quin eliminó el fosfato y la glucosa inorgánica originando el primer medio libre de glucosa denominado
QB11, suplementado con EDTA y Glutamina. Pool
modificó el HTF, al que llamó P1, el cual está libre
de fosfato,glucosa y suplementado con Taurina (11).
Dirnfeld et al. observaron que los embriones se desa32 - Evolución de los medios de cultivo embrionario en TRA
rrollan mejor sin estos metabólitos y se obtiene una
mayor tasa de embarazo (13).
Estos resultados pueden inducir a creer que la glucosa y el fosfato inorgánico son perjudiciales para el
cultivo embrionario, pero debemos tener en cuenta
que estos medios están suplementados con Taurina y
EDTA, los cuales son beneficiosos para el cultivo. Es
posible que la mejoría en la calidad de los embriones
cultivados en estos medios sea por estos suplementos
y no por haber eliminado la glucosa y el fosfato inorgánico (10).
COMPONENTES DE LOS MEDIOS DE
CULTIVO
Glucosa: es necesaria para mantener la velocidad
espermática en el medio de cultivo, para la división
del embrión y para asegurar los requerimientos de la
ruta de la pentosa fosfato.
Magnesio: la concentración debe ser alta para
compensar el incremento intracelular de Calcio inducido por el cultivo in vitro.
Taurina y EDTA: protegen de la oxidación. Sin
embargo, una alta concentración de EDTA puede provocar granulación en el embrión.
Ácido Cítrico: importante en el desarrollo preimplantatorio debido al ciclo del ácido tricarboxílico.
Glutamina: beneficioso para el desarrollo in vitro
del embrión. La forma estable es la Alanil-glutamina,
ya que la glutamina libera amonio, el cual es embriotóxico (14).
ASPECTOS IMPORTANTES A TENER EN
CUENTA EN UN MEDIO DE CULTIVO
Para conseguir un medio de cultivo eficaz es necesario recrear las condiciones del medio natural donde se desarrolla el embrión de forma in vitro. Esto es
posible conociendo los nutrientes y metabolitos que
se encuentran en cada estadio por los que pasa el embrión hasta llegar al útero (13). Uno de estos metabolitos es la glucosa en el medio de fertilización y otro
es el nivel de fosfato inorgánico necesario. Generalmente se aceptan dos aspectos distintos según el
estadio: la baja o nula concentración de Pi en el cultivo durante la precompactación y la moderada o alta
concentración de Pi en la fase de postcompactación,
que es cuando la actividad glucolítica se incrementa.
Por otro lado, los a.a. se desaminan en solución y
pueden llegar a ser tóxicos por la formación de amoVol. 23- nº 1 - Enero-Febrero 2006
niaco. Por ello los medios de cultivo sólo se deben incubar dos o tres días. Una alternativa a esto podría ser
la sustitución del dipéptido estable alanil-glucosamina por glucosa.
Otro aspecto importante de los medios de cultivos
es el efecto que tienen sobre el pH. Así, la composición del medio, la concentración de bicarbonato sódico y la concentración de CO2 en la atmósfera determinan el pH final del medio equilibrado. Estudios
sobre el % de CO2 (5 ó 6%) han revelado que no existen diferencias significativas (5, 15).
Con respecto a la concentración de Ca2+/Mg2+,
se ha discutido el uso de rojo fenol como indicador de
pH, el uso de tampones como HEPES o MOPS, la atmósfera de CO2, así como la utilización de aceite para cubrir los medios, sin llegarse a una conclusión o
ventajas con respecto a su uso (16).
Existen igualmente discrepancias en la influencia
de factores autocrinos y paracrinos en el desarrollo in
vitro. Se ha observado el beneficio de la inclusión de
factores de crecimientos que estimulan al embrión
para llegar a blastocisto.
COCULTIVOS FRENTE A MEDIOS
SECUENCIALES
Una de las principales causas de fallos en la implantación en Técnicas de Reproducción Asistida
obedece al desfase temporal existente en el momento
de realizar su transferencia en un endometrio que todavía no ha alcanzado su madurez funcional. El problema se plantea en el mantenimiento de esos embriones a la espera del momento más oportuno hasta
su transferencia (17).
COCULTIVO
El éxito del cultivo in vitro de embriones se basa
en tener un buen soporte nutritivo que incluya oligoelementos y hormonas. Es por ello el cocultivo una
técnica popular de fácil manejo y rápida difusión.
