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DISTRIBUCIÓN DEL VIRUS DE LA TRISTEZA EN TRES PLANTACIONES COMERCIALES DE CÍTRICOS DEL ESTADO DE NUEVO LEÓN, MÉXICO DISTRIBUTION OF CITRUS TRISTEZA VIRUS IN THREE COMMERCIAL GROVES IN NUEVO LEÓN, MÉXICO Sergio Silva-Vara1, María de los Angeles Peña del Río1, Rebeca Peña-Martínez2, Nancy Villegas-Jiménez2, Keir F. Byerly-Murphy3 y Mario A. Rocha-Peña4 1 INIFAP. Campo Experimental General Terán. Apartado Postal 3. General Terán, Nuevo León. 67400 México. 2Departamento de Zoología. ENCB/IPN. Prolongación Carpio y Plan de Ayala. Colonia Santo Tomás. 11340 México D. F. 3INIFAP-CIRPAC. Dirección Agrícola. Apartado Postal 6-163. Guadalajara, Jalisco. 44660 México. 4INIFAP. Unidad de Investigación en Biología Celular y Molecular. Apartado Postal 128-F. Ciudad Universitaria. San Nicolás de los Garza, Nuevo León. 66450 México. (mrocha@ccr.dsi.uanl.mx) RESUMEN ABSTRACT Se llevó a cabo un estudio para determinar la ocurrencia del virus de la tristeza (CTV) en plantaciones comerciales de cítricos en el Estado de Nuevo León, México. La detección del CTV se realizó mediante la prueba de ELISA utilizando anticuerpos policlonales anti-CTV, y mediante el anticuerpo monoclonal MCA13 de reacción específica. El estudio se llevó a cabo en tres huertas en los municipios de Montemorelos, Hualahuises y Linares, con ocurrencias iniciales en porcentajes de 4.34 (34 de 783), 0.02 (1 de 4543) y 0.70 (12 de 1704), respectivamente. Se obtuvo una reacción positiva al anticuerpo monoclonal MCA13 de reacción específica en 35 de los 47 aislamientos del CTV detectados. En un muestreo permanente realizado dos veces al año, de 1996 a 1998, se encontró un incremento en la ocurrencia del CTV de 0.27 y 0.18%, en las plantaciones de Montemorelos y Linares, respectivamente. No se detectaron árboles adicionales infectados por el CTV en la huerta del municipio de Hualahuises. Se identificaron los áfidos vectores Aphis gossypii Glover, A. spiraecola Patch y Toxoptera aurantii B. de F. en todas las plantaciones muestreadas. No se encontraron evidencias de la presencia del vector más eficiente del CTV, el áfido pardo Toxoptera citricida (Kirkaldy). No se obervó ninguno de los síndromes asociados al CTV en los árboles encontrados CTV positivos en el estado de Nuevo León, no obstante del uso generalizado del portainjerto naranjo agrio en toda la industria citrícola del Estado. A survey to determine the occurrence of citrus tristeza virus (CTV) was carried out in commercial citrus groves in the northeastern state of Nuevo León, México. CTV detection was performed by ELISA using anti-CTV specific polyclonal antibodies and the strain specific MCA13 monoclonal antibody. The study was conducted in three citrus groves in the municipalities of Montemorelos, Hualahuises and Linares, with initial CTV incidences of 4.34% (34 out of 783), 0.02% (1 out of 4543) and 0.70% (12 out of 1704), respectively. There was a positive reaction with the severe strain specific MCA13 monoclonal antibody in 35 out of the 47 CTV positive samples. A permanent survey twice a year during 1996-1998 showed an increase in CTV occurrence of 0.27 and 0.18%, in the groves of Montemorelos and Linares, respectively. No CTV spread was detected in the grove of Hualahuises. CTV vectors Aphis gossypii Glover, A. spiraecola Patch and Toxoptera aurantii B. de F. were common in all the groves monitored for aphids. The most efficient insect vector of CTV, the brown citrus aphid, Toxoptera citricida (Kirkaldy). It was not found in any of the surveyed groves. None of the disease syndromes associated with CTV was noticed in any of CTV infected trees, even though sour orange is predominant in the whole citrus industry of the state. Key words: Citrus aurantium, ELISA, epidemiology, insect vectors, sour orange. Palabras clave: Citrus aurantium, ELISA, epidemiología, insectos vectores, naranjo agrio. INTRODUCTION INTRODUCCIÓN C itrus tristeza virus (CTV) is distributed worldwide and causes one of the most destructive diseases in citrus (Rocha-Peña et al., 1995). CTV in México has not caused noticeable effects on the citrus industry yet; however, the use of sour orange (Citrus aurantium L.) as the predominant rootstock in most of the citrus groves, along with the large areas of Mexican lime {Citrus aurantifolia (Christm.) Swingle} planted in the Pacific coast region, E l virus de la tristeza (CTV) tiene distribución mundial y ocasiona una de las enfermedades más destructivas en el cultivo de los cítricos (RochaPeña et al., 1995). En México el CTV todavía no ha ocasionado daños a la citricultura; sin embargo, la Recibido: Marzo, 2000. Aprobado: Mayo, 2001. Publicado como ENSAYO en Agrociencia 35: 441-450. 2001. 441 442 AGROCIENCIA VOLUMEN 35, NÚMERO 4, JULIO-AGOSTO 2001 predominancia del portainjerto naranjo agrio (Citrus aurantium L.) en la mayoría de las plantaciones, así como las extensas áreas plantadas con lima mexicana {Citrus aurantifolia (Christm.) Swingle} en la Costa del Pacífico, lo hacen totalmente vulnerable al CTV. El estado de Nuevo León, ubicado en el noreste de México, tiene actualmente alrededor de 30 000 hectáreas de cítricos, plantadas principalmente con naranja tardía {Citrus sinensis (L.) Osb.