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SUMARIO Sumario La enfermedad celiaca es un desorden de carácter genético cuya etiología se atribuye tanto a múltiples factores genéticos como a factores medioambientales. El principal factor medioambiental conocido que desencadena la enfermedad es una proteína llamada gluten que se encuentra en cereales comunes como el trigo, la cebada y el centeno. Esta proteína permite la germinación de las semillas y gracias a ella se pueden elaborar productos derivados de sus harinas como el pan o la pasta. Los desencadenantes genéticos de la enfermedad conocidos hasta el momento son los genes localizados en el cromosoma 6, responsables de la codificación de las moléculas HLA-DQ2/-DQ8, y el gen que codifica la miosina 9B (MYO9B) y que se encuentra en el cromosoma 19. Las manifestaciones clínicas de esta enfermedad incluyen una amplia variedad de síntomas que van desde diarrea, mala absorción o retraso en el crecimiento ponderal del niño, hasta fatiga, anemia, pérdida de peso o formas totalmente asintomáticas. Hoy en día, el único tratamiento consiste en una dieta permanente sin gluten. La enfermedad celiaca comienza cuando un individuo con la correcta predisposición genética ingiere gluten y éste entra en su organismo a través de la mucosa de su intestino delgado. Allí el gluten activa una respuesta inmune anormal que va a desencadenar una serie de cambios histológicos conocidos y que consisten en linfocitosis (estadio I; Marsh I), hiperplasia de las criptas (estadio II; Marsh II) y atrofia de las vellosidades intestinales (estadio III; Marsh III). Es sabido que estos cambios ocurren siempre en este orden y según criterios diagnósticos internacionales, sólo individuos que presentan este tercer estadio son considerados enfermos celiacos. En los últimos años, nuestro conocimiento sobre la patogenia de la celiaca ha aumentado considerablemente. Sabemos que el gluten es capaz de activar tanto la respuesta inmune adaptativa como la innata. A pesar de ésto, los mecanismos intrínsecos de esta respuesta inmune y los mecanismos moleculares responsables del daño en la mucosa intestinal no son bien conocidos (capítulo 1 y 2). El trabajo descrito en esta tesis revela nuevos hallazgos sobre los mecanismos moleculares que dirigen la respuesta inmune adaptativa e innata, así como las alteraciones de la mucosa. Como consecuencia, estos nuevos conceptos sobre la pato-fisiología de la enfermedad celiaca enfocan la búsqueda de genes candidatos que predisponen a desarrollar esta enfermedad. El capítulo 3 describe los cambios transcripcionales que ocurren en el intestino de los pacientes celiacos con atrofia intestinal (estadio III; Marsh III) cuando se les compara con controles. Para ello comparamos los patrones de expresión de 15 biopsias de enfermos celiacos en el estadio III de la enfermedad y 7 controles en un microarray con 19,500 genes. El primer análisis de estos experimentos reveló un primer grupo de 109 genes implicados en la destrucción del intestino a largo plazo. Una gran parte de estos genes se encuentran relacionados con los procesos de proliferación y diferenciación que tienen lugar en las criptas y las vellosidades y que contribuyen al mantenimiento de las mismas. Este hallazgo fue corroborado por un segundo análisis en el que comparamos los patrones de expresión de pacientes que presentan atrofia intestinal ocasionada por la presencia de gluten en la dieta, con los de pacientes que aún presentan alteraciones histológicas a pesar de seguir una dieta sin gluten, pero con mejoría clínica. De este modo, encontramos un grupo de 120 genes que revelan un descenso de la actividad mitótica en pacientes que siguen una dieta sin gluten. 113 Sumario Basándonos en estos resultados, proponemos que los procesos independientes de hiperplasia de las criptas y atrofia de las vellosidades están molecularmente entrelazados y planteamos la hipótesis de que una deficiencia en la finalización de la diferenciación terminal de las células epiteliales y su migración es la responsable de la formación de criptas hiperplásticas y, consecuentemente, de la atrofia vellositaria. A continuación, llevamos a cabo un segundo microarray con el fin de determinar los cambios transcripcionales de genes relacionados con la respuesta inmune durante la recuperación de la mucosa. Como es descrito en el capítulo 4, 66 biopsias de individuos celiacos en remisión y agrupados según las características histológicas de su intestino, fueron elegidos para determinar la evolución temporal virtual de los genes expresados durante la regeneración tisular. Esto nos permitió determinar tanto los genes diferencialmente expresados y con una función en la respuesta inmune