Download Implicación del gen PSY en la biosíntesis de carotenoides en

ACTAS DE HORTICULTURA Nº 60
Implicación del gen PSY en la biosíntesis de carotenoides en cultivares
de calabacín
A. Obrero1, J.V. Die2, B. Román1, P. Gómez3, S. Nadal1 y C.I. González-Verdejo1
1
IFAPA, Centro Alameda del Obispo, Área de Mejora y Biotecnología, Apdo. 14004 Córdoba, España
CSIC, Instituto de Agricultura Sostenible, Mejora Genética Vegetal, Apdo. 14004 Córdoba, España
3
IFAPA, Centro La Mojonera, Área de Mejora y Biotecnología, Autovía del Mediterráneo sal. 420. E04745. La Mojonera. Almería, España
2
Palabras clave: Cucurbita pepo, PCR cuantitativa, carotenogénesis
Resumen
Los carotenoides son compuestos isoprenoides responsables de la coloración
característica de muchos frutos, entre ellos los del género Cucurbita. Estos
pigmentos naturales tienen una gran relevancia nutricional, ya que muchos de
ellos son precursores de la vitamina A, poseen una significativa actividad
antioxidante y muestran propiedades preventivas frente a diferentes
enfermedades. El objetivo general de este trabajo es el estudio de los genes
implicados en la biosíntesis de carotenoides en tres variedades contrastantes de
calabacín. Con el fin de estudiar los mecanismos de regulación implicados, se
clonaron siete genes de la ruta biosintética principal (PSY, PDS, ZDS, CRTISO,
LCYb, LCYe y CHYb) y dos genes de la ruta MEP (DXS, HDR), involucrados en las
reacciones de sustratos iniciales. Este es el primer estudio que proporciona
información sobre la expresión de los genes implicados en la biosíntesis de
carotenoides en calabacín.
INTRODUCCIÓN
Los carotenoides son pigmentos naturales ampliamente distribuidos entre los
seres vivos. Se acumulan dando color en muchos órganos vegetales como frutas, raíces,
flores, además de encontrarse en organismos tan variados como pescados, invertebrados
pájaros e incluso las algas, bacterias, hongos y levaduras (Britton et al., 2004). En las
plantas, los carotenoides son sintetizados y almacenados en los plastidios (Cunningham
2002) y juegan un papel fundamental en el desarrollo vegetal realizando funciones
esenciales como precursores de hormonas básicas o contribuyendo a la adaptación
ambiental en el proceso de la fotosíntesis disipando el exceso de energía lumínica.
Debido a las propiedades antioxidantes de estos pigmentos y a su eficacia en la
prevención de ciertas enfermedades del ser humano, se ha incrementado notoriamente
su interés desde un punto de vista nutricional. Los avances en el estudio de estos
compuestos, principalmente en la manipulación genética de plantas, están dirigidos a
aumentar su contenido en los alimentos, ya que los humanos no pueden sintetizarlos y
deben ser adquiridos a través de la dieta (Fraser and Bramley 2004). Los genes
implicados en la biosíntesis de carotenoides han sido extensamente estudiados en el
reino vegetal y la ruta biosintética está muy conservada en plantas (Hirschberg 2001).
En nuestro estudio hemos llevado a cabo la identificación de nueve genes de la ruta
biosintética de carotenoides y el análisis de la regulación transcripcional de estos genes
en diferentes órganos vegetales de tres variedades de Cucurbita pepo L. con diferencias
en la coloración de la piel y la carne con el objetivo de analizar los patrones de
84
MEJORA GENÉTICA VEGETAL
expresión de cada gen y estudiar los mecanismos de regulación implicados en el
contenido de carotenoides en calabacín.
MATERIAL Y MÉTODOS
Se utilizaron tres cultivares contrastantes de la especie C. pepo: UPV196 de
fruto de color blanco, que corresponde a C. pepo ssp ovifera 'Scallop' (COMAV),
MU_CU16 de fruto de color verde, que corresponde a C. pepo ssp pepo (COMAV) y cv
Parador de fruto de color amarillo, que corresponde a C. pepo ssp pepo (Gautier). Se
tomaron muestras de diferentes tejidos (hoja, flor y fruto) y cinco estadios de desarrollo
del fruto (diferenciando exocarpo y mesocarpo). La recolección del material vegetal se
llevó a cabo en el centro IFAPA “La Mojonera”, Almería.