}, y en menor proporción con naranjas tempranas y otras especies como toronja (Citrus paradisi (Metcaf.) y mandarina (Citrus reticulata Blanco); en ellas, el portainjerto predominante es el naranjo agrio. Las heladas ocurridas en los años 1983 y 1989 dañaron las plantaciones, por lo que una gran cantidad de citricultores las rehabilitaron con material de propagación traído del estado de Veracruz, donde en 1992 y 1993 se encontraron focos de infección del CTV en viveros comerciales. Debido a lo anterior, durante 1995 se efectuó un muestreo para la detección del CTV en el estado de Nuevo León, encontrando 47 plantas positivas al CTV de un total de 18 950 árboles evaluados (0.25% de ocurrencia). Las 47 plantas CTV positivas se encontraron en tres huertas ubicadas en los municipios de Montemorelos (34 de 783= 4.34%), Hualahuises (1 de 4543=0.02%) y Linares (12 de 1704=0.70%) (Rocha-Peña et al., 1996)5. En este trabajo se presentan resultados de ocurrencia del CTV en tiempo y espacio en tres huertas con antecedentes de infección por el CTV, así como de la fluctuación poblacional de áfidos vectores. Se partió de las siguientes hipótesis: 1) Existen en el estado de Nuevo León aislamientos del CTV del tipo declinamiento en la combinación dulce/ agrio, pero sin manifestar aún su efecto detrimental en el cultivo. 2) Los aislamientos del CTV presentes en el estado de Nuevo León son transmisibles en forma eficiente por poblaciones locales de áfidos. 3) Existen en el estado de Nuevo León aislamientos del CTV de naturaleza débil en la combinación dulce/agrio, que pueden ser útiles en programas futuros de protección cruzada. MATERIALES Y MÉTODOS Área de estudio Este estudio se llevó a cabo en tres huertas de cítricos con antecedentes de tener árboles CTV positivos. Durante los años 1996, 1997 y 1998 se analizaron en forma individual cada uno de los árboles presentes en las tres huertas bajo estudio. La huerta Ojo de Agua está ubicada aproximadamente a 8 km al noreste de la cabecera municipal de Montemorelos, compuesta por un total de 783 árboles de naranja dulce de la variedad Valencia con árboles aislados de variedades tempranas y Washington Navel. La huerta El Roble está ubicada aproximadamente 5 makes the whole industry highly vulnerable to CTV. In the northeastern state of Nuevo León, there are approximately 30,000 hectares of citrus, planted mostly with Valencia sweet orange {Citrus sinensis (L.) Osb.}, but with small plantings of some early-bearing sweet oranges and some other species such as grapefruit (Citrus paradisi (Metcaf.) and tangerine (Citrus reticulata Blanco). In most of them, the predominant rootstock is sour orange. The frosts in 1983 and 1989, severely damaged the citrus groves so that many of the citrus growers rehabilitated their groves with propagative budwood brought from the state of Veracruz, where, in 1992 and 1993, some CTV infected material was detected in commercial citrus nurseries. For that reason, a survey was conducted during 1995 in the state of Nuevo León, where 47 CTV infected plants were found out of 18,950 surveyed trees (0.25% occurrence). The 47 CTV positive plants were located in three selected groves in the municipalities of Montemorelos (34 out of 783=4.34%), Hualahuises (1 out of 4543=0.02%) and Linares (12 out of 1704=0.70%) (Rocha-Peña et al., 1996)5. The current paper presents results of the spatial and temporal distribution of CTV in three commercial groves, as well as the dynamics of aphid populations. The work is based on the following hypotheses: 1) In the state of Nuevo León there are decline inducing CTV isolates on the sweet/sour combination, but in symptomless condition. 2) Field CTV isolates are efficiently transmitted by the local aphid populations. 3) In the state of Nuevo León there are mild CTV isolates on the sweet/sour combination that might have potential use in future cross-protection programs. MATERIAL AND METHODS Area of survey The current work was carried out in three commercial groves with records of CTV infected trees. During 1996, 1997, and 1998, every individual tree in each grove was analyzed for the presence of the virus. The Ojo de Agua grove is located approximately 8 km northeast from the Montemorelos municipality, and it has 783 Valencia sweet orange trees with some scattered Washington Navel and other early bearing sweet orange cultivars. The El Roble grove is located approximately at a distance of 5 km on the side road toward Las Lajas creek in the municipality of Hualahuises. It has 4543 trees of sweet oranges with a predominance of the Valencia cultivar. The Toro Pinto grove is located approximately 8 km from the Linares municipality on the side road leading to La Escondida, and has 1704 trees of mostly Valencia sweet orange. The three of them are adult Rocha-Peña, M. A., S. Silva-Vara, y J. P. Martínez-Soriano. 1996. Presencia del virus de la tristeza en plantaciones comerciales de cítricos del estado de Nuevo León, México. Memorias XXIII Congreso Nacional de Fitopatología. Guadalajara, Jalisco. México. SILVA-VARA et al.: VIRUS DE LA TRISTEZA EN CÍTRICOS EN NUEVO LEÓN en el km 5 del camino vecinal al arroyo Las Lajas que sale al noreste de la carretera nacional en el municipio de Hualahuises. Está compuesta por un total de 4543 árboles de naranja dulce, con predominio de la variedad Valencia. La huerta Toro Pinto está ubicada aproximadamente a 8 km del municipio de Linares sobre el camino vecinal a la Escondida, y está compuesta por 1704 árboles en su mayoría de naranja Valencia. Las tres huertas bajo estudio son huertas adultas, de entre 30 y 35 años de edad, y tienen una distancia de plantación de 8x8 m, y de aquí en adelante se referirá a ellas por el nombre del municipio donde se localizan. Colecta y preparación de tejido La colecta de tejido de cítricos se llevó a cabo siguiendo la metodología de Padrón-Chávez y Rocha-Peña, 19936, durante las brotaciones de otoño-invierno (septiembre-febrero) y primavera (marzo-abril) de los años 1996 a 1998. De cada árbol se cortaron de 8 a 10 brotes tiernos que tuvieran las hojas recién expandidas, se colocaron en bolsas de polietileno, se etiquetaron y se trasladaron al laboratorio