como los cambios dinámicos de su patrón de expresión durante el proceso de regeneración. Los resultados de este experimento mostraron que los patrones de expresión de los genes diferencialmente expresados tienen un aumento o una disminución gradual desde el momento en el que comienza el tratamiento con la dieta hasta la completa recuperación del intestino. Por lo tanto, esta observación no refleja como independientes los estadios que clasifican la enfermedad y que son usados para su diagnóstico (Marsh III). Estos resultados indican que a pesar de las diferencias histológicas, los pacientes en el primer y segundo estadio (Marsh I y II) no son diferenciables molecularmente de pacientes en el último estadio (Marsh III). Por ello, proponemos que individuos en el estadio I y II deberían ser considerados como enfermos celiacos siempre que respondan favorablemente al tratamiento con una dieta sin gluten. La clasificación de los genes diferencialmente expresados como parte de la respuesta inmune adaptativa o innata, mostró que ambas respuestas están igualmente representadas en los resultados. Además, estos resultados sugirieron que el interferón gamma es el responsable del mantenimiento crónico de la respuesta inmune adaptativa mediante la activación de la cascada JAK-STAT1 y consecuentemente, de la inducción de la transcripción de quemoquinas y citoquinas que atraen y activan la respuesta adaptativa Th1. Con relación a la respuesta inmune innata, los estudios de expresión génica evidenciaron el reclutamiento de neutrófilos en la lámina propia. Estos resultados fueron corroborados en estudios de inmunohistoquímica en los que un anticuerpo específico para neutrófilos fue usado en biopsias de Marsh III y pacientes celiacos totalmente recuperados (Marsh 0). Estos experimentos indicaron que los individuos celiacos tienen un estado permanente de activación de la respuesta innata en la lámina propia y que es independiente de la presencia o ausencia del gluten en la dieta o del grado de daño tisular. Basándonos en esta observación, llegamos a la hipótesis de que esta infiltración de neutrófilos podría ser el reflejo del efecto causal del gen de la miosina 9B. La miosina 9B podría estar involucrada en la discapacidad de la barrera intestinal y por tanto ser responsable del aumento en la permeabilidad que padecen los individuos celiacos. La integración de los resultados de los estudios de expresión y de los estudios de ligamiento, junto con el conocimiento de la patogenia de la celiaca, nos llevó a proponer dos genes candidatos funcionales que fueron investigados en estudios de asociación genética (capítulos 5 y 6). El primer gen codifica una enzima llamada proly-endopeptidasa (PREP) que es capaz de fragmentar péptidos del gluten enriquecidos con residuos de prolina. Para la realización 114 Sumario de este estudio, partimos de la hipótesis de que la actividad alterada de esta enzima podría ser responsable de una fragmentación incompleta del gluten, dando lugar a la acumulación de péptidos de gluten capaces de activar la respuesta inmune y por tanto, participar en la pérdida de tolerancia oral al gluten. Para investigar la contribución de PREP como gen causal en la enfermedad celiaca, también llevamos a cabo estudios de secuenciación y de determinación de la actividad de la enzima. Los resultados de los estudios genéticos de asociación y la determinación de la actividad enzimática indicaron que PREP no es un gen causal en la población celiaca holandesa (capítulo 5). El capítulo 6 describe el estudio genético de asociación realizado en el gen candidato funcional y posicional, el factor de transcripción y activador de transcripción 1 (STAT-1), localizado en el pico de ligamiento del cromosoma 2. Este gen codifica uno de los moduladores más importantes de la actividad del interferón gamma. Basándonos en esta información, especulamos que cambios genéticos que diesen lugar a un cambio en la actividad transcripcional de este gen podrían explicar el efecto nocivo de la respuesta inmune que se activa en la celiaca. Sin embargo, no observamos evidencia de una asociación genética significativa en la población celiaca holandesa. En conclusión, los estudios de expresión génica realizados en este estudio usando biopsias de individuos que padecen la enfermedad celiaca y controles de las mismas, han dado lugar a la identificación de nuevos procesos que intervienen en la patogenia de esta enfermedad. Además, hay que tener en cuenta que la integración de información genética y genómica será clave para desarrollar nuevos métodos de diagnóstico, para identificar individuos con riesgo de desarrollar la enfermedad y nuevas formas de intervención terapéutica en la enfermedad celiaca. 115