Extracción de ARN y síntesis de ADN copia
Se realizó la extracción de ARN para 36 muestras con TRIsure (Bioline) según
las instrucciones del fabricante. Una vez aislado el ARN se determinó la concentración
y pureza con un espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific). Para las
mismas también se determinó la integridad del ARN mediante electroforesis
microcapilar con Experion (BIO-RAD Laboratories). Para cada muestra se realizó la
síntesis de ADN copia a partir de 1 #g de ARN total con el kit QuantiTec Reverse
Transcription (Qiagen).
Análisis con PCR cuantitativa
Se diseñaron cebadores degenerados para los genes fitoeno sintasa (PSY),
fitoeno desaturasa (PDS), z-caroteno desaturasa (ZDS), caroteno isomerasa (CRTISO),
licopeno "-ciclasa (LCYb) y licopeno $-ciclasa (LCYe) a partir de secuencias disponibles
en la base de datos del NCBI y a partir de la literatura (Kato et al., 2004). Para los genes
1-deoxi-D-xilulosa-5-fosfato reductoisomerasa (DXR), 1-hidroxi-2-metil-2(E)-butenil 4difosfato reductasa (HDR) y beta caroteno hidroxilasa (CHYb) se diseñaron cebadores
específicos a partir de la secuenciación del transcriptoma publicada recientemente por
Blanca et al. (2011). Una vez clonadas y obtenidas las secuencias se diseñaron
cebadores específicos para qPCR siguiendo los siguientes criterios: productos de
amplificación de 60 a 100 pb, temperatura de fusión (Tm) a 60ºC, porcentaje de GC
entre 40 y 65%. Los datos se analizaron usando el software v4.1 de Mx3000P
(Stratagene). Los niveles de expresión relativos para cada gen se determinaron a partir
del Cq (ciclo de cuantificación) usando como genes de referencia PP2A y EF1A
(Obrero et al., 2011). La eficiencia de la PCR se calculó mediante el algoritmo LinReg a
partir de la fase exponencial de cada curva de amplificación.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Todos los genes se expresaron en las tres variedades, incluida la variedad blanca
de calabacín. En general los niveles de expresión fueron aumentando en las tres
variedades conforme el fruto se fue desarrollando, a diferencia de los genes DXR y
CRTISO, cuyos transcritos presentaron bajos niveles sin apenas diferencias
significativas entre órganos y estadios de desarrollo en los tres cultivares. Sin embargo,
los genes LCYb y CHYb presentan un incremento en los niveles de expresión en hoja y
flor respecto al fruto, lo que indica diferencias en la regulación entre los distintos
órganos. Así ocurre en papaya con el gen LCYb, que muestra un patrón similar que en
calabacín (Skelton et al., 2006) que puede deberse a la implicación de esta enzima en la
conversión de #-caroteno a %-caroteno en el cloroplasto. Por otra parte, se han
encontrado diferencias en el patrón de expresión de los genes HDR, PDS, ZDS, LCYe en
85
ACTAS DE HORTICULTURA Nº 60
los tejidos de fruto, registrándose una mayor acumulación de sus transcritos en el
exocarpo que en mesocarpo.
En general, los mayores niveles de expresión para todos los genes se obtuvieron
para el cultivar naranja, destacando la evolución para el gen PSY en el mesocarpo (Fig.
1 y Fig. 2B). Si bien existen diferencias de coloración entre los mesocarpos de los
distintos cultivares, es en el exocarpo donde se encuentra un mayor contraste. Así, la
piel del fruto del cultivar parador presenta desde estadios iniciales coloración amarilloanaranjada junto con niveles elevados de transcritos de PSY que se mantendrán a lo
largo del desarrollo del fruto (Fig. 2A), pero este patrón difiere del de los cultivares
verde y blanco que acumulan transcritos mas tarde en el desarrollo. Sin embargo, en el
mesocarpo, que en estadios iniciales presenta escasa coloración, no se detectan niveles
apreciables de expresión de este gen en el inicio haciéndose éstos notables a lo largo del
desarrollo del fruto y coincidiendo con la ganancia de coloración de la carne del fruto
(Fig. 2B). El conocimiento de los mecanismos por los cuales la piel del cultivar naranja
es capaz de mostrar esta coloración desde estadios iniciales del desarrollo resulta de
gran interés para la mejora de la especie atendiendo a contenido en carotenoides
sobretodo si tenemos en cuenta que el calabacín se comercializa en estado inmaduro. Al
igual que resultados de estudios anteriores en otras plantas donde se ha demostrado que
este gen es un punto clave y regulatorio de la ruta biosintética, los resultados obtenidos
en este trabajo nos permiten proponer al gen PSY como buen candidato a participar en el
control del contenido final de carotenos en fruto de calabacín.