en recipientes con hielo y protegidos del sol. De cada muestra se separó la corteza y los pecíolos y nervadura central de las hojas y se cortó en porciones de aproximadamente 1-2 mm2. El tejido se dejó secar a temperatura de laboratorio durante 48 a 72 hr, se empaquetó en porciones de 4 a 5 gramos en papel secante y se almacenó en refrigeración por un máximo de 2 semanas antes de su análisis. Pruebas serológicas El análisis de las muestras se llevó a cabo en el Laboratorio Acreditado para Diagnóstico del VTC, ubicado en las instalaciones del Campo Experimental General Terán del INIFAP. Se utilizó la técnica serológica de inmunoadsorción ligada a enzima (ELISA) en su modalidad de anticuerpo de doble sandwich indirecto (Bar-Joseph y Malkinson, 1980; Rocha-Peña et al., 1991) con anticuerpos RbB227 desarrollados en dicho laboratorio. Como anticuerpos intermedios se emplearon la mezcla de anticuerpos monoclonales 3DF1 y 3CA5 de reacción poliespecífica adquiridos de Ingenasa (España). Para el análisis de severidad se utilizó el anticuerpo monoclonal MCA13 proporcionado por el Dr. T. A. Permar, del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, con sede en Orlando Florida. El tejido, antes de su análisis, se molió en un homogeneizador Tekmar Mark II en presencia de solución de extracción PBS-Tween+2% polyvinyl pyrrolidone (Sigma PVP-40) {PBS=8 mM Na2HPO4, 14 mM KH2PO4, 15 mM NaCl, pH 7.4, (+0.1% Tween 20)} a una concentración de 1:10 (peso/volumen). En todo el trabajo se utilizaron placas de microtilulación de poliestireno Immulon II (Dynatech Laboratories). Inicialmente se utilizaron 200 ml por pocillo para el tapizado de las placas; mientras que en todos los pasos subsecuentes se utilizaron 190 ml por pocillo. Asimismo, todas las incubaciones se llevaron a cabo a 4-5 ºC durante 18 hr y entre cada paso de incubación se llevaron a cabo tres 6 443 groves with 30 to 35-year-old trees at a spacing of 8x8 m, which from now on will be named according to the municipality where each one is located. Tissue collection and sample preparation Citrus tissue was collected following the methodology of PadrónChávez and Rocha-Peña 19936, in the fall-winter (September-February) and spring (March-April) budding periods of 1996 to 1998. Eight to ten tender shoots with fully expanded leaves were collected from every tree, placed in plastic bags, labeled and taken to the laboratory in ice boxes. In each sample bark tissue was peeled, midribs and petioles of leaves were excised and finely chopped in portions of about 1-2 mm2. The tissue was dried at room temperature for 48-72 hr, wrapped in paper towels (portions of 4-5 g) and kept at 5 oC for two weeks previous to the analysis. Serological tests The samples were analyzed at the certified laboratory for CTV detection located at the General Terán Experiment Station of INIFAP. The serological technique of enzyme-linked immuno-adsorption (ELISA) was used in its modality of indirect double sandwich antibody (Bar-Joseph and Malkinson, 1980; Rocha-Peña et al., 1991) with polyclonal RbB227 antibodies, produced in our laboratory. A mixture of the 3DF1 and 3CA5 monoclonal antibodies of poly-specific reaction purchased from Ingenasa (Spain) was used as intermediate antibodies. The MCA13 antibody, provided by Dr. T.A. Permar, United States Department of Agriculture, Orlando Florida, was used for strain discrimination. Before the analysis, the citrus tissue was homogenized with a Tekmar Mark II Tissumizer in extraction buffer PBS-Tween+2% polyvinyl pyrrolidone (Sigma PVP-40) {PBS=8 mM Na2HPO4, 14 mM KH2PO4, 15 mM NaCl, pH 7.4, (+0.1 % Tween 20)} at a 1:10 (weight/ volume) concentration. Polyestyrene Immulon II microtiter plates (Dynatech Laboratories) were used throughout the work. Two hundred µl per well were used to coat the microtiter plates; all subsequent steps were conducted by using 190 µl per well. Likewise, all incubation steps were carried out at 4-5 ºC during 18 hr, and between incubation steps, three washings with PBS-Tween were applied to the plates. The RbB227 coating antibody was used at 3.0 µg ml-1 in carbonate buffer (0.015 M NaHCO3, 0.03 M NaCO3, pH 9.6). The mixture of 3DF1 and 3CA5 monoclonal antibodies was used at 0.2 µg-1 ml in extracting buffer+0.02% bovine serum albumin (BSA) (Sigma A9647). Goat anti mouse with alkaline phosphatase (Sigma A4937) was used at a dilution of 1:30,000. At the end of the test, 1 mg ml-1 of p-nitrophenyl phosphate (Sigma N2765) in 10% triethanolamine, pH 9.8 was added. Negative controls included PBS-Tween, extraction buffer, extraction buffer+0.02% BSA and healthy extract tissue of Mexican lime grown in the greenhouse. Tissue extract of Mexican lime, infected with the CTV isolates from Güémez, Padrón-Chávez, J. E. y M. A. Rocha-Peña. 1993. Cómo colectar y preparar muestras de cítricos para el análisis del virus de la tristeza mediante la técnica “ELISA”. Desplegable No. 12. Campo Experimental General Terán. INIFAP/SARH. México. 