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Facultad de Biología
Área de Fisiología
Departamento de Biología Funcional y Ciencias de la Salud
CARACTERIZACIÓN DE LOS CANALES DE LA
SUBFAMILIA TREK (K2P) EN NEURONAS DEL
GANGLIO CERVICAL SUPERIOR EN CULTIVO
Alba Cadaveira Mosquera
El Dr. José Antonio Lamas Castro, Profesor Titular del Departamento de
Biología Funcional y Ciencias de la Salud de la Universidad de Vigo y el Dr.
Antonio Reboreda.
CERTIFICAN QUE:
El presente trabajo de investigación titulado: “Caracterización de los canales
de la subfamilia TREK (K2P) en neuronas del ganglio cervical superior en
cultivo”, ha sido realizado bajo nuestra dirección en el Departamento de
Biología Funcional y Ciencias de la Salud de la Universidad de Vigo por Alba
Cadaveira Mosquera. Este trabajo ha sido revisado y reúne las condiciones
necesarias para optar al Grado de Doctor en Biología.
En Vigo, a 11 de Noviembre de 2013.
Fdo.: Dr. José Antonio Lamas Castro
Fdo.: Dr. Antonio Reboreda Prieto
Tesis de licenciatura:
“Caracterización de los canales de la subfamilia TREK (K2P) en neuronas de
GCS de ratón en cultivo”. Fecha de lectura: 25/06/2010. Universidad de Vigo.
Calificación: Sobresaliente (10).
Artículos publicados:
-Cadaveira-Mosquera,A., Ribeiro,S.J., Reboreda,A., Pérez,M., and
Lamas,J.A. (2011). Activation of TREK currents by the neuroprotective agent
riluzole in mouse sympathetic neurons. J. Neurosci. 31, 1375-1385.
-Cadaveira-Mosquera,A., Fernández-Fernández D, Rivas-Ramírez P,
Domínguez V, Reboreda A and Lamas JA. (2011). Del reposo a la
neuroprotección. Papel de los canales TREK. Investigación, 3, 59-63.
-Cadaveira-Mosquera,A.,
Pérez,M.,
Reboreda,A.,
Rivas-Ramírez,P.,
Fernández-Fernández,D., and Lamas,J.A. (2012). Expression of K2P channeles
in sensory and motor neurons of the autonomic nervous system. J Mol
Neurosci. 48(1), 86-96.
-Miranda,P., Cadaveira-Mosquera,A., Gonzalez-Montelongo,R., Villarroel,A.,
Gonzalez-Hernandez,T., Lamas,JA., Alvarez de La Rosa,D., and Giraldez,T.
(2013). The neuronal serum- and glucocorticoid-regulated kinase 1.1 reduces
neuronal excitability and protects against seizures through upregulation of the
M-current. J. Neurosci. 33(6), 2684-2696.
-Rivas-Ramírez,P., Cadaveira-Mosquera,A., Lamas,J.A., Reboreda,A. (2013).
Muscarinic modulation of TREK currents in mouse superior cervical ganglion
neurons. (en preparación).
Participación en proyectos de investigación:
-Xunta de Galicia, 2009. INCITE09ENA310076ES. “Programa de ayudas
para la consolidación y estructuración de unidades de investigación
competitivas del sistema universitario de Galicia”. Investigadores: Federico
Mallo (IP) y J. Antonio Lamas. Financiación: 28.000€. Duración: 2009.
-Universidad de Vigo 2007, V718 122F 64102. “Contratos-Programa con
Grupos de Referencia”. Investigadores: F Mallo (IP), JA Lamas (IP), Lucas
González. Financiación: 50.400 €. Duración: 3 años 1/9/07-31/8/10.
-MICINN, BFU2008-02952/BFI. “Corrientes iónicas implicadas en el
mantenimiento del potencial de reposo y en la modulación de la excitabilidad
celular en neuronas del ganglio cervical superior de ratón en cultivo”.
Investigadores: J. Antonio Lamas (IP), Sandro Ribeiro. Financiación: 136.730
€. Duración: 1/1/2009-31/12/2011.
-MICINN, CSD2008-00005. “Programa CONSOLIDER-INGENIO 2010. The
Spanish Ion Channel Initiative (SICI)”. Grupos de investigación: 26.
Coordinador General: Antonio Vicente Ferrer Montiel. IP del grupo Laboratory
of Neuroscience: J. Antonio Lamas (IP). Financiación total: 6.000.000 €.
Financiación Grupo: 190.000 €. Duración: 5 años, 15/12/08-15/12/13.
-Xunta de Galicia, 2009/063. INBIOMED. “Agrupaciones estratégicas de
grupos de investigación 2009. Programa de ayudas para la consolidación y
estructuración de unidades de investigación competitivas del sistema
universitario de Galicia”. Grupos de investigación: 12. IP del grupo de
Neurociencia: J. Antonio Lamas. Coordinador General: Ángel Rodríguez de
Lera. Financiación total: 750.000 €. Financiación Grupo: ≈60.000 €. Duración:
3 años, 2009-2011.
-Xunta de Galicia, 2010. IN845B-2010/148. “Programa de ayudas para la
consolidación y estructuración de unidades de investigación competitivas del
sistema gallego de I+D+I”. Investigadores: Federico Mallo (IP) y J. Antonio
Lamas. Financiación: 19.600€. Duración: 2010.
-MICINN, BFU2011-25371. “Regulación de los canales de potasio de doble
dominio de poro (K2P), de la subfamilia TREK, por agonistas muscarínicos y
sustancias nootropicas en neuronas del Sistema Nervioso Autónomo”.
Investigadores: J. Antonio Lamas (IP), Antonio Reboreda. Financiación:
94.380. Duración: 3 años, 1/1/2012-31/12/2014.
-EUROPEAN COMMISSION. FP7-316265-BIOCAPS. Call Identifier: FP7REGPOT-2012-2013-1. Coordination and Support Actions (Support Action).
Biomedical Capacities Support Program (BIOCAPS). África González:
Coordinadora General. J. Antonio Lamas (IP): Research Leader of the
Experimental Neurophysiology Group. Financiación total: 4.300.000 €.
-Xunta de Galicia, CN2012/273. “INBIOMED. Agrupaciones estratégicas de
grupos de investigación 2012. Programa de ayudas para la consolidación y
estructuración de unidades de investigación competitivas del sistema
universitario de Galicia”. Grupos de investigación: 12. IP del grupo de
Neurociencia: J. Antonio Lamas. Coordinador General: Ángel Rodríguez de
Lera. Financiación total: 500.000 €. Financiación Grupo: ≈30.000 €. Duración:
2 años, 16/06/2012-30/11/2013.
Contribuciones a congresos:
-Lamas JA, Cadaveira A, Domínguez V y Ribeiro SJ. “Background two-poredomain like potassium conductance in superior cervical ganglion neurones in
culture”. 6th FENS Forum of European Neuroscience. Ginebra (Suiza), 12-16 de
Julio 2008.
-Ribeiro SJ, Cadaveira A, Domínguez V y Lamas JA. “Background two-poredomain like potassium conductance in superior cervical ganglion neurons in
culture”. IV Jornadas para Jóvenes Investigadores en Neurociencia. Santiago de
Compostela, 22 de Julio de 2008.
-Ribeiro SJ, Cadaveira-Mosquera A, Reboreda A, Domínguez V y Lamas JA.
“Corriente de potasio K2P activada por riluzole en neuronas simpáticas de
ratón”. XIII Congreso de la Sociedad Española de Neurociencia. Tarragona, 1619 de Septiembre de 2009.*COMUNICACIÓN ORAL.
-Cadaveira-Mosquera A, Ribeiro SJ, Pérez M, Reboreda A, Domínguez V y
Lamas JA. “Expresión de canales de la familia TREK (K2P) en neuronas de
ganglio cervical superior de ratón”. XIII congreso de la Sociedad Española de
Neurociencia. Tarragona, 16-19 de Septiembre de 2009.
-Reboreda A, Ribeiro SJ, Cadaveira-Mosquera A, Pérez M, Domínguez V y
Lamas JA. “Characterization of TREK (K2P) channels in cultured mouse
superior cervical ganglion neurons”. Annual Society for Neuroscience Meeting.
Chicago (USA), 17-21 octubre de 2009.
-Lamas JA, Cadaveira-Mosquera A, Ribeiro SJ and Reboreda A. “Two-poredomain potassium channels: do neurons finally rest?”. Reunión Española de
Canales Iónicos (RECI). Valladolid, 15-16 de octubre de 2009.
*COMUNICACIÓN ORAL.
-Fernández-Fernández D, Reboreda A, Cadaveira-Mosquera A, RivasRamírez P, Domínguez V y Lamas JA. “Efecto del silenciamiento posttranscripcional del canal de potasio TREK-2 sobre la corriente inducida por
riluzole en neuronas simpáticas de ratón”. VI Jornadas para Jóvenes
Investigadores en Neurociencia. A Coruña, 22 de julio de 2010.
*COMUNICACIÓN ORAL.
-Rivas-Ramírez P, Reboreda A, Cadaveira-Mosquera A, Fernández-Fdz D,
Domínguez V y Lamas JA. “Regulación muscarínica de canales de potasio
TREK en neuronas de ratón en cultivo”. VI Jornadas para Jóvenes
Investigadores en Neurociencia. A Coruña, 22 de julio de 2010.
*COMUNICACIÓN ORAL.
-Cadaveira-Mosquera A, Reboreda A, Ribeiro SJ, Pérez M, Fernández-Fdz D,
Rivas-Ramírez P, Domínguez V y Lamas JA. “Expresión de canales de las
subfamilias TREK, TASK y TRESK (K2P) en neuronas de GCS de ratón”. VI
Jornadas para Jóvenes Investigadores en Neurociencia. A Coruña, 22 de julio de
2010.
-Reboreda A, Ribeiro SJ, Cadaveira-Mosquera A, Pérez M, Domínguez V y
Lamas JA. “Characterization of TREK (K2P) channels in cultured mouse
superior cervical ganglion neurons”. Workshop "Channelopathies: from bench
to bedside”. Gavá-Barcelona, 2-3 febrero 2010.
-Cadaveira-Mosquera A, Reboreda A, Ribeiro SJ, Pérez M, Fernández D,
Rivas P, Domínguez V, Lamas JA. “Expression of K2P potassium channels in
mouse superior cervical ganglion neurons”. 7th FENS Forum of European
Neuroscience. Amsterdam (Holanda), 3-7 Julio 2010.
-Reboreda A, Cadaveira-Mosquera A, Rivas P, Fernández D, Domínguez V,
Lamas JA. “Muscarinic modulation of TREK currents in cultured mouse
superior cervical ganglion neurons”. 7th FENS Forum of European
Neuroscience. Amsterdam (Holanda), 3-7 Julio 2010.
-Reboreda A, Rivas-Ramirez P, Fernández-Fernández D, Cadaveira-Mosquera
A, Domínguez V, Lamas JA. “Inhibition of TREK currents by muscarinic
agonists in mouse sympathetic neurons”. International Workshop on membrane
proteins, signal transduction and disease. Bilbao, 12-13 de julio de 2010.
*COMUNICACIÓN ORAL.
-Cadaveira-Mosquera A, Ribeiro SJ, Reboreda A, Pérez M, Lamas JA (2010).
“Activation of K2P (TREK) currents by riluzole in mouse SCG”. Current
Trends in Biomedicine Workshop: Ion channels and diseases of the nervous
system. Baeza (Jaén), 2-4 noviembre de 2010.
-Fernández-Fernández D, Cadaveira-Mosquera A, Reboreda A, RivasRamirez P, Domínguez V, Lamas JA. “TREKing through the autonomic
nervous system”. RECI3. Puerto de la Cruz (Tenerife), 2-4 Febrero 2011.
-Cadaveira-Mosquera A, Reboreda A, Rivas-Ramirez P, Fernández-Fernández
D, Domínguez V, Lamas JA. “Inhibition of TREK currents by fluoxetine
modulates the excitability and resting membrane potential of sympathetic
neurons”. RECI3. Puerto de la Cruz (Tenerife), 2-4 Febrero 2011.
-Reboreda A Cadaveira-Mosquera A, Rivas-Ramirez P, Fernández-Fernández
D, Domínguez V, Lamas JA. “Caracterización de los canales de la subfamilia
TREK en el ganglio cervical superior de ratón en cultivo”. IV Xornada de
Investigación Biomédica de Vigo. *COMUNICACIÓN ORAL.Vigo 24, Mayo
de 2011.
-Fernández-Fernández D Cadaveira-Mosquera A, Reboreda A Rivas-Ramirez
P, Domínguez V, Lamas JA. “Corrientes de tipo TREK activadas por riluzole
en el ganglio nodoso de ratón”. IV Xornada de Investigación Biomédica de
Vigo. Vigo 24, Mayo de 2011.
-Rivas-Ramirez P A Reboreda Cadaveira-Mosquera A, Fernández-Fernández
D , Domínguez V, Lamas JA. “Regulación muscarínica de canales de potasio
TREK en neuronas simpáticas de ratón en cultivo”. 8ª Jornadas de jóvenes
investigadores de Albacete. Albacete 15-16 de Junio de 2011.
-Miranda P, Cadaveira-Mosquera A, Villarroel A, Lamas JA, Giráldez T,
Álvarez de la Rosa D. “Regulation of the voltaje gated K + KCNQ2/3 channels
by the neuronal serum-and glucocorticoids-regulated kinase 1.1”. Integrative
research on ion channels. Oviedo 12-13 de Julio,2011.
-Rivas-Ramírez P, Cadaveira-Mosquera A, Fernández-Fernández D,
Domínguez V, Lamas JA, Reboreda A. “Mecanismo de inhibición muscarínica
de corrientes de potasio TREK-2 en neuronas simpáticas de ratón en cultivo”.
VII Jornadas para Jóvenes Investigadores en Neurociencia. Santiago de
Compostela. 20 de julio de 2011.
-Fernández-Fernández D, Cadaveira-Mosquera A, Reboreda A, RivasRamírez P, Domínguez V, Lamas JA. “Estudio de la expresión de canales de
potasio K2P y la corriente activada por riluzole en neuronas aferentes vagales
en ratón”. VII Jornadas para Jóvenes Investigadores en Neurociencia. Santiago
de Compostela, 20 de julio de 2011.
-Fernández-Fernández D, Cadaveira-Mosquera A, Reboreda A, Rivas
Ramírez P, Domínguez V, Lamas JA. “Expresión de canales K2P y el estudio
de la corriente activada por riluzol en el ganglio nodoso”. XIV Congreso de la
Sociedad Española de Neurociencia. Salamanca, 28-30 de Septiembre de 2011.