Por otra parte, la expresión diferencial de los genes carotenogénicos no
explicaría la ausencia de coloración en la variedad blanca por lo que la regulación a otro
nivel distinto de la ruta biosintética principal podría justificar este hecho. En este
sentido se están llevando a cabo paralelamente estudios de genes que codifican para las
enzimas de degradación de carotenoides (González-Verdejo et al., 2012 de este
volumen), observándose, que el transcrito del gen dioxigenasa de ruptura de
carotenoides CpCCD4 presenta niveles más altos en el cultivar blanco que en los
coloreados, y pudiendo, por lo tanto, estar implicado en la ausencia de color en Scallop.
Agradecimientos
Este trabajo ha sido financiado por el proyecto INIA-RTA 2011-00044-C02-01,
fondos FEDER y FSE (EU). JV. Die está financiado por el programa ‘Juan de la Cierva’
del Ministerio de Ciencia e Innovación. CI. González Verdejo disfruta de un contrato
INIA-CCAA (Subprograma DOC-INIA), que podrá ser cofinanciado en un futuro por el
FSE.
Referencias
Blanca, J., Canizares J., Roig, C., Ziarsolo P., Nuez, F. y Picó, B. 2011. Transcriptome
characterization and high throughput SSRs and SNPs discovery in Cucurbita pepo
(Cucurbitaceae). BMC Genom. 12:104.
Britton, G., Liaaen-Jensen, S. y Pfander, H. 2004. Carotenoids handbook. Basel:
Birkhauser Verlag AG.
Cunningham, F.X. 2002. Regulation of carotenoid synthesis and accumulation in plants.
Pure Appl. Chem. 74: 1409-1417.
Fraser, P.D. y Bramley, P.M. 2004. The biosynthesis and nutritional uses of
carotenoids. Prog. Lipid Res. 43: 228–265.
González-Verdejo, C.I., Obrero, A., Román, B., Nadal, S. y Gómez, P. 2012. Expresión
diferencial de genes dioxigenasa de ruptura de carotenoides en calabacín (Cucurbita
pepo). Actas de Horticultura
86
MEJORA GENÉTICA VEGETAL
Hirschberg, J. 2001. Carotenoid biosynthesis in flowering plants. Curr. Opin. Plant Biol.
4: 210–218.
Kato, M., Ikoma, Y., Matsumoto, H., Sugiura, M., Hyodo, H. y Yano, M. 2004.
Accumulation of carotenoids and expression of the carotenoid biosynthetic genes
during maturation in citrus fruit. Plant Physiol 134: 824-837.
Obrero, A., Die, J.V., Román, B., Gómez, P., Nadal, S. y González-Verdejo, C.I. 2011.
Selection of reference genes for gene expression studies in zucchini using qPCR. J
Agric Food Chem. 59: 5402-5411.
Skelton, R.L., Yu, Q., Srinivasan, R., Manshardt, R., Moore, P.H., Ming, R. 2006.
Tissue differential expression of lycopene "-cyclase gene in papaya. Cell Res. 16:
731-739.
10,0
Expresión relativa
8,0
Scallop
6,0
MU-CU16
Parador
4,0
2,0
0,0
F FA
H
O E 3 M3 E 5 M5 E 7 M7 E 20 20
M
Fig. 1. Expresión relativa en tres variedades de calabacín del gen
PSY. El análisis se ha llevado a cabo en flor antes de antesis
(F), flor en antesis (FA), hoja (H), ovario (O), exocarpo (E) y
mesocarpo (M) a los 3, 5, 7 y 20 días después de la
polinización (E3, M3, E5, M5, E7, M7, E20, M20). Las barras
de error representan la desviación estándar de las tres
repeticiones.
Fruto-Mesocarpo
Fruto-Exocarpo
Expresión relativa
10
9
10
A
9
8
7
6
5
4
3
2
8
7
6
B
b
5
4
3
2
1
1
0
0
E3
E5
E7
E20
M3
M5
M7
M20
Fig. 2. Expresión relativa de PSY en exocarpo (A) y mesocarpo
(B) de fruto dentro del cultivar parador (naranja) a los 3, 5, 7
y 20 días después de la polinización.
87