444 AGROCIENCIA VOLUMEN 35, NÚMERO 4, JULIO-AGOSTO 2001 lavados de placas con PBS-Tween. El anticuerpo RbB227 de tapizado se utilizó a una concentración de 3.0 mg ml-1 disuelto en solución amortiguadora de carbonatos (0.015 M NaHCO3, 0.03 M NaCO3, pH 9.6). La mezcla de anticuerpos monoclonales 3DF1 y 3CA5 se utilizó a una concentración de 0.2 mg ml-1 en solución amortiguadora de extracción+0.02% de albúmina de suero bovino (BSA) (Sigma A9647). Como conjugado enzimático se utilizó anticuerpo de cabra anti-ratón (Sigma A4937) en dilución 1:30,000. Al final de la prueba se añadió 1 mg ml-1 de p-nitrofenil fosfato (Sigma N2765) disuelto en 10% trietanolamina, pH 9.8. Como controles negativos se utilizaron PBS-Tween, solución de extracción, solución de extracción+0.02% de BSA y extractos de tejido sano de limón mexicano crecido en invernadero. Como testigo positivo se utilizaron extractos de tejido de limón mexicano infectado con el aislamiento del CTV de Güémez, Tamaulipas (Vela-Mancilla, 1984)7 mantenido en invernadero. Las lecturas de densidad óptica a 405 nm (OD405) se efectuaron en un espectrofotómetro BioTek Modelo EL311 después de 30 a 60 minutos de reacción. Se consideraron como reacciones positivas al CTV las que mostraron valores de OD405 mayores a 0.100 ó 3 veces el valor de la media mostrada por el tejido sano (testigo negativo), el que fuera mayor. En forma rutinaria, en todos lo casos en que se obtuvieron resultados positivos para la presencia del CTV en las muestras analizadas, se llevó a cabo una segunda prueba de ELISA con las mismas muestras y se verificó una tercera vez con muestras colectadas de nuevo en el campo. Para las pruebas serológicas con el anticuerpo monoclonal MCA13 (Permar et al., 1990), se utilizó éste en dilución 1:5000 de líquido de ascites en solución de extracción+0.02% BSA. El resto de la prueba fue similar a lo descrito anteriormente. Tamaulipas (Vela-Mancilla, 1984)7 was used as positive control. Optical density readings at 405 nm (OD405) were conducted in a BioTek Model EL311 plate reader after 30-60 min of reaction. Reactions were considered positive to CTV when OD405 values were higher than 0.100 or three times the mean of healthy samples (negative controls), whichever was greater. Routinely, when a sample had a positive value for the presence of CTV, a second ELISA test was made with the same sample, and the result was verified a third time with fresh tissue collected from the same tree in the field. Serological tests with MCA13 monoclonal antibodies (Permar et al., 1990), were conducted with ascites fluid diluted 1:5,000 in extraction buffer+0.02% BSA. The rest of the test was as previously described. Aphid sampling and identification Aphid species and their seasonal fluctuations were determined by using yellow water pan traps and collected directly from the foliage. Initially four yellow traps were placed at 1.60 m height, at four cardinal points at the General Terán Experimental Station of INIFAP from March 1996 throughout May 1997. Afterwards, during 1997 and 1998 four yellow traps were placed in each grove under study. Aphid specimens were preserved in alcohol and shipped to the Entomology Laboratory of ENCB, where they were identified using several taxonomic aphid keys (Peña-Martínez, 1992; Stoetzel, 1994) and verified by R. Peña-Martínez. RESULTS Spatial and temporal occurrence of CTV Colecta e identificación de áfidos Las especies de áfidos y su fluctuación poblacional se determinaron mediante trampas amarillas con agua y directamente sobre el follaje. Inicialmente se colocaron cuatro trampas amarillas a 1.60 m de altura, que permanecieron ubicadas en cuatro puntos del Campo Experimental de General Terán, Nuevo León (INIFAP) de marzo de 1996 a mayo de1997. Posteriormente, durante 1997 y 1998 se colocaron cuatro trampas amarillas en cada una de las huertas bajo estudio. Los especímenes fueron conservados en alcohol y enviados al Laboratorio de Entomología de la ENCB, donde fueron separados individualmente e identificados con diversas claves taxonómicas de áfidos (PeñaMartínez, 1992; Stoetzel, 1994) y confirmados por R. Peña-Martínez. RESULTADOS Ocurrencia del CTV en tiempo y espacio Se partió de una ocurrencia inicial de plantas infectadas con CTV de 4.34% (34 de 783) para la huerta de The spatial and temporal analyses started from an initial CTV occurrence of 4.34% (34 out of 783) for the Montemorelos grove, 0.02% (1 out of 4543) in Hualahuises and of 0.70% (12 out of 1704) for Linares, respectively (Rocha-Peña et al., 1996) (Table 1). In fall 1997, an additional infected tree was found in the Montemorelos grove for an increase of 0.27% (Figure 1, Table 1). In fall 1996, three additional infected trees and one more in spring 1998 were found in the Linares grove, giving an increase of 0.18 and 0.01% in three years (Figure 2, Table 1). No additional infected tree was found in the Hualauises grove. It is worth mentioning that in the Linares grove, two of the three infected trees detected in fall 1996, were actually reset nursery trees of undetermided origin. The other two, the one detected in fall 1996, as well as the one in spring 1998, were adult trees. None of the disease syndromes associated to CTV (Rocha-Peña et al., 1995) was noticed in any infected tree, throughout the survey. 7 Vela-Mancilla, M. C. 1984. Detección del virus de la tristeza de los cítricos en los bancos de germoplasma de cítricos de México mediante la técnica de inmunoadsorción ligada a enzima. Tesis Profesional. Químico Bacteriólogo Parasitólogo. Universidad Autónoma de Nuevo León. Monterrey, México. SILVA-VARA et al.: VIRUS DE LA TRISTEZA EN CÍTRICOS EN NUEVO LEÓN Montemorelos, 0.02% (1 de 4543) para la de Hualahuises y de 0.70% (12 de 1704) para la de Linares, respectivamente (Rocha-Peña et al., 1996)5 (Cuadro 1). En la huerta de Montemorelos en otoño de 1997 se encontró un árbol infectado adicional a los anteriores, con un incremento de 0.27% (Figura 1, Cuadro 1). En la huerta de Linares en otoño de 1996 se encontraron tres árboles infectados adicionales y uno más en la primavera de 1998 para un incremento del 0.18 y 0.01% en los tres años (Figura 2, Cuadro 1). No se encontró ningún árbol adicional infectado en la huerta de Hualahuises. En el caso particular de la huerta de Linares, dos de los tres árboles que se encontraron infectados con CTV en el otoño de 1996, fueron replantes con árboles de vivero de los que no fue determinado