-Cadaveira-Mosquera A, Reboreda A, Pérez M, Fernández-Fernández D,
Rivas Ramírez P, Domínguez V, Lamas JA (2011). “Expresión de canales de
potasio K2P (TASK, TRESK) en neuronas sensiorales y motoras del SN
autónomo”. XIV Congreso de la Sociedad Española de Neurociencia.
Salamanca, 28-30 de Septiembre de 2011.
-Rivas-Ramírez P, Cadaveira-Mosquera A, Fernández-Fernández D,
Domínguez V, Lamas JA, Reboreda A. “Caracterización de la vía de inhibición
muscarínica de corrientes TREK en neuronas del ganglio cervical superior en
cultivo”. XIV Congreso de la Sociedad Española de Neurociencia. Salamanca,
28-30 de Septiembre de 2011.
-Bertone N, Cadaveira-Mosquera A, Pérez M, Reboreda A, Fernández
Fernández D, Rivas-Ramírez P, Domínguez V, Lamas JA. “Expresión de
canales K2P en neuronas ganglionares del sistema nervioso periférico”. V
Xornadas de Investigación Biomédica de Vigo. Vigo, 31 de Mayo de 2012.
-Rivas-Ramírez P, Reboreda A, Cadaveira-Mosquera A, Fernández Fernández
D, Domínguez V, Lamas JA. “Expresión funcional de canales K2P en neuronas
del ganglio cervical superior y del ganglio nodoso en cultivo”. V Xornadas de
Investigación Biomédica de Vigo. Vigo, 31 de Mayo de 2012.
-Reboreda A, Rivas-Ramírez P, Cadaveira-Mosquera A, Fernández-Fernández
D, Domínguez V, Lamas JA. “International Workshop: Frontiers un ion cannel
research. New findings and new challenges”. Torrecaballeros (Segovia), 10-11
de Julio de 2012.
-Rivas-Ramírez P, Reboreda A, Cadaveira-Mosquera A, Fernández Fernández
D, Domínguez V, Lamas JA. “PIP2 modulates TREK-2 currents in the mouse
superior cervical ganglion”. 8th Fens Forum of Neuroscience. Barcelona 14-18
de Julio de 2012.
-Fernández Fernández D, Cadaveira-Mosquera A, Rivas-Ramírez P, Reboreda
A, Domínguez V, Lamas JA. “Functional expression of the two-pore-domain
potassium channels in visceral afferents od the nodose ganglion”. 8th Fens
Forum of Neuroscience. Barcelona, 14-18 de Julio de 2012.
-Rivas-Ramírez P, Reboreda A, Cadaveira-Mosquera A, Fernández Fernández
D, Domínguez V, Lamas JA. “PIP2 modulates TREK-2 currents in the mouse
superior cervical ganglion”. VIII Jornadas para jóvenes investigadores en
Neurociencia. Vigo, 23 de Julio de 2012.
-Miranda P, Cadaveira-Mosquera A, Villarroel A, Lamas JA, Álvarez de la
Rosa D, Giráldez T. “Regulation of the voltaje gated K + Kv7.2/3 channels by
the neuronal serum-and glucocorticoids-regulated kinase 1.1”. Joint FEPS &
Spanish Physiological Society Scientific Congress 2012. Santiago de
Compostela, 8-11 de Septiembre de 2012. *COMUNICACIÓN ORAL.
-Rivas-Ramírez P, Cadaveira-Mosquera A, Fernández-Fernández D,
Domínguez V, Lamas JA, Reboreda A. “ Canales de doble dominio de poro y
modulación muscarínica de TREK en neuronas simpáticas de ratón en cultivo”.
IX Jornadas Jóvenes Investigadores. Albacete, (3-5 de Octubre de 2012).
AGRADECIMIENTOS
Una vez llegado hasta aquí, me gustaría mostrar mi gratitud a todas las
personas que de un modo u otro me han ayudado y acompañado durante esta
etapa.
En primer lugar, mi más sincero agradecimiento al Dr. José Antonio Lamas,
director de esta tesis, por brindarme la oportunidad de incorporarme a su
laboratorio e iniciarme en el mundo de la investigación científica, por su
paciencia, constancia, rigurosidad y exigencia en muchos momentos; además
de por todo el apoyo mostrado durante este tiempo. Gracias por tu dedicación y
pasión por la investigación.
Al Dr. Antonio Reboreda por aceptar la dirección de esta tesis ya iniciada,
por nuestras discusiones “constructivas”, por el trabajo diario y sus consejos
en la parte de electrofisiología.
Al Dr. Sandro José Ribeiro, porque juntos iniciamos este trabajo y
compartimos largas jornadas laborales, gracias por todo el esfuerzo realizado.
A mis compañeros que han pasado por el laboratorio: a Paula por su
colaboración, a Diego por nuestras charlas, risas e ideas originales, a Nico por
hacer muy fácil el trabajar juntos. A Vane, mi amiga y compañera de fatigas,
por ser excelente en su trabajo, por enseñarme cuando llegué el funcionamiento
del laboratorio, por su ayuda incondicional y su capacidad de trabajo, ha sido
una suerte el haber trabajado juntas; gracias por tus palabras de ánimo y tu
optimismo, sé que estás muy orgullosa de esta tesis.
Al laboratorio del Dr. Pablo Presa, por dejarme disponer de todo su
material y por sus consejos, especialmente a la Dra. Montse Pérez, por toda la
ayuda prestada durante este trabajo, por sus orientaciones y su amistad.
Al laboratorio de Endocrino por el día a día y su agradable compañía: al
Dr. Federico Mallo, Dr. Lucas González, Dra. Mayte Álvarez, Dr. Manuel Gil,
Hugo, Juan y a la Dra. Eva Vigo además por su ayuda en los comienzos con la
biología molecular. A Vero por ayudarme y escucharme cuando lo he
necesitado. A Marina por empezar juntas este duro camino, por ser una
persona extraordinaria, por sus consejos, además de por su ayuda
desinteresada en todo momento.
A las chicas de vegetal: Chus, Laura, Cris y Pili.
A los técnicos del CACTI Suso e Inés por su apoyo en el microscopio
confocal. Al apoyo técnico y humano de los SGIker (UPV/EHU, MICINN,
GV/EJ,FSE).
A las entidades financiadoras de los diferentes proyectos: Xunta de Galicia,
Universidad de Vigo, MICINN y Unión Europea.
Me siento una persona afortunada por contar con un montón de amig@s,
así que me gustaría agradecer a mis amig@s de siempre y a los que han ido
llegando a lo largo del tiempo, el estar a mi lado en los buenos y en los malos
momentos. Especialmente a Ana E por todas nuestras charlas telefónicas y por
comprender lo que es hacer una tesis, a Laura por caminar juntas desde los 3
años hasta terminar la carrera, a Pablo por los años universitarios y por
convertirse en un gran amigo, a Ana B por nuestras largas noches despiertas, a
Ana D porque las mayoría de mis vivencias van unidas a ella.
A la familia Hervés-Alonso-Jáudenes, por acogerme y hacerme sentir una
más en su familia , especialmente a Joaquín allá donde estés estoy segura que
te alegrarás… y a Corea mi “madre” en Vigo, por su cariño, comprensión,
ayuda y aliento.
A mi familia: padres, abuelos y hermana con los que me he criado y he
crecido porque siempre han estado ahí. En especial a mis padres por
preocuparse en todo momento de mi educación e inculcarme el valor del
esfuerzo, por su ayuda constante; en fin, el haber llegado hasta aquí en parte se
lo debo a ellos, nunca os lo podré agradecer lo suficiente.
A mi hija Carlota por hacer que todo sea diferente desde que llegaste.
A Iván por ser mi compañero, estar siempre a mi lado, animarme y
mimarme constantemente, no tengo palabras para mostrarte todo mi
agradecimiento, simplemente gracias por ser como eres.
A todos GRACIAS.
A mis padres, a Iván.
“Siempre se llega a alguna parte si se
camina lo bastante”. Lewis Carroll
RESUMEN
En neuronas simpáticas del ganglio cervical superior (GCS) el potencial de
reposo está controlado por un mecanismo complejo en el que intervienen varias
corrientes voltaje dependientes, la bomba de Na+/K+ y una corriente de fuga
principalmente de K+ cuyo sustrato molecular era desconocido. El
descubrimiento en 1996 de los canales K2P y su participación en el
mantenimiento del potencial de reposo en varios tipos celulares, los reveló
como los principales candidatos para transportar la corriente de fuga. Esta
familia de canales está compuesta de seis subfamilias y 15 subunidades que se
encuentran ampliamente distribuidas en todo el sistema nervioso somático
central y periférico; sin embargo, hasta la realización de este trabajo su
expresión en el sistema nervioso autónomo era desconocida. Los resultados
obtenidos muestran que las neuronas del GCS expresan mRNA de los tres
miembros de la subfamilia TREK (TREK-1, TREK-2 y TRAAK) con un
predominio de TREK-2 cuantificado mediante RT-qPCR, el marcaje con
anticuerpos específicos muestra también la presencia de los tres miembros de
la subfamilia. La aplicación de riluzol, activador de canales de la subfamilia
TREK, en experimentos de patch perforado en neuronas en cultivo activa una
corriente transitoria resistente a bloqueantes clásicos de potasio, que se
incrementa con Zn2+ y se bloquea por fluoxetina. El perfil farmacológico y la
cuantificación de los resultados de canal individual indican que la mayor
parte de la corriente activada por riluzol fluye a través de TREK-2. A nivel
funcional se observa que los canales TREK-2 contribuyen al mantenimiento del
potencial de reposo e influyen en el patrón de disparo evocado por estímulos
eléctricos, son por lo tanto un regulador importante de la excitabilidad de las
neuronas del GCS.
ÍNDICE
1
2
Índice
INTRODUCCIÓN
11
1. Canales de K+……………………………………………………………..
13
1.1. 6TM/1P………………………………………………………………...
1.2. 2TM/1P………………………………………………………………...
1.3. 6-7 TM/1P……………………………………………………………..
1.4. 4TM/2P……………………………………………………………......
13
15
15
16
2. Canales K2P……………………………………………………………...
17
2.1. Tipos de canales K2P……………………………………………….
17
2.1.1. TWIK “Tandem of Pore domains in a Weak Inward rectifier K+
channel”…………………………………………………………….........
2.1.2. TREK “TWIK-Related K+ channel”.……………………………...
19
2.1.3. TASK “TWIK-related Acid-Sensitive K+ channel”…………….....
19
+
19
2.1.4 TALK “TWIK related Alkaline pH activated K channel”………..
20
2.1.5 THIK “Tandem-pore domain Halothane-Inhibited K+ channel”…
21
+
2.1.6. TRESK “TWIK-Related Spinal cord K channel”………………..
21
2.2. Estructura general canales K2P…………………………………..
2.3. Función general de canales K2P………………………………….
22
3. Subfamilia de canales TREK………………………………………...
24
3.1. Estructura de canales TREK……………………………………...
3.2. Expresión y distribución de los canales TREK………………...
3.3. Propiedades electrofisiológicas……………………………………
25
3.3.1. TREK-1……………………………………………………………
29
3.3.2. TREK-2……………………………………………………………
30
3.3.3. TRAAK…………………………………………………………….
30
3.4. Moduladores farmacológicos……………………………………...
3.5. Moduladores físico-químicos……………………………………...
31
22
26
29
32
3.5.1. Mecanosensibilidad………………………………………………
32
3.5.2. Termosensibilidad………………………………………………..
33
3.5.3. pH…………………………………………………………………
34
3.6. Regulación por proteínas G……………………………………….
3.7. Interés fisiopatológico………………………………………………
35
3.7.1. Neuroprotección…………………………………………………..
38
3.7.2. Riluzol……………………………………………………………..
39
3.7.3. Patologías nerviosas………………………………………………
39
3.7.4. Sistema cardiovascular……………………………………………
40
3.7.5. Anestesia…………………………………………………...……...
40
4. Potencial de reposo en neuronas simpáticas…………………….
41
OBJETIVOS
MATERIAL Y MÉTODOS
43
1. Cultivo celular……………………………………………………………
49
38
47
3
Indice
1.1. Extracción…………………………………………………………….
1.2. Disgregación………………………………………………………….
1.3. Proceso de sembrado………………………………………………..
1.4. Soluciones empleadas en el cultivo……………………………….
49
2. Registro electrofisiológico. Técnica de patch-clamp………….
51
2.1. Modalidades de la técnica de patch clamp……………………...
2.2. Aspectos técnicos del patch clamp………………………………..
51
2.2.1. Circuito equivalente……………………………………………….
54
2.2.2. Resistencia de serie (Rs)…………………………………………...
55
2.2.3. Potencial de difusión (“Junction potential”)……………………..
56
2.2.4. Space clamp……………………………………………………….
57
2.3. Sistema utilizado……………………………………………………..
57
2.3.1. Fabricación de electrodos………………………………………...
58
2.3.2. Descripción del sistema de registro electrofisiológico……………
59
2.3.3. Soluciones de registro……………………………………………..
60
50
50
51
54
2.3.4. Análisis de datos electrofisiológicos………………………………
61
2.4. Protocolo experimental ……………………………………………..
2.5. Registro de canal individual……………………………………….
62
3. Biología molecular………………………………………………………
64
3.1. Extracción de ARN………………………………………………….
3.2. Cuantificación del ARN…………………………………………….
3.3. Amplificación de ARN mediante RT-PCR……………………...
3.4. Electroforesis en gel de agarosa…………………………………..
3.5. Clonación de productos de PCR………………………………….
64
4
63
66
66
69
70
3.5.1. Purificación del producto de la PCR en geles de agarosa….........
73
3.5.2. Ligamiento de los productos de PCR………………………….…..
73
3.5.3. Transformación de células competentes…………………………..
74
3.5.4. Amplificación por PCR de las colonias recombinantes………......
75
3.5.5. Purificación del ADN plasmídico…………………………………
76
3.5.6. Secuenciación……………………………………………………..
77
3.6. RT-PCR de neuronas individuales de GCS en cultivo………..
3.7. Reactivos utilizados…………………………………………………
3.8. PCR cuantitativa (qPCR)………………………………………….
77
3.8.1 Análisis de la calidad e integridad del ARN……………………….
82
3.8.2 Síntesis de cDNA…………………………………………………...
82
3.8.3. Reacción de qPCR………………………………………………...
82
3.8.4 Análisis de resultados……………………………………………...
83
3.8.5. Análisis estadístico………………………………………………..
84
3.8.6. Reactivos utilizados para qPCR…………………………………..
84
3.9. Inmunocitoquímica………………………………………………….
85
79
80
Índice
3.9.1. Protocolo de inmunocitoquímica………………………………….
85
3.9.2. Reactivos utilizados……………………………………………….
86
87
RESULTADOS
1. Propiedades electrofisiológicas de la corriente activada por 89
riluzol…………………………………………………………………………...