Se ha experimentado con células epiteliales tubáricas (18), células endometriales humanas (19), células del cúmulo y de la granulosa (13, 17) y células
Vero, derivadas del epitelio renal en simios. Estos
cultivos han arrojado tasas de desarrollo hasta blastocisto que sobrepasan el 60% (19, 20). Este sistema de
cocultivo mejora los resultados en pacientes con fallos repetidos en ciclos de FIV.
El cultivo de embriones por este método puede
eliminar factores que afecten al desarrollo, como las
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hipoxantinas observadas en muchos medios de cultivo que se sabe inducen al bloqueo en dos células
(17). El cocultivo puede tener efecto antioxidante y
factores específicos para el desarrollo. Por el contrario, cuando se usan células de donantes, el embrión
puede contaminarse por patógenos o tóxicos (21).
Actualmente se comercializa líneas de células alteradas para el cocultivo ajenas a los epitelios ginecológicos, con el incoveniente de que estas líneas celulares
no enriquecen hormonalmente dicho medio.
CULTIVO SECUENCIAL
Los medios secuenciales simplifican lo anterior,
aportando los nutrientes, oligoelementos y hormonas
de las que carecen los cocultivos y permiten estandarizar su uso. Como desventaja tiene un coste elevado
y no existe la interacción embrión-célula.
El cultivo secuencial se lleva a cabo en dos medios
distintos dependiendo de las necesidades metabólicas
y nutricionales (2). Gardner et al., no sólo defendió el
cambio de necesidades nutricionales sino las distintas
concentraciones de metabolitos que hay a lo largo del
recorrido que realiza el embrión in vivo (12).
El medio secuencial se basa en el cambio de piruvato por glucosa para incrementar la demanda de
energía para el desarrollo hasta blastocisto (22). El
medio G1 (Vitrolife) está basado en el nivel de carbohidratos presente en las trompas y aminoácidos
esenciales para la división. Del mismo modo está
presente EDTA para secuestrar los cationes divalentes tóxicos y contrarrestar la actividad glicolítica del
embrión. El medio G2 (Vitrolife) está basado en el
nivel de carbohidratos en el útero, además de aminoácidos esenciales y no esenciales, y no contiene
EDTA.
Rutinariamente, la transferencia de embriones se
realiza en el día +2. En ese momento los embriones
se encontrarían in vivo en la trompa. Si se consigue
cultivar embriones hasta blastocisto, se puede realizar
una selección de éstos más estricta y más eficaz, por
lo tanto se alcanza una mayor sincronía entre endometrio y embriones.
COCULTIVO VERSUS CULTIVO
SECUENCIAL
El porcentaje de embriones que llegan a blastocisto es significativamente mayor utilizando medios secuenciales (23). Sin embargo, es muy parecido el porcentaje que llega a mórula utilizando uno y otro
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cultivo. Aunque también es mayor el porcentaje de
implantación con medios secuenciales el numero de
nacido no es significativo (23). Los resultados indican que los medios sintéticos responden mejor a las
necesidades de los embriones a pesar de la ausencia
del medio fisiológico celular (23).
Los embriones presentan dos etapas distintas. La
primera, ante de la activación genómica (hasta 8 células), cuando la síntesis de proteínas depende del RNA
materno. En este periodo se requiere de protección
frente a radicales libres, EDTA y una reducida concentración de glucosa y fosfato. La segunda fase, en
el momento de la activación genómica, cuando las
necesidades del embrión son cuantitativamente y cualitativamente mayores. La posibilidad de llevar los
cultivos a blastocisto limitaría el número de embarazos múltiples, se podría efectuar diagnóstico preimplantatorio y transferir en blastocisto permitiendo la
selección de embriones.
COMPARACIÓN DE LA UTILIZACIÓN DEL
MONOCULTIVO FRENTE AL CULTIVO
SECUENCIAL
Para realizar este estudio se diseñaron tres formas
de cultivar los embriones hasta blastocisto:
Grupo 1: cultivar los embriones durante 5 días en
monocultivo (Rótterdam médium).
Grupo 2: cultivo de los embriones durante 3 días
en monocultivo y 2 días en monocultivo nuevo.
Grupo 3: cultivo de los embriones en medio secuencial G1/G2 durante 5 días.
En este estudio no encontraron diferencias significativas entre los tres sistemas de cultivo con respecto
a blastulación, implantación y embarazo, lo cual se
contradice con otros estudios similares (25). Por lo
tanto el monocultivo es tan eficaz como el medio secuecial. No obstante, los resultados obtenidos son
más bajos que los publicados anteriormente (24, 27).