su origen. Los otros dos árboles, tanto el detectado en otoño de 1996, como en la primavera de 1998, fueros árboles adultos. En ninguno de los árboles detectados CTV positivos durante el tiempo que duró el presente estudio se detectó alguno de los síntomas asociados al CTV (Rocha-Peña et al., 1995). Serología con el anticuerpo discriminatorio MCA13 La reacción al anticuerpo monoclonal MCA, tanto en los árboles originalmente infectados como en los encontrados posteriormente, ocurrió en 34 de 35 para la huerta de Montemorelos, cero de uno para la de Hualahuises, y uno de 16 para la de Linares (Cuadro 2). Identificación de áfidos Se encontró un total de 39 especies de áfidos; sin embargo, en una primera etapa sólo se identificaron y cuantificaron a nivel de especie los ejemplares reportados como vectores de virus y en particular para el CTV (Cuadro 3). Entre las especies que se han reportado como vectores del CTV a nivel mundial (Racaah et al., 1989; Roistacher y Bar-Joseph, 1987) se encontraron con mayor predominancia Aphis spiraecola Patch, A. gossypii Glover Cuadro 1. Incremento en la ocurrencia del virus de la tristeza en tres plantaciones comerciales de cítricos en el estado de Nuevo León. Table 1. Increase of the occurrence of citrus tristeza virus in three commercial plantations in the state of Nuevo León. Municipio Montemorelos Hualahuises Linares † Inicial 1995† 1996 1997 1998 Total 34/783¶ 1/4543 12/1704 0.0 0.0 0.18 0.27 0.0 0.0 0.0 0.0 0.01 0.27 0.0 0.19 Fuente: Rocha-Peña et al., 1996. Los árboles infectados con CTV fueron eliminados de las plantaciones en el transcurso de 1996 c CTV infected trees were removed from the groves during 1996. ¶ 445 Serology with the discriminating antibody MCA13 The reactivity to the MCA monoclonal antibody in originally infected CTV trees, as well as in the ones found later, ocurred in 34 out of 35 for the Montemorelos grove, 0 out of one for Hualahuises, and one out of 16 for Linares (Figure 2). Aphid identification Thirty-nine aphid species were found; however, in a first stage, only those reported as virus vectors (particularly of CTV) were quantified and identified at species level (Table 3). Aphid species reported as CTV vectors (Racaah et al., 1989; Roistacher and Bar-Joseph, 1987) found in this work, either in yellow traps or on the foliage, were predominantly Aphis spiraecola Patch, A. gossypii Glover y Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe (Table 4). 04 03 02 01 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 * **** ************ ***T******** ************ ************ *********T** ************ *T ** L-A ** *T*******T** ************ *T*T******** * * * * * * * * * * V * * * * * * 26-1 * * * * * * * * * * * * * * * * * 26-0 * * * * * * * * T * * * * * * * * 26 ***************** 27 *** *** 28 *** L-B *** 29 *** *** 30 ***************** 31 ***************** 32 * * * T * * * * * ? T * * * * * * 33 ***T*********T** 34 ***************** 35 * * * * * * * * T * * * * * * * * 36 * * * * * T * * * * * * * * * * * 37 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 *T********** *******T**** ***T******** ************ ************ *******T**** *********T** ************ ************ ************ ***T*T****** ************ *********T** ************ ************ *******T********* *********T******* *******T********* ******T********** ***************** ***************** ***********T***** ***************** *****T*********** ***************T* *******T********* *************** *T*T*********** *************T* *************** 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 Figura 1. Distribución de árboles de cítricos infectados con el virus de la tristeza en una huerta de Montemorelos, Nuevo León. México. 1995-1998. Simbología: V T Otoño 1995; ? Primavera 1997; T? MCA-13 positivo. Las hileras de árboles se identifican con números. L-A y L-B indican las dos secciones en que está dividida la huerta. Figure 1. Distribution of trees infected by citrus trizteza virus in a grove in Montemorelos, Nuevo León. México. 1995-1998. Symbols: V T Fall 1995; ? Spring 1997; T? MCA-13 positive. Tree rows are identified with numbers. L-A and L-B are two divided sections of the grove. 446 AGROCIENCIA VOLUMEN 35, NÚMERO 4, JULIO-AGOSTO 2001 ********************************************** ********************************************** ********************************************** ******T******************** *********** *************************** L-B *********** *************************** *********** ********************************************** ********************************************** ********************************************** ********************************************** ********************************************* ********************************************* 02 5 10 15 20 25 30 35 40 ****************************************** V***V************************************ 08 * * * * * V * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 07* * V * * * * * V * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * ************************************* 06 * * * * * * * 8 * * ** * * * * * * * * * * * * ***** * * * * * 8 ** * * * * * * * * * * * * * * * * L-A ***** ************************ ***** 05* V * * * * ** * * * * * * * * * * * { * * * * * * * * * * * * * * *V****************************** 04 * V * V * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * ******************************* ******************************* 03 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 02 * * * * * * * 8 V * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * ****************************** 01 * * * * * * V * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 1 5 10 15 20 25 30 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 17 16 15 14 13 12 11 10 09 08 07 06 05 04 03 02 01 Figura 2. Distribución de árboles de cítricos infectados con el virus de la tristeza en una huerta de Linares, Nuevo León. México. 