1.1. El riluzol activa una corriente de salida………………………...
1.2. La corriente activada por riluzol (IRIL) es selectiva para K+...
90
2. Farmacología de la corriente activada por riluzol (IRIL)……..
93
+
2+
2.1. Bloqueantes clásicos de canales de Na , Ca y catiónicos…...
2.2. Bloqueantes clásicos de canales de K+…………………………...
2.3. Curva dosis- respuesta para riluzol……………………………...
2.4. Moduladores de canales K2P……………………………………...
2+
91
94
96
97
99
2.4.1. Zn ………………………………………………………………..
99
2.4.2. Fluoxetina…………………………………………………………
99
2.4.3. Quinina……………………………………………………………
100
3. Modulación por pH intracelular…………………………………..
4. Activación mecánica….………………………………………………...
5. Activación por ácidos grasos insaturados………………………..
6. Expresión de canales TREK en el GCS…………………………..
102
6.1.Obtención de muestras de ARN total para RT-PCR…………..
6.2. Expresión de canales K2P en ganglio cervical superior……...
6.3. Clonación y secuenciación de cDNAs……………………………
6.4. RT-PCR de célula individual……………………………………...
6.5. PCR cuantitativa (qPCR)………………………………………….
105
6.5.1. Comparación de eficiencias……………………………………….
111
6.5.2. Cuantificación expresión subfamilia TREK……………………….
112
6.6. Expresión de proteínas K2P en GCS…………………………….
114
7. Registros de canal individual………………………………………...
8. Papel fisiológico de los canales K2P……………………………….
115
8.1. Papel de los canales TREK en potencial de reposo ……………
8.2. Efecto fluoxetina sobre el patrón de descarga y la
excitabilidad…………………………………………………………………..
119
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFÍA
ANEXO
123
103
104
105
106
107
110
111
119
120
133
137
157
5
6
ÍNDICE DE ABREVIATURAS
4-AP
A
aa
AA
AC
ADN
ALS
AMPc
ARN
ARNm
BK
CDNA
Cm
Cp
Ct
Curva I-V
DAG
DAPI
DEPC
DMSO
dNTPs
EAG
EBSS
EC50
E K+
EGTA
ELA
ELK
Em
ERG
FCS
FITC
GAPDH
GCS
GHZ
HBSS
HEPES
HGNC
HUGO
IBMX
IH
IK
IM
INaP
INaT
IRIL
4 aminopiridina
Adenina
Aminoácido
Ácido araquidónico
Adenilato ciclasa
Ácido desoxirribonucleico
Esclerosis lateral amiotrófica
Ácido adenosina-5’-fosfórico cíclico
Ácido ribonucleico
ARN mensajero
Big K+ channel
ADN complementário
Capacidad de membrana
Capacidad de pipeta
Threshold cycle
Curva intensidad-voltaje
Diacilglicerol
4',6-diamidino-2-fenilindol
Dietil pirocarbonato
Dimetil sulfóxido
Desoxinucleótidos trifosfato
Ether-à-go-go
Earle’s Balanced Solution
Dosis eficaz 50
Potencial equilibrio de potasio
Ethylene glycol tetraacetic acid
Esclerosis lateral amiotrófica
Eag-like K+ channel
Fuerza electromotriz de la membrana
Ether-à-go-go-related gene
Fetal Calf Serum
Isocianato de fluoresceína
Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa
Ganglio cervical superior
Goldman-Hodgkin-Katz
Hank’s Balanced Solution
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid
HUGO Gene Nomenclature Committee
Human Genome Organisation
3-isobutyl-1-methyl xanthina
Corriente H
Intermediate conductance K+ channel
Corriente M
Corriente de sodio persistente
Corriente de sodio transitoria
Corriente activada por riluzol
7
IP3
IPTG
I/V
K2P
LPC
LPI
LPLs
MLV
M-MLV
NCBI
PBS
PCR
PDBu
PIP2
PKA
PLC
PMA
PUFAs
qPCR
Ra
RIN
Rm
Rp
Rs
Rsello
RT-PCR
SFA
SK
SNA
SNC
SNP
T
Taq pol
TALK
TASK
TBE
TEA
THIK
TOK1
TREK
TRAAK
TWIK
TRESK
TTX
X-Gal
8
Inositol 1,4,5-trifosfato
Isopropil-β-D-tiogalactósido
Intensidad-voltaje
Two-pore domain K+ channels
Lisofosfatidilcolina
Lisofosfatidil inositol
Lisofosfolípidos
Músculo liso vascular
Moloney Murine Leukemia Virus
National Center for Biotechnology Information
Phosphate Buffered Saline
Reacción en cadena de la polimerasa
Forbol 12,13-dibutirato
Fosfatidilinositol 4,5-bifosfato
Proteínquinasa A
Fosfolipasa C
Forbol 12-miristato-13 acetato
Ácidos grasos poliinsaturados
PCR cuantitativa
Resistencia de acceso
RNA Integrity Number
Resistencia de membrana
Resistencia de la pipeta
Resistencia de serie
Resistencia del sello
Reacción de la Cadena de Polimerasa en Transcripción
Reversa
Ácidos grasos saturados
Small K+ channel
Sistema nervioso autónomo
Sistema nervioso central
Sistema nervioso periférico
Timina
Taq ADN polimerasa
TWIK related Alkaline pH activated K+ channel
TWIK-Related Acid-Sensitive K+ Channel
Tampón Tris-borato-EDTA
Tetraetilamonio
Tandem-pore domain Halothane-Inhibited K+ channel
Tandem-pore domain, outwardly rectifying K+ channel
TWIK-related two-pore domain potassium channel
TWIK-related arachidonic acid-stimulated K+ channel
Tandem of Pore domains in a Weak Inward rectifier K +
channel
TWIK-Related Spinal cord K+ channel
Tetrodotoxina
5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura1: Esquema de una subunidad de un canal de K+ (KV).
Figura 2: Representación esquemática de una subunidad K2P.
Figura 3: Dendrograma de la familia de canales K2P de ratón.
Figura 4:.Estructura tridimensional de TRAAK.
Figura 5: Esquema de la regulación de los canales TREK-1 y TREK-2.
Figura 6: Disección del GCS.
Figura 7: Esquema de las diferentes modalidades de la técnica de patch-clamp.
Figura 8: Modelo eléctrico de un experimento de patch-clamp en modalidad
whole cell.
Figura 9: Esquema del sistema de registro utilizado para la realización de la
técnica de patch-clamp.
Figura 10: Esquema en el que se representa un sello (GΩ) entre una célula y
una micropipeta.
Figura 11: Representación esquemática del proceso de clonación.
Figura 12: Mapa del vector pGEM-T.
Figura 13: Sondas TaqMan.
Figura 14: Corriente activada por riluzol (IRIL) en experimentos de voltage-clamp y
current-clamp.
Figura 15: Inversión de la corriente activada por riluzol en función del E K+.
Figura 16: Curvas I/V para IRIL.
Figura 17: Efecto de bloqueantes clásicos de canales de Na +, Ca2+ y catiónicos sobre
IRIL.
Figura 18: Efecto de bloqueantes clásicos de canales de K+ sobre IRIL.
Figura 19: Curva dosis-respuesta para el riluzol.
Figura 20: Efecto de diferentes moduladores de canales K2P sobre I RIL.
Figura 21: Resumen de IRIL en presencia de diferentes bloqueantes de canales iónicos
y moduladores de canales K2P.
Figura 22: Activación de una corriente de salida tras la acidificación intracelular.
Figura 23: Activación de corrientes mediante estímulos mecánicos y ácido graso
insaturado.
Figura 24: Amplificación del gen constitutivo de la β-actina.
9
Figura 25: Productos de amplificación mediante RT-PCR.
Figura 26: Alineamiento de la secuencia obtenida tras la secuenciación del
fragmento de cDNA obtenido mediante RT-PCR para TREK-1, con la
secuencia publicada en el NCBI (NM_010607.1).
Figura 27: Alineamiento de la secuencia obtenida tras la secuenciación del
fragmento de cDNA obtenido mediante RT-PCR para TREK-2, con la
secuencia publicada en el NCBI (NM_029911.3).
Figura 28: Alineamiento de la secuencia obtenida tras la secuenciación del
fragmento de cDNA obtenido mediante RT-PCR para TRAAK, con la
secuencia publicada en el NCBI (NM_008431.2).
Figura 29: Productos de amplificación mediante RT-PCR de célula individual.
Figura 30: ΔCt. vs log [cDNA].
Figura 31: Perfil de expresión de los canales de la subfamilia TREK en GCS.
Figura 32: Inmunorreactividad de los canales de la subfamilia TREK, en neuronas
de GCS de ratón en cultivo.
Figura 33: Registros de canal individual de TREK-2.
Figura 34: Registros de canal individual de “TREK-like”.
Figura 35: El riluzol provoca incremento en la probabilidad de apertura de TREK-2 y
la fluoxetina inhibe la actividad del canal.
Figura 36: Efecto de la fluoxetina sobre el número de potenciales de acción.
Figura 37: Efecto de la fluoxetina en la latencia del potencial de acción
10
INTRODUCCIÓN
11
12
Introducción
1. CANALES DE POTASIO.
El movimiento de iones a través de las membranas celulares es la base para
muchos procesos fisiológicos fundamentales como la excitabilidad celular o el
mantenimiento de la homeostasis iónica, los canales iónicos son elementos
clave en ambos procesos. Los canales de K+ son proteínas que forman poros
selectivos para K+ en membranas biológicas, permitiendo el transporte pasivo de
K+ a través de las mismas. En función de su estructura los canales de K+ se
pueden clasificar en cuatro grupos: 6TM/1P, 2TM/1P, 6-7TM/1P y 4TM/2P
(ver clasificación en tabla 19 del Anexo).
1.1. 6TM/1P. Canales voltaje-dependientes (Kv).
Formados por 4 subunidades α (hidrofóbicas) con 6 segmentos
transmembrana cada una y 4 subunidades β (hidrofílicas). En el cuarto
segmento transmembrana reside el sensor de voltaje. Las subunidades α
conforman el poro del canal, mientras que las subunidades β son accesorias
(figura 1).
Figura1: Esquema de una subunidad de un canal de K+ (KV). Se observan 6
segmentos transmembrana (S) y un dominio formador de poro (P). La
subunidad β se une al extremo carboxiterminal de la subunidad α. Tanto el
extremo aminoterminal como el carboxiterminal son citoplasmáticos.
13
Introducción
Estos canales poseen una gran diversidad, debido principalmente a varios
factores como por ejemplo: la heteromultimerización, la existencia de
subunidades modificadoras y proteínas accesorias y la modificación
postranslacional (Gutman et al., 2005). Este grupo está formado por los canales
Kv1-12 dentro de los cuales se encuentran los rectificadores tardíos, los canales
tipo A, los canales tipo M y los tipo EAG.
Los rectificadores tardíos se corresponden con las subunidades Kv1 (Shaker),
Kv2 (Shab) y algunos Kv3 (Shaw). Son canales voltaje dependientes que se
abren con retraso después de la despolarización (alrededor de -30 mV) y con
una inactivación lenta. Estos canales están relacionados con la repolarización
del potencial de acción.
Los canales tipo A están constituidos por las subunidades Kv1.4 (Shaker),
Kv3.4 (Shaw) y Kv4 (Shal). Estos canales se activan a niveles de potenciales
subumbrales y se inactivan durante los pulsos despolarizantes. El proceso de
activación e inactivación es más rápido que el de los canales rectificadores. Su
función principal es la de espaciar los potenciales de acción.
Los canales Kv7.1-7.5 (Kcnq1) son los responsables del transporte de la
corriente M. Esta corriente fue descubierta en 1980 en neuronas simpáticas de
rana por Brown y Adams (Brown and Adams, 1980) y recibe su nombre debido
a que es inhibida por muscarina. Es una corriente de activación lenta, no
inactivante, hiperpolarizante, que se activa alrededor de -60 mV. Esta corriente
juega un papel importante en el control de la excitabilidad neuronal ya que está
implicada en el mantenimiento del reposo y en el mecanismo de adaptación de
algunos tipos celulares (Brown and Adams, 1980;Brown and Constanti,
1980;Romero et al., 2004).
Los canales Kv10.1-12.3 (también conocidos como Kcnh) se corresponden
con los canales tipo EAG, reciben el nombre del acrónimo “ether a-go-go”
debido al fenotipo que presentan los mutantes de dicha proteína en Drosophila,
1
Nótese que la nomenclatura es la utilizada por HGNC (HUGO Gene Nomenclature
Comitte) referente a ratón.
14
Introducción
ya que presentan una sacudida de las patas cuando son expuestos a éter. Los
canales tipo EAG engloban tres subfamilias llamadas eag, erg (eag-related) y
elk (eag-like). Dentro de esta superfamilia el canal más conocido es hERG
cuyas mutaciones causan el síndrome del intervalo QT largo, un tipo de arritmia
cardíaca (Curran et al., 1995).
1.2. 2TM/1P. Canales rectificadores de entrada (Kir).
Formados por los canales Kir1-7 (Kcnj2). Estructuralmente están formados
por cuatro subunidades α, cada una de ellas posee dos segmentos
transmembrana y una región formadora de poro; además carecen de la región
sensor de voltaje (Hibino et al., 2010). La característica más representativa es la
conducción de corrientes de K+ a potenciales más negativos que EK+ y su
independencia de voltaje. La rectificación de entrada característica de este tipo
de canales es el resultado del bloqueo intracelular del poro mediante Mg2+ y
poliaminas. La función principal de estos canales es estabilizar el potencial de
reposo alrededor del EK+.
1.3. 6-7TM/1P. Canales calcio-dependientes (KCa).
Este grupo se caracteriza por ser sensibles a la concentración de Ca2+
intracelular, está constituido por las subunidades KCa1-5. Según su homología y
conductancia dentro de esta familia de canales se distinguen tres grupos: BK,
SK,IK (Wei et al., 2005).