Esto puede ser explicado por la selección de pacientes en este estudio y porque sólo se tuvieron en cuenta el porcentaje de embriones que llegaron a blastocisto con respecto a los fertilizados.
El éxito del cocultivo puede ser debido a la mezcla
de sustratos energéticos (piruvato, lactato y glucosa). Se
observó mejoría en el grupo en el que se cambiaba a
medio nuevo en día 3 (2º grupo de cultivo). Aún así, las
alteraciones genéticas afectan a la formación del balstocisto independientemente del medio de cultivo empleado (28, 29).
34 - Evolución de los medios de cultivo embrionario en TRA
COMPARACIÓN DE UN MEDIO DE
COCULTIVO CON UN MEDIO
SECUENCIAL
Es objetivo de la comparación es comprobar si los
nuevos medios disponibles en el mercado mejoran la
calidad embrionaria con respecto a los utilizados hasta ahora. Esta comparación se llevó a cabo para observar como se desarrollan los embriones en un medio libre de glucosa y fosfato (P1 Medium) con Cook
IVF Medium (añade la glucosa en fase de 2PN). En
este estudio todas las variables que tienen impacto en
los resultados de la FIV eran similares en ambos grupos (P1 Medium y Cook IVF Medium) (30). Se observó que los resultados eran similares con respecto a
la fertilidad y la morfología embrionaria. Las diferencias se apreciaban en el porcentaje de embriones que
alcanzaban el estadio de 4 células en el día +2, o 6
células en el día +3 (54,3% con P1 Medium vs 41,9%
con Cook). Igualmente, se obtuvo un mayor número
de embarazos clínicos e implantación con el medio libre de glucosa (P1 Medium) (30).
De Clerck et al., encontraron un retraso en la división de los embriones utilizando Cook IVF Medium
comparando con Menezo B2 Medium (31). De forma
similar se observó que utilizando G1.2 Medium se
obtenía una división más rápida que con Sydney IVF
Medium (32). Esta observación puede ser importante
porque los embriones que se dividen más rápidamente muestran una mayor tasa de implantación y una
mayor capacidad de llegar a blastocisto (33). Las diferencias observadas entre ambos medios puede deberse a la adición de glucosa o también la composición del suero añadido. A P1 medium se le añade
20% SSS (suero sintético sustitutivo) que contiene
5% de HSA y 1% de globulina humana, lo que equivale al 1% HSA del Cook. La presencia de globulina
con HSA consigue mayor tasa de desarrollo del embrión y embarazo (34-36).
COMPARACION DE TRES MEDIOS
SECUENCIALES
Los resultados obtenidos en un estudio prospectivo y randomizado muestran que los tres medios secuenciales estudiados son capaces de dar lugar a embriones viables, de buena calidad pero sin diferencias
significativas en cuanto a implantación y embarazo.
Aunque los parámetros obtenidos son similares, con
Medi-cult se obtiene los porcentajes más altos, especialmente en ciclos de FIV (37).
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Vitrolife
Medi-cult
Cook
% embarazo
30,7%
40,5%
25,8%
% implantación
14,3%
18,5%
13,5%
Vitrolife
Medi-cult
Cook
ICSI
37,5%
32%
21,4%
FIV
16,7%
52,9%
29,4%
% embarazo
CONCLUSIÓN
Una de las principales causas de fallos de implantación en Técnicas de Reproducción se debe a desfase
temporal existente en el momento de realizar la transferencia de embriones cuando el endometrio todavía
no ha alcanzado su madurez funcional. Pese a la cantidad de estudios dedicados a elaborar un medio de
cultivo que permita mantener esos embriones hasta el
momento indicado, reproducir las condiciones naturales hasta ese día sigue siendo un tema comprometido
y difícil de resolver. Cocultivo y medios secuenciales
consiguen buenos resultados pero no se puede decantar claramente por alguno de ellos. El cocultivo aporta nutrientes esenciales como oligoelementos y hormonas, pero por otro lado puede provocar la
contaminación por patógenos. Los medios secuenciales están estandarizados y son de fácil manejo, aunque suponen un coste más elevado. Las distintas empresas comerciales tienen sus medios específicos los
cuales no revisten demasiadas diferencias ni obtienen
resultados muy distintos.
Es por tanto fundamental proseguir las investigaciones en este sentido hasta obtener un medio de cultivo
que mantenga los embriones más allá de lo conseguido
hasta ahora. Todo ello en aras de evitar el desfase que
actualmente tenemos a la hora de transferir, aumentando a la tasa de implantación y de embarazo.
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