19951998. Simbología: VT Otoño 1995; 8 Otoño 1996; { Primavera 1998; T MCA-13 positivo. Las hileras de árboles se identifican con números. L-A y L-B son las dos secciones en que está dividida la huerta. Figure 2. Distribution of trees infected by citrus trizteza virus in a grove in Linares, Nuevo León. México. 1995-1998. Symbols: VT Fall 1995; 8 Fall 1996; { Spring 1998; T MCA-13 positive. Tree rows are identified with numbers. L-A and L-B are two divided sections of the grove. y Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe (Cuadro 4), tanto en las trampas amarillas como en el follaje. En ninguno de los muestreos realizados se detectó al pulgón café Toxoptera citricida (Kirkaldy), que ha sido reportado como el vector con mayor eficiencia en la transmisión del CTV (Rocha-Peña et al. 1995; Yokomi et al., 1994). Las épocas de vuelo de las especies vectoras registradas se presentan en la Figura 3 para el periodo junio de Cuadro 2. Reactividad de aislamientos del virus de la tristeza en huertos de cítricos del estado de Nuevo León, México con anticuerpo monoclonal MCA13 discriminatorio para aislamientos del tipo declinamiento. Table 2. Reactivity of citrus tristeza virus isolates of Nuevo León, México with MCA13 monoclonal antibody discriminatory for decline inducing isolates. Municipio Montemorelos Hualahuises Linares Árboles evaluados 783 4543 1704 Árboles CTV Árboles MCA13 positivos positivos 35 1 16 34 0 1 Árboles porcentaje 97.1 0.0 6.2 The most efficient insect vector of CTV, the brown citrus aphid, Toxoptera citricida (Kirkaldy) (Rocha-Peña et al. 1995; Yokomi et al., 1994) was not found in any of the surveyed groves. Aphid flight activity from June 1996 to May 1997 for those aphid species reported as CTV vectors is shown in Figure 3. The lowest amounts of alate aphid trapped occurred in June, where the highest temperatures are recorded in the fields. Maximum counts were recorded in September, even when some moderate rains occurred (Figure 4). In the following months we had relatively low but steady counts which increased in April and May 1997, when the minimum and maximum temperatures were lower compared to the same months of the previous year. DISCUSSION The results of this work (Table 1, Figures 1 and 2) show remarkably low values in the occurrence and dissemination of CTV in commercial citrus groves in the state of Nuevo León, México. SILVA-VARA et al.: VIRUS DE LA TRISTEZA EN CÍTRICOS EN NUEVO LEÓN 447 Cuadro 3. Géneros y especies de áfidos capturados en trampas amarillas en huertas de cítricos en el estado de Nuevo León, México. 19961998. Table 3. Genera and species of aphids trapped in yellow water pan traps in citrus groves in Nuevo León, México. 1996-1998. Géneros Especies Amphorophora Buckton 1876 (1 sp.) Chaitophorus Koch 1854 (1 sp.) Illinoia Wilson 1910 (1 sp.) Pemphigus Harting 1839 (1 sp.) Tinocallis Matsumura 1919 (1 sp.) Uroleucon Mordvilko 1914 (3 spp.) Aphis coreopsidis (Thomas 1878). A. fabae Scopoli 1763 † A. gossypii Glover 1877 A. nerii Boyer de Fonscolombe 1841 A. sambuci Linnaeus 1758 † A. spiraecola Patch 1914 A. middletoni Thomas 1879 Geopemphigus floccosus (Moreira, 1925) Hyalopterus pruni (Geoffroy, 1762) Rhopalosiphum maidis (Fitch, 1856) R. padi (Linnaeus 1758) R. rufiabdominale (Sasaki, 1899) Schizaphis graminum (Rondani, 1847) Aulacorthum solani (Kaltenbach 1843) Brachycaudus rumexicolens (Patch 1917) Brevicoryne brassicae (Linnaeus 1758) Capitophorus elaeagni del Guercio 1894 Hayhurstia atriplicis (Linnaeus 1761) Hyperomyzus lactucae (Linnaeus 1758) Lipaphis erysimi (Kaltenbach 1843) Macrosiphum euphorbiae (Thomas 1878) Monelliopsis nigropunctata (Granovsky 1931) Myzus ornatus Laing 1932 M. persicae (Sulzer 1776) Sitobion avenae (Fabricius 1775) Sipha flava (Forbes 1884) Tetraneura nigriabdominalis (Sasaki 1899) † Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe 1841 Especies vectoras de CTV c CTV vector species. 1996 a mayo de 1997. La época de mínimas capturas de alados se registró en el mes de junio, periodo en el que se registran las máximas temperaturas en campo. Las máximas capturas se registraron en septiembre, aún con presencia de lluvias (Figura 4); en los meses siguientes se mantuvieron en niveles bajos pero sostenidos y aumentaron en abril y mayo de 1997, cuando las temperaturas máximas y mínimas fueron menores comparadas con las correspondientes del año anterior. 500 A. spiraecola A. gossypii 450 400 Número † 350 300 250 200 Especies Aphis spiraecola† Toxoptera aurantii† Aphis gossypii† Otras especies † Abundancia Trampas amarillas ++++ +++ ++ ++++++ 150 100 50 ++++ +++ ++ ------ Vectores del virus de la tristeza (Racaah et al., 1989; Roistacher y Bar-Joseph, 1987) c Vectors of citrus tristeza virus. May. Abr. Mar. Feb. Dic. 1996 Follaje Ene. Nov. Oct. Sep. Ago. Jul. 0 Jun. Cuadro 4. Abundancia de áfidos caputados en trampas amarillas y en el follaje en huertas de cítricos en el estado de Nuevo León, México. 1996-1998. Table 4. Relative abundance of aphids trapped in yellow water pan traps and on the foliage in citrus groves of Nuevo León, México. 1996-1998. 1997 Meses Figura 3. Épocas de vuelo de las especies de áfidos vectores del virus trizteza de los cítricos asociados al cultivo de los cítricos. General Terán, Nuevo León. México, Marzo 1996-Mayo 1997. Figure 3. Seasonal flights of citrus tristeza virus aphid vector species associated to citrus. General Terán, Nuevo León, México. Marzo 1996-Mayo 1997. 