El canal BK (KCa 1.1) es un tetrámero (4 subunidades α y 4 subunidades β),
cada una de las subunidades α se compone de 7 segmentos transmembrana,
posee un segmento transmembrana más que el rectificador (S0), y un dominio
formador de poro, el sensor de voltaje se encuentra situado en S4. Es un canal
2
Nótese que la nomenclatura es la utilizada por HGNC (HUGO Gene Nomenclature
Comitte) referente a ratón.
15
Introducción
calcio y voltaje dependiente con una gran conductancia (100-250 pS). La
principal función celular de este canal es colaborar en la repolarización del
potencial de acción y también en la fase de hiperpolarización rápida (Faber and
Sah, 2003).
Los canales SK (KCa2.1-KCa2.3) poseen una estructura muy similar a los
canales de K+ voltaje dependientes (6TM), aunque estos canales son
independientes del voltaje. Poseen una conductancia muy pequeña. Son
responsables de la hiperpolarización lenta que sigue a algunos potenciales de
acción y dotan de adaptación a las neuronas que los poseen (Faber and Sah,
2003).
1.4. 4TM/2P. Canales de doble dominio de poro (K2P).
En este grupo se encuentran los canales de doble dominio de poro o K2P
(“two-pore domain potassium channel”). Cada subunidad posee cuatro
segmentos transmembrana (M1-M4) y dos dominios formadores de poro, a
diferencia del resto de canales de K+ que solo poseen un domino formador de
poro (figura 2).
Figura 2: Representación esquemática de una subunidad K2P. Cuatro
segmentos transmembrana (M1-M4), dos dominios formadores de poro (P),
extremos aminoterminal y carboxiterminal citoplasmáticos; un bucle
extracelular entre M1 y P.
16
Introducción
Ya que el presente trabajo investiga las propiedades de canales
pertenecientes a la subfamilia K2P, ésta será revisada con mayor detalle a
continuación.
2. CANALES K2P.
2.1. Tipos de canales K2P.
El primer canal con doble dominio de poro fue descubierto en levaduras y se
le llamó TOK1 (Ketchum et al., 1995), aunque su estructura difiere de los
canales K2P presentes en mamíferos, ya que posee ocho dominios
transmembrana (8TM/2P). En mamíferos el primer canal K2P en ser clonado
fue TWIK-1 (Lesage et al., 1996a), a partir de esta fecha se han clonado 15
canales (ver tabla 1). La nomenclatura aprobada por HGNC (HUGO Gene
Nomenclature Committee) utiliza para nombrar a cada uno de los genes el
prefijo KCNK (Kcnk en ratones) seguido de un número diferente para cada gen,
la asignación del número es resultado del orden del descubrimiento del gen, así
los números no reflejan ningún tipo de clasificación por secuencia o función
(Goldstein et al., 2005). La nomenclatura utilizada para la proteína es el prefijo
K2P seguido de un número diferente para cada gen, esta nomenclatura refleja
también las diferentes variantes de cada uno de los canales añadiéndole un
número más a cada una de las variantes descubiertas.
En función de sus características estructurales y funcionales estos canales se
clasifican en seis subfamilias, el nombre de cada subfamilia describe su
principal característica farmacológica o funcional. Las seis familias en que se
agrupan los canales K2P son: TWIK, TREK, TASK, THIK, TALK y TRESK.
En la tabla 1 se muestra la clasificación de las diferentes subfamilias de canales
K2P junto con la nomenclatura utilizada para cada una de ellas.
17
Introducción
Figura 3: Dendrograma de la familia de canales K2P de ratón.
SUBFAMILIA
TWIK
TREK
TASK
THIK
TALK
TRESK
Proteína
Otra
Nºacceso
IUPHAR
nomenclatura
NCBI
Kcnk1
K2p1.1
TWIK-1
NM_008430.2
Kcnk6
K2p6.1
TWIK-2
NM_001033525.3
Kcnk7
K2p7.1
KCNK7
NM_010609.2
Kcnk2
K2p2.1
TREK-1
NM_010607.2
Kcnk10
K2p10.1
TREK-2
NM_029911.4
Kcnk4
K2p4.1
TRAAK
NM_008431.2
Kcnk3
K2p3.1
TASK-1
NM_010608.2
Kcnk9
K2p9.1
TASK-3
NM_001033876.1
Kcnk15
K2p15.1
TASK-5
NM_001030292.1
Kcnk12
K2p12.1
THIK-2
NM_199251.1
Kcnk13
K2p13.1
THIK-1
NM_146037.1
Kcnk16
K2p16.1
TALK-1
NM_029006.1
Kcnk5
K2p5.1
TASK-2
NM_021542.4
Kcnk17
K2p17.1
TALK-2
Kcnk18
K2p18.1
TRESK
HGNC
NM_207261.3
Tabla1: Resumen de la nomenclatura utilizada para los canales K2P, nº
acceso NCBI para ratón.
18
Introducción
2.1.1. TWIK “Tandem of Pore domains in a Weak Inward rectifier K+
channel”.
Esta subfamilia está compuesta por tres miembros: TWIK-1 (Lesage et al.,
1996a), TWIK-2 (Chavez et al., 1999) y KCNK7 (Salinas et al., 1999). TWIK-1
y TWIK-2 presentan una rectificación de entrada en concentraciones simétricas
de K+ (Lesage et al., 1997;Patel et al., 2000), esta característica le confiere el
nombre a la subfamilia. Respecto a la subunidad KCNK7 hasta el momento no
se ha detectado la expresión funcional del canal. TWIK-1 posee una
conductancia de 32 pS a -80mV en condiciones de K+ simétrico (Lesage et al.,
1996a); la conductancia de TWIK-2 es muy pequeña, menor que 5 pS a -80 mV
en K+ simétrico (Patel et al., 2000). Ambos canales son activados a través de la
proteína quinasa C (PKC) e inhibidos mediante la acidificación del medio
intracelular (Chavez et al., 1999;Lesage et al., 1996a). Recientemente ha sido
cristalografiada la estructura de TWIK-1 de humano (Miller and Long, 2012).
2.1.2. TREK “TWIK-Related K+ channel”.
Esta subfamilia comprende los canales TREK-1 TREK-2 y TRAAK (TWIKRelated Arachidonic Acid stimulated K+ channel) y se discuten con más detalle
en la sección 3.
2.1.3. TASK “TWIK-related Acid-Sensitive K+ channel”.
Esta subfamilia está formada por: TASK-1 (Duprat et al., 1997), TASK-3
(Rajan et al., 2000) y TASK-5 (Ashmole et al., 2001;Kim and Gnatenco, 2001).
Únicamente TASK-1 y TASK-3 forman canales iónicos funcionales; la
inclusión de TASK-5 se ha hecho en función de su similitud estructural. La
propiedad fundamental de esta subfamilia es la sensibilidad de sus canales al pH
extracelular, TASK-1 y TASK-3 son fuertemente inhibidos mediante la
19
Introducción
acidificación extracelular. La sensibilidad al pH es diferente entre los dos
canales, mientras que TASK-1 es fuertemente inhibido dentro del rango
fisiológico de pH, TASK-3 es inhibido en condiciones de pH extracelular más
ácidas (Duprat et al., 1997;Kim et al., 2000;Lopes et al., 2001;Meadows and
Randall, 2001;Morton et al., 2003).
La corriente macroscópica de TASK-1, es decir, la corriente a través de
todos los canales TASK-1 de la membrana, presenta rectificación de canal
abierto (“open rectification”), mostrando una rectificación de salida en
concentraciones fisiológicas de K+ que desaparece en condiciones de K+
simétricas (Duprat et al., 1997). La corriente macroscópica de TASK-3 a
diferencia de TASK-1, exhibe una rectificación de salida tanto en
concentraciones de K+ simétricas como asimétricas (Rajan et al., 2000).
Por el contrario, en registros de canal individual ambos canales muestran
rectificación de entrada. En concentraciones simétricas de K+ (150 mM) la
conductancia unitaria de TASK-1 es de 14 pS a -60 mV (Kang et al., 2004b),
mientras que la conductancia de TASK-3 es de 27-38 pS a -60 mV (Kang et al.,
2004b;Kim et al., 2000). Está descrita la inhibición de corrientes tipo TASK a
través de receptores acoplados a proteínas Gαq (Chemin et al., 2003;Talley et al.,
2000).
Se ha demostrado que una mutación en la copia materna del gen de TASK-3 en
humanos, es la causante de un síndrome que conlleva retraso mental e
hiperactividad (Barel et al., 2008).
2.1.4. TALK “TWIK related Alkaline pH activated K+ channel”.
Esta subfamilia está formada por TALK-1 (Girard et al., 2001), TALK-2 y
TASK-2 (Reyes et al., 1998). En humanos destaca la expresión de TALK-1 y
TALK-2 de manera específica en el páncreas exocrino (Duprat et al.,
2005;Girard et al., 2001), sin embargo el patrón de expresión de estos canales
en ratas no es tan específico (Kang and Kim, 2004). La característica más
20
Introducción
destacable de esta subfamilia es la activación de todos sus miembros en
condiciones de alcalinidad extracelular (Girard et al., 2001;Kang and Kim,
2004). A nivel de canal individual, las curvas I/V de TALK-1 y TALK-2
muestran rectificación de entrada en condiciones de K+ simétricas, con unas
conductancias a -60 mV, de 21 pS y 33 pS respectivamente (Kang and Kim,
2004). TASK-2 presenta una conductancia de 60 pS y una I/V lineal (Reyes et
al., 1998). TALK-1 y TALK-2 no muestran ningún tipo de regulación a través
de receptores acoplados a proteínas Gαq ni Gαi (Girard et al., 2001).
Ratones knockout para TASK-2 presentan alteración en la reabsorción de
NaHCO3, mostrando síntomas similares a los provocados por la acidosis renal
tubular (Warth et al., 2004).
2.1.5. THIK “Tandem-pore domain Halothane-Inhibited K+ channel”.
Esta subfamilia engloba los canales THIK-1 y THIK-2 (Rajan et al., 2001).
La corriente macroscópica de THIK-1 presenta una rectificación de entrada en
concentraciones de K+ simétricas, THIK-2 no ha podido ser expresado
funcionalmente (Rajan et al., 2001).
2.1.6. TRESK “TWIK-Related Spinal cord K+ channel”.
Esta subfamilia consta únicamente de un canal, TRESK (Sano et al., 2003).
La identidad de la secuencia de aminoácidos en ratón y humano es baja, lo que
conlleva diferentes propiedades del canal en función de la especie (Kang et al.,
2004c). En ratón la conductancia unitaria del canal es de 14 pS a +60 mV
mostrando una I/V prácticamente lineal (Kang and Kim, 2006). La regulación
de TRESK a través de receptores acoplados a proteínas G presenta diferencias
respecto a otras subfamilias de canales K2P, ya que TRESK es activado
mediante la elevación de los niveles de Ca2+ citoplasmático (Czirják et al.,
2004).
21
Introducción
2.2. Estructura general canales K2P.
Los canales K2P son proteínas con 300-500 residuos aminoacídicos que
presentan, como se ha mencionado anteriormente, cuatro segmentos
transmembrana (M1-M4) y dos dominios formadores de poro (P1, P2) situados
entre M1-M2 y M3-M4 (figura 2). Además contienen un dominio aminoterminal (NH2) corto y uno carboxi-terminal (COOH) largo, ambos dominios
son citoplasmáticos. Entre el primer segmento transmembrana M1 y el primer
dominio formador de poro se encuentra un bucle extracelular implicado en la
dimerización de las subunidades (Lesage and Lazdunski, 2000). La estructura
predicha para el bucle extracelular es de una hélice alfa con un residuo de
cisteína que posibilita la formación de puentes disulfuro entre las diferentes
subunidades, y que permite la dimerización de las mismas (Lesage et al.,
1996b). Estos canales son funcionales como dímeros (Lesage et al., 1996b), al
contrario de lo que sucede con los canales de K+ con un dominio formador de
poro que se ensamblan como tetrámeros, ya que se necesitan los cuatro
dominios formadores de poro para formar el canal selectivo para K + (Doyle et
al., 1998). Los canales K2P son funcionales principalmente como homodímeros
aunque se ha descrito la formación de heterodímeros para algunos de ellos, por
ejemplo TASK-1/TASK-3 (Czirják and Enyedi, 2002). La homología de
secuencia entre las diferentes canales es baja, todos poseen el motivo
G(Y/F/L)G, el cual es imprescindible para la formación de un canal funcional
de K+ (Heginbotham et al., 1994).
2.3. Función general de canales K2P.
Clásicamente se acepta la existencia de una corriente de fuga, independiente
del voltaje, implicada en el mantenimiento del potencial de reposo. En 1952
Hodgkin y Huxley postularon la existencia de dicha corriente, aunque no
especificaron
22
su
composición
iónica
(Hodgkin
and
Huxley,
1952).
Introducción
Posteriormente en 1987 en axones de rata tratados con TEA, 4-AP y Cs+, se
observó una pronunciada rectificación de salida sugiriendo la presencia de una
corriente de fuga de K+ (Baker et al., 1987). La existencia de un canal de K+
independiente de voltaje, y regulado a través de receptores muscarínicos
también fue descrita en neuronas simpáticas (Koyano et al., 1992). En el mismo
tipo neuronal se describió la dependencia del potencial de reposo de corrientes
de K+ que no eran bloqueadas por los bloqueantes clásicos (TEA, 4-AP, Cs+)
(Jones, 1989).
Tras el descubrimiento de TOK1 en levaduras (Ketchum et al., 1995) y la
posterior clonación de los canales K2P de mamíferos, el análisis de las
propiedades biofísicas de estos canales los revelaron como el correlato
molecular de los canales clásicos de fuga.
Un canal de fuga ideal, debería ser independiente del voltaje, teniendo igual
probabilidad de apertura a todos los voltajes. De este modo estarían abiertos
también en el rango de voltajes del potencial de reposo y por tanto contribuirían
al mismo. Además no debería tener dependencia del tiempo y carecer de
cinética de activación, inactivación y deactivación. En estas condiciones la
curva I/V para estos canales sería lineal a concentraciones simétricas de K+, la
corriente generada por estos canales tendría un comportamiento óhmico.
Los canales K2P muestran rectificación de canal abierto (“open
rectification”), en condiciones fisiológicas de K+ (alta [K+] intracelular, baja
[K+] extracelular) conduciendo mejor corrientes de salida que de entrada. Este
tipo de rectificación también llamada Goldman–Hodgkin–Katz (GHK) ya que
es predicha por su ecuación, está causada por la diferencia de concentraciones
de los iones a ambos lados de la membrana (Goldman, 1943;Hodgkin and Katz,
1949). En condiciones de K+ simétricas, las curvas I/V de las corrientes
macroscópicas son en algunos casos lineales, sin embargo algunos de ellos
siguen manteniendo algún tipo de rectificación. Estas desviaciones de una I/V
ideal de un canal de fuga se atribuyen en muchos casos al bloqueo por iones
intracelulares y extracelulares (K+, Mg2+) o a una ligera dependencia del voltaje.
23
Introducción
En cuanto a las propiedades biofísicas de los canales K2P destacan en
muchos casos la carencia de inactivación, así como su independencia de voltaje;
por lo tanto estos canales estarían activos a todos los potenciales de membrana.
Otro aspecto importante es la regulación de estos canales por gran variedad de
estímulos físico-químicos (pH, temperatura, deformación membrana, ácidos
grasos, anestésicos) y receptores acoplados a proteínas G (ver revisión(Enyedi
and Czirják, 2010;Lotshaw, 2007).
Aunque los K2P no cumplen exactamente todos los criterios de un canal de
fuga, sus características son las más aproximadas a un canal de fuga ideal;
además su sensibilidad a múltiples estímulos, convierte a estos canales en
sensores y transductores capaces de regular la excitabilidad celular.
3. SUBFAMILIA DE CANALES TREK.
Esta subfamilia está compuesta por tres miembros: TREK-1, TREK-2 y
TRAAK. El primero de ellos, TREK-1 se descubrió en el año 1996 (Fink et al.,
1996); posteriormente se clonaron los otros dos canales TRAAK (TWIKRelated Arachidonic-Acid-stimulated K+ channel) (Fink et al., 1998) y TREK-2
(Bang et al., 2000). Esta subfamilia se distingue de otras subfamilias en que sus
canales poseen una conductancia unitaria bastante más elevada. Entre las
propiedades más destacadas se encuentra su regulación por múltiples estímulos
como por ejemplo: deformación de la membrana (Bang et al., 2000; Maingret et
al., 1999; Patel et al., 1998), temperatura (Maingret et al., 2000; Kang et al.,
2005), ácidos grasos insaturados (PUFAS) (Fink et al., 1998; Kim et al., 2001;
Maingret et al., 1999; Maingret et al., 2000), anestésicos volátiles (Patel et al.,
1999), pH (Bang et al., 2000;Maingret et al., 1999b), y la regulación por
diversos receptores acoplados a proteínas G (Chemin et al., 2003;Kang et al.,
2008;Lesage et al., 2000b;Lopes et al., 2005).
24
Introducción
3.1. Estructura de canales TREK.
Los canales TREK comparten la estructura general de los canales K2P: dos
segmentos formadores de poro (P1 y P2) flanqueados cada uno de ellos por dos
segmentos transmembrana (M1-M2, M3-M4), un bucle extracelular entre M1 y
P1, un dominio NH2 terminal y un dominio COOH, ambos citoplasmáticos.
La estructura de los canales de esta subfamilia presenta algunas
particularidades que se describen a continuación. El bucle extracelular de
TRAAK contiene una cisteína en la posición 52 (Cys52), análoga a la cisteína
69 de TWIK1, que permite la dimerización de subunidades mediante puentes
disulfuro; además también contiene dos sitios consenso para N-glicosilación en
las posiciones 81,84 (Fink et al., 1998). Las posiciones para N-glicosilación
también existen en TREK-2 (144,147) y TREK-1 (95,120) (Bang et al.,
2000;Fink et al., 1996). El extremo COOH juega un papel importante en cuanto
a la regulación de los canales por diversos estímulos; los tres miembros de esta
subfamilia presentan en dicho extremo lugares para la fosforilación por PKA y
PKC (Bang et al., 2000;Fink et al., 1996;Fink et al., 1998). A principios del año
2012 ha sido cristalografiada la estructura de TRAAK (Brohawn et al., 2012)
(figura 3).
Figura 4: Estructura tridimensional de TRAAK (obtenida de Protein Data
Bank, código 3UM7).
25
Introducción
Existen diferentes variantes activas de cada uno de los canales generados por
“splicing” o traducción alternativa, así por ejemplo han sido descritas: dos
variantes para TREK-1 (Xian et al., 2006), tres variantes para TREK-2 (Gu et
al., 2002;Mirkovic and Wickman, 2011) y dos variantes para TRAAK (Ozaita
and Vega-Saenz de Miera, 2002). Además también se ha descrito la existencia
de variantes truncadas para TRAAK y TREK-2 (Fink et al., 1998;Mirkovic and
Wickman, 2011).
3.2. Expresión y distribución de los canales TREK.
Los canales de la subfamilia TREK se encuentran ampliamente distribuidos
tanto en el sistema nervioso como en órganos periféricos, a continuación se
muestra una tabla con las diferentes localizaciones de los canales de esta
subfamilia en el sistema nervioso. Como se observa en la tabla 2, existen una
gran cantidad de datos sobre la expresión de los canales TREK en el sistema
nervioso central (SNC) y en el sistema nervioso periférico somático (SNP) pero
es escasa la información sobre la expresión en sistema nervioso autónomo
(SNA), la mayor parte fue obtenida en este trabajo, que ha sido publicado
parcialmente (Cadaveira-Mosquera et al., 2012;Cadaveira-Mosquera et al.,
2011;Lamas, 2012).
26
Introducción
TREK-1
m
r
h
TREK-2
m
r
h
TRAAK
m
r
h
+
+
+
+
SISTEMA NERVIOSO CENTRAL
Accumbens 9,11,17-19,24
Amígdala
7,8,9,11,14,17-19,24
+
9,11,24
Núcleo arcuato
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Ganglios basales 7,8,9,11,14,17-19,21,24
+
+
+
Núcleo caudado 1,7,8,11,14,18,19,21
+
+
+
+
Cerebelo 1,2,7,8,11,13,14,17-19,21,23,24
+
+
+
+
Núcleo coclear
Colículo
11,21,24
+
1,11
Corteza cerebral
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
9
+
+
+
+
Núcleo facial 9,11
+
+
Núcleo gigantocelular 9
+
+
Glía 8
+
+
6,22,28
+
+
+
7,9,11,18,24
+
+
+
+
+
+
+
+
Glía (astrocitos)
Globo pálido
7,8,9,24
Hipocampo
Hipogloso
1,7,8,9,11,13,14,17-19,21,24
9
+
+
+
Hipotálamo 7,8,9,11,16-19,21,23,24
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Locus coeruleus 9,18,24
+
+
+
+
Mesencéfalo
2,7,11
Oculomotor
11
Bulbo olfatorio
Oliva
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
7,8,9,21,24
+
11
+
+
+
+
+
+
+
Puente troncoencefálico 2,7,8,9,21,24
+
+
Putamen 1,7,8,9,11,14,18,19,21
+
+
Rafe 9,11,24
Núcleo rojo
Septum
+
+
+
Médula
+
+
Núcleo interpeduncular 9,11,24
2,7,8,14,18
+
+
+
Núcleo motor dorsal del vago
Habénula
+
+
1,7,8,9,11,14,17,19,21,24
+
11,24
11,24
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
27
Introducción
TREK-1
m
r
h
TREK-2
m
r
h
TRAAK
m
r
h
SISTEMA NERVIOSO CENTRAL
Núcleo solitario
9,24
+
Médula espinal
2,8,11,14,15,17-19,21,24
+
Estriado
18,21,24
Subiculum
+
+
+
+
1,8,11,21
+
Núcleo subtalámico 11,24
+
Supraóptico 9,10,24
Trigémino N. (motor)
9
Tigémino N. (espinal)
9,11,21,24
Trigémino N. (principal)
Núcleo vestibular
+
+
+
11
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Tálamo 1,2,7,8,7,9,11,14,17-19,21,24
+
+
+
Substantia nigra 7,8,11,14,17-19,24
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
11,21,24
+
SISTEMA NERVIOSO AUTÓNOMO Y SOMÁTICO
Cuerpo carotídeo 26
+
DRG 5,12,24,26
+
+
Fibroblastos 20,26
+
+
Glía 20
+
+
+
+
Ganglio nodoso 4,27
Ganglio cervical superior
Retina
3,4
+
+
+
+
8,21
+
+
+
Ganglio trigeminal
23,25
Ganglio vestibular
20
+
+
+
+
+
+
+
Tabla 2: Expresión de canales TREK en el sistema nervioso. m: Mus
musculus, r:Rattus norvegicus, h: humano. Para revisión ver (Lamas, 2012)
1.(Aller and Wisden, 2008) 2.(Bang et al., 2000) 3.(Cadaveira-Mosquera et al., 2011)
4.(Cadaveira-Mosquera et al., 2012) 5. (Dobler et al., 2007) 6. (Ferroni et al., 2003)
7. (Fink et al., 1996) 8. (Fink et al., 1998) 9. (Gu et al., 2002) 10. (Han et al., 2003)
11. (Hervieu et al., 2001) 12. (La et al., 2011) 13. (Lauritzen et al., 2000) 14.(Lesage
et al., 2000b) 15. (Maingret et al., 1999a)16. (Maingret et al., 2000a) 17. (Meadows
et al., 2000) 18.(Meadows et al., 2001) 19. (Medhurst et al., 2001) 20. (Nicolas et al.,
2004) 21. (Reyes et al., 2000) 22. (Seifert et al., 2009) 23. (Simkin et al., 2008) 24.
(Talley et al., 2001) 25. (Yamamoto et al., 2009) 26. (Yamamoto and Taniguchi, 2006)
27. (Zhao et al., 2010) 28. (Zhou et al., 2009).
28
Introducción
3.3. Propiedades electrofisiológicas.
Considerando las características de un canal de fuga, las corrientes
macroscópicas deberían mostrar una I/V lineal en concentraciones simétricas de
K+; aunque como se ha mencionado anteriormente (ver 2.3), los canales K2P no
siempre se comportan como canales de fuga “ideales”. A continuación se
describen las propiedades de las corrientes macroscópicas y de canal individual
de cada uno de los canales de la subfamilia TREK.
3.3.1. TREK-1.
En condiciones de K+ simétricas la curva I/V de canal individual para
TREK-1 muestra una rectificación de salida (Fink et al., 1996;Patel et al.,
1998); sin embargo, en ausencia de cationes divalentes (Ca2+, Mg2+) esta
rectificación desaparece mostrando una I/V lineal (Maingret et al., 2002;Xian et
al., 2006). Las conductancias observadas para TREK-1 son de 100 a 130 pS a
potenciales de membrana positivos (Honore et al., 2002;Patel et al., 1998;Xian
et al., 2006); además las diferentes variantes de splicing alternativo presentan
conductancias diferentes (Xian et al., 2006). TREK-1 posee cierto grado de
dependencia de voltaje, la probabilidad de apertura se reduce de manera
significativa pero no totalmente a potenciales de membrana negativos (Maingret
et al., 2002). La variante de TREK-1 originada por una traducción alternativa
posee un extremo NH2 más corto, convirtiendo al canal en permeable tanto a K+
como a Na+ (Thomas et al., 2008).
Las corriente macroscópica de TREK-1 presenta una curva I/V con
rectificación de salida en concentraciones de K+ fisiológicas, cuando los
experimentos se realizan en concentraciones simétricas de K + aumentan las
corrientes de entrada a potenciales negativos, aunque la I/V nunca llega a ser
lineal, (Maingret et al., 2002;Patel et al., 1998). Se ha visto que el bloqueo de
las corrientes de entrada TREK-1 a potenciales negativos depende de la
presencia de Ca2+ y Mg2+ extracelular, además también se ha descrito la
29
Introducción
sensibilidad al K+ y Na2+ extracelular (Maingret et al., 2002;Meadows et al.,
2000).
3.3.2. TREK-2.
A diferencia de TREK-1, los canales individuales TREK-2, en condiciones
de K+ simétricas, muestran una I/V con una clara rectificación de entrada. La
conductancia aumenta a valores de voltaje negativos, con valores de 68 pS a +
40mV y 110 pS a -40 mV (Bang et al., 2000;Kim et al., 2001a;Lesage et al.,
2000b) al contrario de lo que sucede con TREK-1. En ausencia de cationes
divalentes en el medio extracelular, la conductancia aumenta aproximadamente
el doble (Gu et al., 2002). La probabilidad de apertura de este canal se
incrementa con la despolarización (Bang et al., 2000). TREK-2 se puede
distinguir claramente de TREK-1 ya que presenta una rectificación de entrada
que no presenta TREK-1 (Kang et al., 2005). Se han identificado 3 variantes de
TREK-2 en función del inicio de la traducción, presentando cada una de ellas
conductancias diferentes (Gu et al., 2002;Mirkovic and Wickman, 2011;Simkin
et al., 2008).
Las corriente macroscópica de TREK-2 presenta una curva I/V con
rectificación de salida en concentraciones de K+ fisiológicas (Bang et al., 2000).
TREK-2 al igual que TREK-1 se inhibe con la eliminación de Na+ extracelular,
y las corrientes de entrada a potenciales negativos también se incrementan con
la presencia de K+ extracelular (Lesage et al., 2000b).
3.3.3. TRAAK.
Las curvas I/V de canal individual presentan rectificación de entrada en
condiciones de K+ simétricas (aunque menos que TREK-2), no se ha detectado
afectación de la rectificación por Mg+ extracelular (Kim et al., 2001a). La
conductancia descrita para este canal es de 45 pS (entre 0 y +60 mV) (Fink et
30
Introducción
al., 1998) y 110 pS a -40 mV (Han et al., 2003). Igual que TREK-2 este canal es
ligeramente dependiente del voltaje, es decir, la probabilidad de apertura
aumenta a valores de voltajes positivos (Han et al., 2003;Kim et al., 2001a).
La corriente macroscópica de TRAAK sigue la ecuación de GHK, a
concentraciones fisiológicas de K+ la I/V presenta rectificación de salida y en
concentraciones de K+ simétricas es lineal. (Meadows et al., 2001;Ozaita and
Vega-Saenz de Miera, 2002).
3.4. Moduladores farmacológicos.
Una característica destacada de los canales K2P es la insensibilidad a
bloqueantes clásicos de canales de K+. Está descrita la insensibilidad de TREK1, TREK-2 y TRAAK a TEA, 4-AP y Cs+ (Bang et al., 2000;Fink et al.,
1996;Fink et al., 1998;Lesage et al., 2000b).