448 AGROCIENCIA VOLUMEN 35, NÚMERO 4, JULIO-AGOSTO 2001 40 6 5 30 4 25 20 3 15 2 10 Precipitación en mm Temperatura en o C 35 1 5 0 Ene. Feb. Mar. Abr. May. Jun. Jul. Ago. Sep. Oct. Nov. Dic. Ene. Feb. Mar. Abr. May. 0 1996 Precipitación 1997 Meses Temp. máxima Temp. mínima Figura 4. Variación de la temperatura y precipitación en General Terán, Nuevo León. México, Enero 1996-Mayo 1997. Figure 4. Temperature and rainfall variation in General Terán, Nuevo León, México. Enero 1996-Mayo 1997. DISCUSIÓN Los resultados obtenidos (Cuadro 1, Figuras 1 y 2) muestran valores notoriamente bajos de ocurrencia y diseminación del CTV en plantaciones comerciales de cítricos del estado de Nuevo León, México. La baja diseminación observada durante los tres años que duró el presente estudio en las huertas de Montemorelos y Linares, puede ser debido que en el transcurso de 1996 el Gobierno Federal llevó a cabo actividades de eliminación de las plantas CTV positivas en las huertas de Montemorelos y Linares como consecuencia de las detecciones efectuadas en 1995 (Rocha-Peña et al., 1996)5. Lo anterior debe haber influido en gran medida en la baja diseminación observada (Cuadro 1, Figuras 1 y 2), en 1997 y 1998 posteriores a la acción de erradicación. Lo anterior está fundamentado en los programas de erradicación que se han llevado a cabo en otros países, donde se ha documentado que cuando la ocurrencia del virus es inferior a 5%, las campañas de eliminación de árboles infectados reducen considerablemente las tasas de diseminación del virus en el campo (Polek, 2000). Otra posible explicación de la baja ocurrencia y diseminación podría ser una baja transmisibilidad por áfidos de los aislamientos del CTV encontrados. Existen reportes en varios lugares del mundo donde infecciones localizadas del CTV a nivel de campo se han mantenido sin transmisión natural por áfidos durante largos periodos (Cartia et al., 1980) y hasta por 18 años (Ebrahimi et al., 1988). No obstante lo anterior, la presencia de los áfidos Aphis gossypii, A. spiraecola, y Toxoptera aurantii encontrados en las plantaciones de cítricos en el estado de Nuevo León no debe subestimarse. En otras áreas The low dissemination observed during three years in the Montemorelos and Linares groves, may be mainly due to the tree removal measures applied by the Federal Government in 1996, on CTV-positive samples detected in a 1995 survey (Rocha-Peña et al., 1996)5. Those measures probably influenced to some extent the low dissemination observed (Table 1, Figures 1 and 2) in 1997 and 1998, after the eradication measures. Monitoring and tree removal campaigns conducted in other countries have been shown to dramatically reduce the dissemination rates when CTV field occurrence is lower than 5% (Polek, 2000). Another possibility of the low occurrence and dissemination could be a low transmissibility by aphids of the CTV isolates found in this study. There are several reports of CTV infections, confined to certain areas where there has not occurred natural transmission by aphids for long periods (Cartia et al., 1980) and up to 18 yrs in the field, (Ebrahimi et al., 1988). Nevertheless, the presence of aphid species such as Aphis gossypii, A. spiraecola, and Toxoptera aurantii found in the commercial groves in the state of Nuevo León should not be underestimated. In some citrus areas of the world (e.g. California, Florida, Spain, and Israel), where periodic CTV outbreaks occur, Aphis gossypii has been considered as the primary vector of the virus (Bar-Joseph and Loebenstein, 1973; Roistacher et al., 1984; Yokomi and Garnsey, 1987). Likewise, A. spiraecola (Hermoso de Mendoza et al., 1984; Yokomi and Oldfield, 1991; Smith and Farrald, 1988) has been regarded an important CTV vector for some citrus areas of the world. The random distribution of the CTV infected trees in the Montemorelos and Linares groves, of the CTV-infected trees initially detected in 1995, as well as that shown by the additional infected trees found during 1996-1998 (Figures 1 and 2), supports a possible horizontal dissemination by aphids. This type of distribution, with a predominance of CTV-infected trees widely spaced among them is similar to distribution patterns in groves where Aphis gossypii is the primary vector of the virus (Gottwald et al., 1996a, 1996b). This situation apparently is due to the flight patterns of this species, which flies from a tree to trees at relatively short distances (Gottwald et al., 1996b). Nevertheless, the positive reactivity to MCA13 monoclonal antibody of 35 out of the total of the 52 CTV infected trees, which indicates the presence of declining type CTV isolates, none of the disease syndromes associated to CTV was noticed in any of the CTV- positive trees in the field. However, the presence of CTV should not be underestimated, for even if all CTV- infected trees were removed, there is a possibility that some other citrus groves in the State, particularly those near the groves under study, could have trees infected with MCA13 positive CTV isolates, similar to those found in this work. SILVA-VARA et al.: VIRUS DE LA TRISTEZA EN CÍTRICOS EN NUEVO LEÓN citrícolas del mundo (e.g. California, Florida, España e Israel) con epifitias recurrentes por el CTV, se ha señalado a Aphis gossypii como el vector primario del virus (Bar-Joseph y Loebenstein, 1973; Roistacher et al., 1984; Yokomi y Garnsey, 1987). Asimismo, se ha consignado A. spiraecola (Hermoso de Mendoza et al., 1984; Yokomi y Oldfield, 1991; Smith y Farrald, 1988) como vector de importancia del CTV para algunas áreas citrícolas del mundo. La distribución al azar de los árboles infectados con CTV dentro de las huertas de Montemorelos y Linares, tanto en los originalmente encontrados