Respecto al Ba2+, bloqueante de canales tipo M, están descritos efectos
contradictorios sobre los canales de la subfamilia TREK. En TREK-1 se ha
detectado inhibición pero también la falta de efecto del Ba2+, TREK-2 es
insensible a bajas concentraciones (µM) y bloqueado a concentraciones de 2
mM, TRAAK en ratón se muestra insensible a bajas concentraciones y es
bloqueado a concentraciones de 1 mM (Bang et al., 2000;Fink et al., 1996;Fink
et al., 1998;Kim et al., 2005;Patel et al., 1998).
La quinina un alcaloide con propiedades antipiréticas, antipalúdicas y
anestésicas también ha sido probado sobre esta subfamilia generando resultados
contradictorios: está descrita la inhibición y la insensibilidad de TREK-1 y
TREK-2, mientras que para TRAAK la quinina no ha mostrado tener ningún
efecto (Bang et al., 2000;Fink et al., 1996;Lesage et al., 2000a;Lesage et al.,
2000b;Patel et al., 1998).
El colorante policatiónico rojo de rutenio inhibe canales TRAAK pero sin
embargo no tiene efecto sobre TREK-1 (Czirják and Enyedi, 2002).
Existen evidencias de que el Zn2+ provoca la activación de TREK-1 y TREK2 en ratón (Czirjak and Enyedi, 2006;Kim et al., 2005) y la inhibición de
31
Introducción
TRAAK (Czirjak and Enyedi, 2006), aunque en humanos también se ha
detectado al inhibición de TREK-1 mediante Zn2+ pero a grandes
concentraciones (mM) (Gruss et al., 2004b).
Los canales de esta subfamilia también están modulados por anestésicos,
ácidos grasos y el agentes neuroprotectores como el riluzol (ver 3.7).
3.5. Moduladores físico-químicos.
3.5.1. Mecanosensibilidad.
Esta es una de las características que mejor define a los canales TREK ya
que es la única subfamilia de los canales K2P que posee mecanosensibilidad. A
presión atmosférica la actividad de los canales es muy baja, y se incrementa de
manera notable y reversible mediante la aplicación de presión negativa a través
del electrodo de registro cuando el canal es registrado en las modalidades
“outside-out” y “cell-attached” (Bang et al., 2000;Kim et al., 2001a;Maingret et
al., 1999b). Esta mecanosensibilidad no depende de la integridad del
citoesqueleto; en presencia de colchicina no se altera la activación de los
canales por estiramiento de la membrana, indicando que la mecanosensibilidad
se produce por deformación de la membrana (Patel et al., 1998). La
mecanosensibilidad además está modulada por otros factores como por ejemplo
el voltaje y el pH intracelular. La mecanosensibilidad de TRAAK es mayor a
potenciales de membrana positivos y se incrementa en condiciones de pH
intracelular alcalino (Kim et al., 2001a;Maingret et al., 1999a). La
mecanosensibilidad de TREK-1 y TREK-2 también está influenciada por el pH.,
al contrario de lo que sucede con TRAAK, acidificando el pH intracelular
disminuye la presión necesaria para obtener la presión media máxima necesaria
para la estimulación de los canales (Kim et al., 2001b;Maingret et al., 1999b).
En TREK-1 el estrés tipo cizalla (‘shear stress’) incrementa la amplitud de
las corrientes; además la corriente macroscópica de TREK-1 es sensible al
volumen celular, en soluciones de baño hipotónicas se produce incremento
32
Introducción
volumen celular que conlleva un incremento de la corriente macroscópica de
TREK-1 (Patel et al., 1998). Ratones TREK-1-/- y doble knockout TREK-1-/TRAAK -/- presentan un incremento en la sensibilidad a estímulos mecánicos
(Noel et al., 2009).
3.5.2. Termosensibilidad.
Los tres miembros de la subfamilia TREK son sensibles a la temperatura,
incrementando su actividad al aumentar la temperatura (Kang et al.,
2005;Maingret et al., 2000a). El incremento de temperatura de 22ºC a 42ºC
conlleva una fuerte activación de las corrientes de TREK-1, encontrándose la
máxima sensibilidad a temperaturas de 32ºC a 37ºC; a temperaturas inferiores a
16ºC se suprime la actividad basal de dicho canal (Maingret et al., 2000a). En la
sensibilidad a la temperatura está implicado el extremo C-terminal del canal ya
que la deleción del mismo reduce la activación por temperatura de TREK-1, por
el contrario el C-terminal de TREK-2 no parece estar implicado ya que aunque
se reemplace el canal sigue manteniendo la sensibilidad (Kang et al.,
2005;Maingret et al., 2000a) La activación térmica de TREK-1 requiere el
mantenimiento de la integridad celular ya que en experimentos realizados en
patch escindido se pierde la sensibilidad a la temperatura, sugiriendo la
implicación de un factor citosólico (Maingret et al., 2000a). El incremento de
actividad debido a la temperatura consiste en el incremento en la frecuencia de
aperturas de los mismos (Kang et al., 2005). La sensibilidad a temperatura de
TREK-1 y TREK-2 no presenta dependencia de voltaje (Kang et al., 2005).
Los canales TREK se expresan en neuronas sensoriales implicadas en la
transducción de la sensación térmica y la termonocicepción (Alloui et al.,
2006;Kang et al., 2005;Medhurst et al., 2001); además TREK-1 se encuentra
fuertemente expresado en regiones hipotalámicas implicadas en el control de la
temperatura corporal (Maingret et al., 2000a). Ratones TRAAK-/- y dobles KO
para ambos presentan hiperalgesia al calor a temperaturas en un rango de 46ºC a
50ºC (Alloui et al., 2006;Noel et al., 2009).
33
Introducción
3.5.3. pH.
TREK-1 y TREK-2 son activados por acidificación intracelular, este efecto
es visible a todos los potenciales de membrana (Bang et al., 2000;Honore et al.,
2002;Lesage et al., 2000b;Maingret et al., 1999b). El extremo C-terminal está
implicado en la sensibilidad al pH intracelular en TREK-1 y TREK-2, la
deleción progresiva del mismo implica la pérdida de activación por pH de los
canales (Kim et al., 2001b;Maingret et al., 1999b). Estudios posteriores han
revelado que en TREK-1 el glutamato de la posición 306 en el extremo COOHterminal podría ser un sensor de protones, mutantes para dicho residuo resultan
resistentes a la acidificación (Honore et al., 2002).
El mecanismo de regulación de pH en TRAAK es diferente ya que su
extremo C- terminal no está implicado en la sensibilidad al pH intracelular (Kim
et al., 2001a). TRAAK es activado por alcalinización del pH intracelular, a pH
8.4 intracelular se produce un incremento de 14 veces en la actividad del canal
(Kim et al., 2001a) y no muestra sensibilidad a la acidificación intracelular
(Fink et al., 1998).
Respecto a la sensibilidad al pH extracelular para TREK-1 se han obtenido
resultados contradictorios, TREK-1 en rata no resultó sensible a acidificación
del pH extracelular (Zhou et al., 2009), mientras que TREK-1 de humano
resultó inhibido por acidificación extracelular (Cohen et al., 2008), las
diferencias en la sensibilidad se atribuían principalmente a la especie.
Posteriormente se publicó que TREK-1 era inhibido por acidificación
extracelular sin encontrar diferencias entre especies (humano y ratón) (Sandoz
et al., 2009). Respecto a la sensibilidad al pH extracelular de TREK-2 también
se han publicado resultados contrapuestos, en un principio se describió que
acidificación del medio extracelular no tenía ningún efecto sobre el canal,
(Lesage et al., 2000b) y posteriormente que la acidificación provoca la
activación del mismo (Sandoz et al., 2009). En ambos canales TREK-1 y
TREK-2, la sensibilidad al pH extracelular reside en un residuo de histidina
34
Introducción
situado en el bucle extracelular (Sandoz et al., 2009). TRAAK no presenta
sensibilidad a la acidificación extracelular (pH 5.4), por el contrario se produce
un ligero incremento de las corrientes tipo TRAAK tras la alcalinización del
medio extracelular (pH 9.7) (Fink et al., 1998).
3.6. Regulación por proteínas G.
La subfamilia TREK al igual que otras subfamilias de canales K2P presenta
regulación a través de proteínas G.
TREK-1 y TREK-2 al contrario de TRAAK (Fink et al., 1998) son inhibidos
a través de receptores acoplados a proteínas Gαs, que estimulan la adenilato
ciclasa (AC) provocando un incremento de los niveles de AMPc intracelular y
en último lugar la activación de la proteína quinasa A (PKA). El extremo Cterminal de TREK-1 y TREK-2 presenta sitios potenciales para fosforilación
por PKA (residuos S333 and S351 en TREK-1 y ser 326 en TREK-2) (Bang et
al., 2000;Fink et al., 1996;Patel et al., 1998). La aplicación de activadores de la
PKA (IBMX o forskolina) provocan la inhibición de los canales TREK-1 y
TREK-2 (Fink et al., 1996;Lesage et al., 2000b). La mutación de los sitios de
fosforilación por PKA en el extremo C-terminal de TREK-1 suprime la
regulación del canal por AMPc (Maingret et al., 2000a;Patel et al., 1998),
además la aplicación del análogo permeable de AMPc (8-CPT-cAMP) provoca
la inhibición de TREK-1 y TREK-2 (Bang et al., 2000;Lesage et al.,
2000b;Maingret et al., 2000a). Como es de esperar la estimulación de receptores
acoplados a proteína Gαs (5-HTs) provoca la inhibición de TREK-1 y TREK-2
(Lesage et al., 2000b;Patel et al., 1998).
Por el contrario la estimulación de proteína Gαi provoca la inhibición de la
AC y consecuentemente un decrecimiento de los niveles de AMPc intracelular,
la activación de receptores acoplados a esta proteína como (mGluR2 o α2Aadrenérgicos ) conlleva un incremento en la actividad de los canales TREK
(Lesage et al., 2000b;Xiao et al., 2009).
35
Introducción
TREK-1 y TREK-2 también son regulados a través de receptores acoplados
a proteínas Gαq, la estimulación de receptores como mGluR1, M1 o M3 provoca
la inhibición de estos canales (Chemin et al., 2003;Kang et al., 2008;Lopes et
al., 2005). La activación de la proteína Gαq provoca la activación de la
fosfolipasa C (PLC) que hidroliza el fosfatidilinositol 4,5-bifosfato (PIP2)
generando inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG). El mecanismo
de inhibición de TREK-1 y TREK-2 a través de la proteína Gαq no está
totalmente establecido, ya que esta ruta metabólica implica una gran variedad de
segundos mensajeros y varios de ellos parecen tener un papel relevante en la
regulación de estos canales.
La inhibición de la PLC mediante el uso de un inhibidor específico como
U732122 provoca la desaparición de la inhibición de TREK a través de
receptores acoplados a proteína Gαq (Chemin et al., 2003), indicando que la
activación de la PLC es un mecanismo imprescindible. La aplicación de un
análogo de DAG provoca la inhibición de las corrientes transportadas por
TREK-1 y TREK-2 (Chemin et al., 2003) sin embargo, también se ha publicado
que la aplicación de análogos de DAG no tiene efectos en las corrientes
transportadas por TREK-1 (Lopes et al., 2005). En diversos estudios se ha
descartado la participación del Ca2+ y de IP3 (Chemin et al., 2003;Fink et al.,
1996;Lesage et al., 2000b).
El papel de la PKC también ha sido sugerido como mecanismo de inhibición
ya que los canales TREK-1 y TREK-2 son inhibidos a través de activadores de
la PKC (PMA PDBu) (Fink et al., 1996;Kang et al., 2006;Maingret et al.,
2000b), aunque en este punto también los resultados son contradictorios ya que
otros autores han descrito la falta de efecto de activadores de la PKC (Chemin et
al., 2003). En nuestro grupo se ha observado que la disminución de los niveles
de PIP2 provoca la inhibición de TREK-2 (Rivas-Ramírez et al., 2012) .
En la figura 5 se muestra un esquema de la regulación de los canales TREK1 y TREK-2.
36
Introducción
Figura 5: Esquema de la regulación de los canales TREK-1 y TREK-2. Los
canales de esta subfamilia son activados mediante: acidosis intracelular,
anestésicos, incremento de temperatura, PUFAs, riluzol. La activación de
receptores acoplados a proteínas Gαq y Gαs provoca la activación de la PKC y
PKA que fosforilan el extremo C-terminal de los canales causando la
inhibición de los mismos. La activación de receptores acoplados a la
proteína Gαi provoca un descenso en los niveles de AMPc y el bloqueo de la
PKA causando una activación de los canales.
37
Introducción
3.7. Interés fisiopatológico.
3.7.1. Neuroprotección.
Los tres miembros de la subfamilia TREK son activados de manera reversible
por ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs), de hecho esta propiedad le confiere
nombre a TRAAK (TWIK-Related Arachidonic Acid-stimulated K+ cannel). La
aplicación de ácido araquidónico activa TREK-1 (Patel et al., 1998), TREK-2
(Bang et al., 2000;Lesage et al., 2000b) y TRAAK (Fink et al., 1998). Está
descrito también que otros PUFAS como como ácido linoleico, ácido oleico
y ácido docosahexaenoico provocan la activación de TREK-1, TREK-2 y
TRAAK (Bang et al., 2000;Fink et al., 1998;Lesage et al., 2000b;Patel et
al., 1998). Sin embargo, los ácidos grasos saturados (SFA) como los ácidos
palmítico y esteárico no tienen efecto sobre ninguno de los tres miembros de la
subfamilia TREK (Bang et al., 2000;Fink et al., 1998;Lesage et al.,
2000a;Lesage et al., 2000b;Maingret et al., 2000b;Patel et al., 1998).
La activación mediante AA y PUFAs se mantiene en experimentos
realizados en patch escindido sugiriendo que el efecto de los mismos es
mediante la interacción directa con el canal (Fink et al., 1998;Maingret et al.,
1999a;Patel et al., 1998); la activación también se mantiene en presencia de
inhibidores de la ciclooxigenasa y lipooxigenasa indicando que el efecto es
independiente del metabolismo del AA (Fink et al., 1998). Se ha demostrado
que los primeros 30 aa del extremo C-terminal de TREK-1 y TREK-2 son
críticos para la activación mediante AA (Kim et al., 2001b;Patel et al., 1998) sin
embargo,
el extremo C-terminal de TRAAK no está implicado en dicha
regulación ya que la sustitución del mismo no implica la pérdida de sensibilidad
a AA del canal (Kim et al., 2001a).
Los lisofosfolípidos (LPLs) también provocan la activación de los canales
TREK, la lisofosfatidilcolina (LPC) y el lyso-fosfatidilinositol (LPI) activan
corrientes de tipo TREK-1 (Danthi et al., 2003;Maingret et al., 2000b), TREK-2
(Lesage et al., 2000b) y TRAAK (Maingret et al., 2000b). La cinética de acción
38
Introducción
de los LPLs es más rápida que el AA, sin embargo al contrario de lo que ocurre
con el AA, en los experimentos realizados en patch escindido los LPLs pierden
efecto, sugiriendo la existencia de un factor citosólico que regula la cinética de
los canales (Maingret et al., 2000b).
Diversos estudios han demostrado el efecto neuroprotector de los PUFAs y
LPLs durante episodios isquémicos y ataques inducidos por kainato (Blondeau
et al., 2002;Lauritzen et al., 2000). El hecho de que los canales TREK sean
activados por PUFAs, LPLs y agentes neuroprotectores los convierten en dianas
importantes para los mecanismos de neuroprotección. Además ratones TREK-1
- -
/ son mucho más sensibles a ataques epilépticos inducidos por kainato, y a
procesos isquémicos sin embargo ratones TRAAK -/- no presentan diferencia
significativa en estos dos casos respecto al salvaje (Heurteaux et al., 2004).
3.7.2. Riluzol.
Además de los PUFAs el riluzol, un fármaco neuroprotector con propiedades
anticonvulsivas y antiisquémicas utilizado en el tratamiento de la esclerosis
lateral amiotrófica (ALS) (Bellingham, 2011), provoca la activación de los tres
miembros de esta subfamilia (Duprat et al., 2000;Lesage et al., 2000b). Esta
característica ha sido utilizada en este trabajo para caracterizar las corrientes a
través de los canales de la subfamilia TREK.
3.7.3. Patologías nerviosas.
Los canales TREK-1 y TREK-2 son inhibidos por inhibidores de recaptación
de serotonina como fluoxetina , norfluoxetina, mientras que TRAAK es
insensible a los antidepresivos (Heurteaux et al., 2004;Kang et al.,
2008;Kennard et al., 2005). El mecanismo de acción de la fluoxetina, ha sido
estudiado recientemente observándose que causa la disociación del extremo Cterminal de la membrana (Sandoz et al., 2011). Los estudios realizados en
ratones TREK-1-/- muestran la aparición de un fenotipo resistente a la depresión
39
Introducción
asociado a un nivel elevado de transmisión serotoninérgica (Heurteaux et al.,
2006).
Además de los antidepresivos los antipsicóticos como: flufenazina,
pimozida, loxapina y haloperidol también inhiben TREK-1 y TREK-2 y no
presentan efecto sobre TRAAK (Thümmler et al., 2007).
3.7.4. Sistema cardiovascular.
La activación de canales de K+ en músculo liso vascular (MLV) es uno de
los mecanismos para el control del tono vascular (Faraci and Heistad,
1998;Nelson and Quayle, 1995). La presencia de los canales TREK en diversas
arterias (Bryan, Jr. et al., 2006;Gardener et al., 2004) sugirió una posible
función fisiológica de estos canales en la regulación del tono vascular.
El ácido linoleico un activador de canales TREK provoca un incremento en
el diámetro de arterias basilares de rata y ratón (Blondeau et al., 2007). El
efecto vasodilatador de los PUFAs desaparece en arterias de ratones TREK-1-/(Blondeau et al., 2007).
3.7.5. Anestesia.
Diversos estudios han señalado a los canales TREK un papel importante en
procesos anestésicos. Los canales TREK excepto TRAAK son activados por
anestésicos volátiles como: cloroformo, halotano e isoflurano (Lesage et al.,
2000b;Patel et al., 1999;Patel et al., 1998), la sensibilidad a los anestésicos
reside en el extremo C-terminal ya que la deleción de los últimos 48 aa del
mismo, hace perder la sensibilidad a cloroformo y halotano (Patel et al., 1999).
La apertura de los canales mediante anestésicos provoca hiperpolarización que
conllevaría a un descenso de la excitabilidad (Patel et al., 1999).
La participación de los canales TREK en procesos de anestesia se corroboró
en el ratón TREK-1-/-, éste presenta una disminución en la sensibilidad a
cloroformo y halotano, además el tiempo necesario para inducción de anestesia
es mayor respecto al salvaje (Heurteaux et al., 2004). Además de los anestésicos
40
Introducción
volátiles TREK-1 también es activado por anestésicos gaseosos como xenón,
óxido nitroso y cicloprono (Gruss et al., 2004a).
4. POTENCIAL DE REPOSO EN NEURONAS SIMPÁTICAS.
El ganglio cervical superior (GCS) es el ganglio más rostral de la cadena
simpática y se encuentra situado en la bifurcación de la arteria carótida. Las
neuronas del ganglio cervical superior proveen inervación simpática a cabeza y
cuello; existiendo cuatro vías funcionales que pasan a través del GCS:
vasoconstrictora, pilomotora, secretomotora y dilatadora de la pupila (Gibbins,
1991).
Las neuronas del GCS se han utilizado de manera clásica como modelo para
el estudio del potencial de reposo neuronal y de la excitabilidad “in vitro”,
debido a varias razones: el GCS es una estructura fácil de aislar, en cultivo las
neuronas poseen una morfología que las hace muy adecuadas para estudios de
electrofisiología, además el diámetro de estas neuronas es relativamente grande
(34 µM) (Jobling and Gibbins, 1999), lo que facilita el empleo de técnicas de
“patch-clamp”.
El potencial de reposo de estas neuronas es ≈-60 mV siendo más positivo
que el EK+ (Lamas et al., 2002;Miranda et al., 2013;Romero et al., 2004). En
estas neuronas simpáticas el potencial de reposo está controlado por diversas
corrientes tanto voltaje–dependientes como voltaje-independientes. Dentro de
las corrientes voltaje-dependientes destaca el papel de la corriente M (IM), la
corriente catiónica (IH) y una corriente de Na+ persistente (INaP). La corriente IM
se activa entre -70 y -60 mV y carece de inactivación, ejerciendo un
componente hiperpolarizante sobre el potencial de reposo. La corriente
catiónica mixta IH se activa alrededor de -30 o -40 mV y que ejerce un efecto
despolarizante sobre el potencial de reposo. Estas dos corrientes tienen efectos
opuestos y colaboran para ejercer un efecto estabilizador sobre el potencial de
reposo neuronal (Lamas, 1998;Lamas et al., 2002;Lamas, 2005).
41
Introducción
La corriente Na+ persistente también contribuye al valor del potencial de
reposo y a la excitabilidad de neuronas de SCG, el bloqueo de la misma con
valproato provoca una hiperpolarización e incrementa el umbral de disparo
(Lamas et al., 2009).
También es importante, la contribución electrogénica que aporta la bomba de
Na/K que actúa como un componente hiperpolarizante del potencial de reposo
(Lamas et al., 2002).
Por último, el bloqueo de las corrientes anteriormente mencionadas pone de
manifiesto la existencia de una corriente de fuga con tres componentes : K+, Na+
y Cl-, siendo el K+ el componente mayoritario (Lamas et al., 2002). El sustrato
molecular de esta corriente de fuga de K+ era hasta la actualidad desconocido, el
descubrimiento de la presencia de los canales de la subfamilia TREK en
neuronas del GCS (desarrollado en este trabajo) los revela como candidatos a
transportar dicha corriente de fuga de K+ (Cadaveira-Mosquera et al., 2011).
42
OBJETIVOS
43
44
Objetivos
OBJETIVOS
El objetivo principal de este trabajo fue la identificación y caracterización
electrofisiológica, farmacológica y molecular de los canales implicados en la
corriente activada por riluzol en neuronas simpáticas de ratón.
Los objetivos concretos fueron:
1.-Determinar el ión responsable de la corriente activada por riluzol.
2.-Identificar
y
caracterizar
electrofisiológica,
molecular
y
farmacológicamente los canales responsables de dicha corriente.
3.-Analizar la expresión de los canales responsables de la corriente activada
por riluzol (TREK).
4.-Investigar el papel fisiológico de dichos canales en las neuronas del GCS.
45
46
MATERIAL Y MÉTODOS
47
48
Material y métodos
MATERIAL Y MÉTODOS
En este trabajo se utilizaron neuronas simpáticas procedentes del ganglio
cervical superior (GCS) de ratones Swiss CD1. El manejo de los animales y
todos los procedimientos utilizados cumplen las directivas españolas y europeas
para la protección de animales utilizados en experimentación (RD53/2013;
2010/63/EU) y han sido aprobados por el Comité Ético de Bienestar Animal de
la Universidad de Vigo.
1. CULTIVO CELULAR.
1.1. Extracción.
Las neuronas fueron obtenidas de ratones de 30 a 60 días de edad, los
animales fueron sacrificados en una cámara de eutanasia con CO2 y
posteriormente decapitados. La cabeza del animal se depositó en una superficie
de sylgard y se sujetó mediante agujas hipodérmicas. Se localizó la tráquea del
animal y se apartó con la ayuda de un mosquito, para permitir la localización de
las arterias carótidas bajo la lupa (ver figura 6).
El ganglio cervical superior se
encuentra junto a la bifurcación de
la arteria carótida y tiene forma
alargada y fusiforme; bajo la lupa
se extrajo el ganglio junto con la
bifurcación y se situó en un pocillo
con medio Leibowitz L-15. Los
pocillos se colocaron bajo la lupa
iluminados con luz fría y sobre una
placa de metal negra, para facilitar Figura 6: Disección del GCS. En la figura se
la identificación del ganglio.
muestra la situación del GCS junto a la
bifurcación de la arteria carótida.
49
Material y métodos
Se separó el ganglio de la arteria y se eliminó la capa de tejido conjuntivo
que lo envuelve, realizando durante el proceso varios lavados con L-15.
Finalmente se realizaron tres cortes a cada ganglio para facilitar su posterior
disgregación.
1.2. Disgregación.
Una vez finalizada la extracción, las siguientes fases se realizaron en una
cámara de flujo laminar para poder desarrollarlas en condiciones de esterilidad.
Se retiró el medio L-15 del pocillo y se realizaron 2 lavados con 2 ml de
HBSS+HEPES. Se añadió una solución enzimática de colagenasa y albúmina
(ver 1.4) y se incubaron los ganglios a 37°C, 5% de CO2 durante 15 minutos en
dicha solución. Posteriormente a esta incubación se retiró la solución de
colagenasa y albúmina, se realizó un lavado con 2 ml de HBSS+HEPES, y se
añadió una solución enzimática con tripsina y albúmina (ver 1.4). Los ganglios
fueron incubados en esta solución a 37º C y 5% CO2 durante 30 minutos.
Finalizada la incubación los fragmentos de ganglio fueron retirados con una
pipeta pasteur y se introdujeron en un tubo con 2 ml de medio de cultivo (ver
1.4), donde se llevó a cabo la disgregación mecánica con una pipeta pasteur de
punta pulida al fuego. La solución con las células disgregadas se dejó reposar
durante unos instantes para evitar tomar fragmentos que no se hubiesen
disgregado completamente, el sobrenadante se pasó a un tubo con 3 ml de L-15,
y se centrifugó a 500 g durante 3 min.
1.3. Proceso de Sembrado.
Para realizar el sembrado se resuspendió el precipitado procedente de dos
ganglios, en 600 µl de medio de cultivo, y se sembraron 200 µl en cada pocillo
Corning (35 mm). Dos horas después de realizar el sembrado se añadieron 2 ml
de medio de cultivo a cada pocillo.
Antes de sembrar las células, los pocillos de cultivo fueron tratados con
laminina, para facilitar la adherencia de las neuronas, para ello se depositó una
50
Material y métodos
gota de 200 µl de laminina disuelta en EBSS (10 µg/ml) en el centro de cada
pocillo, y se incubaron durante 2 horas en un incubador a 37°C, 5% de CO2.
Después de la incubación y antes de la siembra se lavaron los pocillos con 200
µl de L-15 para eliminar el exceso de laminina.
1.4. Soluciones empleadas en el cultivo.
HBSS+HEPES: “Hank’s balanced salt solution” tamponado con N-(2Hydroxyethyl) piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) 10 mM.
Medio de cultivo: Leiwobitz L-15 suplementado con: NaHCO3 24 mM, FCS 10
%, D-glucosa 38 mM, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 UI/ml, estreptomicina
100 µg/ml, NGF 50 ng/ml.
Solución enzimática de albúmina y colagenasa: HBSS + HEPES 10mM con
colagenasa 2,5 mg/ml y albúmina 6 mg/ml.
Solución enzimática de albúmina y tripsina: HBSS + HEPES 10mM con
albúmina 6 mg/ml y tripsina 1 mg/ml.
Todos los reactivos fueron adquiridos a Sigma.
2. REGISTRO ELECTROFISIOLÓGICO. TÉCNICA DE PATCHCLAMP.
2.1. Modalidades de la técnica de patch-clamp.
La técnica de patch-clamp fue desarrollada por el grupo de Neher y
Sackmann (Hamill et al., 1981) para el estudio de las corrientes iónicas a través
de canales iónicos individuales presentes en la membrana celular. La base de
esta técnica es la formación de un sello de alta resistencia del orden de GΩ
(“gigaseal”), que se establece entre una micropipeta de vidrio que contiene un
alambre de plata clorado inmerso en una solución electrolítica (“solución de
pipeta”) y la membrana de la célula a registrar. El sello se forma poniendo en
51
Material y métodos
contacto la punta de la micropipeta con la membrana celular y aplicando una
ligera succión, la formación del sello se puede controlar gracias a un
amplificador conectado al microelectrodo.
Desde sus orígenes la técnica ha sufrido diferentes modificaciones,
actualmente existen 4 modalidades principales de la técnica de patch-clamp (ver
figura 7):
“Cell-attached” (pegado a la célula): Esta modalidad permite el estudio de
las corrientes que pasan a través de los canales situados en la porción de
membrana que se encuentra incluida en el sello (corrientes de canal individual).
Para realizar esta configuración se acerca la punta de la micropipeta a la
superficie de la membrana celular y se realiza una leve succión hasta lograr un
buen sello (GΩ).
“Whole-cell” (célula entera): Esta modalidad permite el estudio de las
corrientes iónicas a través de toda la membrana celular (corrientes
macroscópicas). Para la obtención de esta configuración, tras la formación del
sello se realiza una presión negativa repentina provocando la rotura de la
membrana celular, permitiendo el acceso al interior celular. El principal
inconveniente de esta variante es el fenómeno de “rundown” debido a la diálisis
del citoplasma celular con la solución de pipeta, provocando la pérdida de
componentes intracelulares como por ejemplo: segundos mensajeros, enzimas,
ATP, etc. En este trabajo se utilizó principalmente una variante de esta
modalidad llamada sello perforado (ver 2.3).