en 1995, como la mostrada por los árboles adicionales encontrados de 1996 a 1998 (Figuras 1 y 2), apoya la posible diseminación horizontal por áfidos. Este tipo de distribución, con predominio de árboles CTV positivos distantes entre sí, es similar a los patrones de distribución en huertas en donde Aphis gossypii es el vector primario del virus (Gottwald et al., 1996a, 1996b). Lo anterior se debe aparentemente a los patrones de vuelo de esta especie, que consisten en viajar distancias relativamente cortas entre árboles distantes entre sí (Gottwald et al., 1996b). No obstante la reacción positiva al anticuerpo monoclonal MCA13 en 35 del total de los 52 árboles infectados con CTV, que indica la presencia de aislamientos del tipo declinamiento del virus, ninguno de los síntomas asociados al CTV se observaron a nivel de campo en los árboles CTV positivos. Lo anterior también se debe tomar con reserva, pues aunque los árboles mencionados ya fueron eliminados, es probable que otras huertas en el Estado, particularmente las adyacentes a las incluídas en el presente estudio, puedan tener árboles infectados con aislamientos MCA13 positivos similares a los aquí encontrados. Está bien documentada la posible ocurrencia de aislamientos extremadamente severos del CTV, ya sea del tipo declinamiento o picado de tallo o de ambos, aún en plantas injertadas sobre naranjo agrio (Rocha-Peña et al., 1995; Roistacher et al., 1991; Bar-Joseph, 1978). Después de mantenerse en forma latente durante periodos prolongados, las infecciones empiezan a hacerse evidentes mediante la aparición de epifitias recurrentes ocasionadas por transmisión por insectos, particularmente A. gossypii. (Bar-Joseph, 1978; Roistacher y Bar-Joseph, 1987; Roistacher et al., 1980). El análisis global de los resultados obtenidos (baja ocurrencia y diseminación del virus), indican que la estrategia adecuada para el manejo fitosanitario integrado del CTV en Nuevo León es la prospección y subsecuente eliminación de árboles infectados con CTV. Asimismo, es probable que los aislamientos que dieron reacción negativa al anticuerpo monoclonal MCA13, encontrados en su mayoría en la huerta de Linares, sean del tipo débil y podrían ser evaluados en ensayos futuros de protección cruzada. 449 The frequent occurrence of severe induced decline or stem pitting CTV isolates in a latent condition is well documented, even in plants grafted on sour orange rootstock (Rocha-Peña et al., 1995; Roistacher et al., 1991; Bar-Joseph, 1978). After a prolonged lag period, latent CTV infections become evident by the occurrence of recurrent outbreaks, caused by insect transmission, particularly A. gossypii. (Bar-Joseph, 1978; Roistacher and Bar-Joseph, 1987; Roistacher et al., 1980). Overall, the results of low CTV occurrence and dissemination, indicate that the appropriate strategy for integrated phyto-sanitary management in Nuevo Leon is the monitoring and subsequent removal of CTV-infected trees. Likewise, it is likely that CTV isolates that were MCA 13 negative, mostly found in the Linares grove, are mild CTV isolates and could be evaluated in future cross protection studies. CONCLUSIONS Based on the results obtained in this work, the following conclusions can be established: CTV increase average in three years in the Montemorelos, Hualahuises and Linares groves was 0.27, 0.0 and 0.18 respectively. Distribution of CTV-infected plants detected later, indicates a possible partial dissemination by aerial vectors. None of the disease syndromes associated to CTV was noticed in any of CTV infected trees. Serological characterization of the CTV isolates indicates the presence of decline-inducing CTV isolates. Aphid species identified were similar to those prevailing in most citrus areas of the world where Toxoptera citricida is not yet present. —End of the English version— CONCLUSIONES Con base en los resultados obtenidos en el presente estudio, se tienen las siguientes conclusiones: El porcentaje de incremento del CTV en tres años en las huertas de Montemorelos, Hualahuises y Linares fue de 0.27, 0.00 y 0.18 respectivamente. La distribución de plantas infectadas con CTV encontradas posteriormente indica una posible diseminación parcial por vectores aéreos En ninguna de las plantas CTV positivas se encontraron síntomas asociados con la enfermedad. La caracterización serológica de los aislamientos indica la presencia de aislamientos del CTV del tipo declinamiento. 450 AGROCIENCIA VOLUMEN 35, NÚMERO 4, JULIO-AGOSTO 2001 Las especies de áfidos identificadas son similares a las existentes en la mayoría de las áreas citrícolas del mundo donde aún no está presente Toxoptera citricida. AGRADECIMIENTOS El presente proyecto de investigación recibió apoyo financiero de la Fundación Produce Nuevo León, A.C., No. 1322. Los autores agradecen el apoyo técnico de Aurelio Navarro-Jáuregui y Antonio SánchezSobrevilla. Contribución INIFAP/CIRNE A-144. LITERATURA CITADA Bar-Joseph, M. 1978. Cross-protection incompleteness: a possible cause for natural spread of citrus tristeza virus after a prolonged lag in Israel. Phytopathology 68:1110-1111. Bar-Joseph, M., and G. Loebenstein. 1973. Effects of strain, source plant and temperature in the transmissibility of citrus tristeza virus by the melon aphid. Phytopathology 63: 716-720. Bar-Joseph, M., and M. Malkinson. 1980. Hen yolk as a source of antiviral antibodies in the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): a comparison of two plant viruses. J. Virol. Meth. 1: 1-5. Cartia, G., S. Barbagallo, and A. Catara. 1980. Lack of sptrad of citrus tristeza virus by aphids in Sicily. In: Proc. 8th Conference Intern. Organ. 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