“Outside-out” (exterior hacia fuera): Esta modalidad es útil para registrar
canales individuales, pudiéndose aplicar distintos moduladores externos de los
mismos cambiando la solución extracelular. Partiendo de la configuración de
“whole-cell”, se retira cuidadosamente la micropipeta, obteniéndose un pequeño
52
Material y métodos
trozo de la membrana en el que la superficie interna de la membrana celular
queda en contacto con la solución de pipeta, y la superficie externa de la misma
con el líquido de perfusión.
“Inside-out” (interior hacia fuera): Esta modalidad se utiliza también para el
registro de canal individual y para el estudio de la sensibilidad de los canales a
distintos moduladores intracelulares, que se pueden aplicar cambiando la
solución del baño. A
partir
de
la
configuración de “cellattached” se retira la
micropipeta,
obteniéndose
primero
una pequeña esfera de
membrana y después un
pequeño
trozo
de
membrana en el que la
superficie interna de la
membrana celular queda
en
contacto
con
el
líquido de perfusión, y
la superficie externa de
la membrana queda en
contacto con la
solución de la pipeta.
Figura 7: Esquema de las diferentes modalidades
de la técnica de patch-clamp.
53
Material y métodos
2.2. Aspectos técnicos del patch clamp.
2.2.1. Circuito equivalente.
El comportamiento eléctrico de la membrana celular se puede representar
como un circuito eléctrico en donde la membrana celular actúa como un
condensador (Cm) con dos conductores (medio extracelular y citoplasma)
separados mediante un dieléctrico (bicapa lipídica), los canales iónicos
actuarían como resistencias (Rm) permitiendo el paso de corriente (iones), y el
generador en serie sería la fuerza electromotriz de la membrana (Em).
Un experimento de patch se representaría añadiendo al circuito anterior: la
resistencia de la pipeta (Rp), la capacidad de la pipeta (Cp) y la resistencia de la
zona del sello (Rsello). La suma de la Rsello y la Rp constituyen la resistencia de
acceso (Ra) (figura 8).
Figura 8: Modelo eléctrico de un experimento de patch-clamp en
modalidad whole cell.
54
Material y métodos
2.2.2. Resistencia de serie (RS).
En un experimento de patch-clamp en su modalidad de fijación de voltaje
(voltage-clamp) el potencial de membrana se controla y se fija al valor deseado,
aplicando corriente por el electrodo. Para tener el control completo del potencial
de membrana se debe conocer el valor de las resistencias que forman el circuito,
la suma de todo el conjunto de todas las resistencias desconocidas se llama
resistencia de serie (Rs) ya que se encuentra en serie con la resistencia de la
membrana (Rm). El principal componente de la resistencia de serie es la
resistencia de acceso (Ra) que se produce principalmente en la zona del sello.
Cuando la resistencia de serie no es despreciable con respecto a la resistencia de
la membrana, se producen alteraciones significativas en el control del voltaje:
-Es muy probable que no se alcance el valor del voltaje deseado porque el
amplificador no es capaz de distinguir la RS de la Rm, el error producido se
puede estimar utilizando la ley de Ohm:
V error  Rs  I
-Además la velocidad del salto de voltaje también se ve alterada,
ralentizándose en función de la magnitud de la Rs de acuerdo a la siguiente
ecuación:
t 


 
V m V c 1  e s 




Donde  s es una constante de tiempo que depende de la resistencia de serie y de
la capacidad de la membrana:
 s  Rs *Cm
Vc es el voltaje al que se desea fijar la célula.
55
Material y métodos
-La resistencia de serie y la capacidad de la membrana actúan como un filtro
RC monopolar con una frecuencia de corte calculada según la ecuación:
f  1 2 Rs Cm
Así cuanto mayor sea la resistencia de serie menor será el ancho de banda del
filtro.
Algunas de las estrategias que se pueden utilizar para compensar al máximo
la resistencia de serie son:
-Manipular las concentraciones de iones para que las corrientes registradas
sean lo más pequeñas posibles.
-Utilizar electrodos con baja resistencia (más anchos), aunque esto está
limitado por el tamaño de las células y la dificultad de obtener buenos sellos
(cuanto más grande es el electrodo mayor dificultad).
-Utilizar el sistema de compensación de la Rs proporcionado por el propio
amplificador de patch. Esto puede llegar a compensar en un 80% el error, pero
también es peligroso para la célula ya que utiliza un sistema de
retroalimentación positivo que tiende a oscilar.
2.2.3. Potencial de difusión (“Junction potential”).
Al introducir el electrodo de registro en la solución de baño se produce el
cierre del circuito, este hecho genera una corriente continua a través del circuito
llamada “offset”. El “offset” suele tener múltiples componentes principalmente:
la corriente generada al poner en contacto dos soluciones diferentes (pipeta y
baño), la generada en el contacto de la plata con las soluciones de pipeta y baño
y las corrientes generadas por los aparatos eléctricos y otros. Asumiendo que la
corriente offset va a ser constante, ésta puede ser corregida inyectando una
corriente igual pero en sentido opuesto mediante el amplificador. Cuando se
produce el sello la solución de pipeta y la de baño dejan de estar en contacto,
por tanto una parte del offset que habíamos compensado desaparece. La
56
Material y métodos
sobrecompensación provoca que en los experimentos de fijación de voltaje, el
voltaje al que se fija la célula no coincida con el deseado. Los valores del
“junction potential” para las soluciones utilizadas en estos experimentos fueron
de 3 a 6 mV, y se consideró que no era necesario hacer una corrección de los
mismos.
2.2.4. Space clamp.
En un cable lineal, cuando se aplica una corriente en un determinado punto,
el potencial medido a una determinada distancia es menor debido a la disipación
de cargas a lo largo de la distancia. Esto mismo ocurre con las células de
geometría complicada, cuanto mayor es la constante de espacio menor es la
caída de voltaje con la distancia y más efectivo es el control del voltaje. Cuando
la célula tiene una geometría compleja, provoca que las diferentes partes de la
neurona no estén fijadas al mismo voltaje de forma que se generará una
corriente debida a la existencia de las diferencias de potencial. Para evitar este
problema se registran células esféricas y con el menor número de procesos
posibles.
2.3. Sistema utilizado.
La mayor parte de los experimentos electrofisiológicos llevados a cabo en
este trabajo usan una variante de la técnica de célula entera llamada sello
perforado (“perforated-patch”). En lugar de provocar la rotura de la membrana
celular con una succión brusca, se introduce en la solución de pipeta un
antibiótico que provoca la formación de poros que permiten el acceso eléctrico
al interior celular evitando la diálisis y el fenómeno de “rundown”. Los
antibióticos más utilizados son nistatina, anfotericina y gramicidina, en este
trabajo se utilizó la anfotericina para la creación de poros en la zona del sello.
Los poros formados por el antibiótico permiten únicamente el paso de iones
57
Material y métodos
monovalentes e impiden el paso moléculas de tamaño mayor como enzimas y
segundos mensajeros. La principal desventaja de esta variante es que la
resistencia de serie es un poco más elevada que en la configuración de wholecell.
Utilizando la modalidad de sello perforado, se realizaron experimentos de
fijación de corriente (“current-clamp”) y fijación de voltaje (“voltage-clamp”).
La frecuencia de muestreo para los experimentos de fijación de corriente fue de
10 KHz (filtrando a 5 KHz), para los experimentos de fijación de voltaje la
frecuencia de muestreo fue de 2 KHz (filtrando a 1 KHz), en todos los casos la
resistencia de serie fue menor de 20 MΩ.
2.3.1. Fabricación de electrodos.
Las micropipetas utilizadas en los registros se fabricaron a partir de capilares
de vidrio de borosilicato (Harvard Apparattus), en un estirador de pipetas
vertical (puller), (Narishige P-10). Posteriormente las micropipetas fueron
pulidas en una microforja (Narishige MF-830), para suavizar la superficie de la
punta y no dañar la membrana celular. El electrodo de referencia consiste en un
alambre de plata con su superficie clorada (Ag/AgCl). El recubrimiento se hizo
sumergiendo el alambre de plata en una solución de hipoclorito de sodio.
Para los experimentos de sello perforado la punta de la pipeta se rellenó por
capilaridad, sumergiendo la punta de la pipeta en una solución de pipeta sin
anfotericina; a continuación, las micropipetas se rellenaron por su parte
posterior con una solución de pipeta con anfotericina-B (75 µg/ml). La
resistencia eléctrica de las micropipetas después de llenarlas con la solución
correspondiente fue de 4-6 MΩ. La solución stock de anfotericina-B se preparó
fresca disuelta en DMSO a una concentración de 50 mg/ml.
58
Material y métodos
2.3.2. Descripción del sistema de registro electrofisiológico.
El equipo de registro utilizado consta de un amplificador (Axopatch 200B,
Axon Instruments), con una sonda preamplificadora a la que se acopla el
microelectrodo. El amplificador recibe los datos del microelectrodo y los envía
a través de una tarjeta de conversión analógico-digital (Digidata 1440A) al
ordenador. El amplificador permite el registro de corriente y voltaje así como la
generación de los diferentes protocolos programados en el ordenador (FujitsuSiemens) mediante el paquete de software pClamp 10 (Molecular Devices) (ver
figura 9). El registro se llevó a cabo en células cultivadas en pocillos de 35 mm
(Corning) que fueron colocados en una cámara de registro situada sobre un
microscopio de contraste de fases invertido (Nikon Eclipse TE 300). La cámara
de registro posee sujeciones para la perfusión de soluciones de baño y para el
electrodo de referencia. La cámara fue perfundida por gravedad a razón de 10
ml/min con una solución de baño a temperatura ambiente (burbujeada con aire
sintético), el volumen de la solución de baño en el pocillo se mantuvo constante
por medio de una bomba peristáltica (Dinko) que aspira el baño sobrante del
pocillo y lo recircula si es necesario. La aplicación de drogas se realizó
añadiéndolas directamente sobre la solución de baño o cambiando entre cuatro
líneas de perfusión con una llave de paso múltiple. El microscopio se encuentra
situado sobre una mesa antivibratoria (LTD Wentworth Laboratories) que
permite mantener el sello estable durante un tiempo prolongado. Cubriendo la
mesa antivibratoria y el sistema de registro se encuentra una caja de Faraday
que aísla el registro de radiaciones electromagnéticas.
59
Material y métodos
Figura 9: Esquema del sistema de registro utilizado para la realización de la
técnica de patch-clamp.
2.3.3. Soluciones de registro.
Las soluciones utilizadas para los registros electrofisiológicos fueron las
siguientes:
-Solución interna (solución de pipeta):
La solución interna debe ser compatible con el medio intracelular, respetando en
la medida de lo posible su composición iónica. Es importante mantener la
concentración de Ca2+ libre a un valor fisiológico (no tóxico) (100 nM).
-Solución pipeta (mM): KAc 90, MgCl2 3, CaCl2 1, HEPES 40, EGTA 3, KCl
20, pH 7,2 con NaOH 1 M.
60
Material y métodos
-Soluciones externas (solución de baño):
Esta solución imita la composición del medio extracelular.
-Solución externa estándar (mM): NaCl 140, KCl 3, MgCl2 1, CaCl2 2, Dglucosa 10, HEPES 10, pH 7.2 con Trizma Base 1 M.
-Solución externa de alto contenido de K+ (mM): NaCl 120, KCl 20, MgCl2 1,
CaCl2 2, D-glucosa 10, HEPES 10, pH 7.2 con Trizma Base 1 M
-Solución externa para acidificación intracelular (mM): NaHCO3 90, KCl 3,
MgCl2 1, CaCl2 2, D-glucosa 10, HEPES 10, pH 7.2 con HCl 1 N.
-Solución externa hipotónica (145mOsm): NaCl 70, KCl 3, MgCl2 1, CaCl2 2,
D-glucosa 10, HEPES 10, pH 7.2 con Trizma Base 1 M.
2.3.4. Análisis de datos electrofisiológicos.
El análisis de los datos obtenidos fue realizado con el programa Clampfit 10
del paquete de software pClamp 10 (Molecular Devices); para el análisis
estadístico y la representación gráfica de los resultados se utilizó el programa
OriginPro 8 (OriginLab). Los resultados que se exponen en este trabajo son
expresados como la media ± error estándar de la media. Las comparaciones
entre los diferentes grupos se realizaron mediante el test de la t de Student para
grupos pareados o grupos independientes según el tipo de experimento,
considerando como significativos aquellos valores con p < 0.05.
La curva dosis-respuesta se ajustó siguiendo la ecuación de Hill:

y  A  B  A  X h / X h  EC50
h

Donde h es el coeficiente de Hill (pendiente), X es la concentración de la droga
estudiada, EC50 es la dosis eficaz cincuenta, A es la mínima corriente activada y
B es la corriente máxima activada.
61
Material y métodos
2.4. Protocolo experimental.
Los pocillos con los cultivos de neuronas del GCS se situaron en la cámara
de registro y se sustituyó el medio de cultivo por la solución de baño. Las
neuronas fueron visualizadas en un microscopio invertido a través de objetivo
de 40X, se seleccionaron aquellas que presentaban un mejor aspecto para ser
registradas, y se procedió a la formación del sello.
En primer lugar se introdujo la punta del microelectrodo en la solución de
pipeta filtrada y sin antibiótico durante 50 s para evitar la interferencia de la
anfotericina-B en el proceso de formación del sello. A continuación se rellenó el
microelectrodo por su parte posterior con la solución interna con anfotericina-B.
Se conectó la micropipeta a la sonda preamplificadora y se introdujo el
microelectrodo en la solución de baño utilizando un micromanipulador
eléctrico.
El proceso de formación del sello se controló a través del test del sellado del
programa Clampex, se midió la corriente que fluía a través del microelectrodo
generada por un pulso de -1 mV, permitiendo calcular la resistencia del
electrodo utilizando la ley de Ohm. A continuación, se situó la punta del
microelectrodo sobre la superficie celular mediante el micromanipulador y se
ejerció una ligera presión negativa mediante succión para conseguir la
formación de un sello de alta resistencia. Tras alcanzar un sello de alta
resistencia (GΩ) entre la pipeta y la membrana (figura 10) ya no se observó
ninguna corriente en respuesta al pulso de voltaje aplicado debido a la gran
resistencia del sello conseguido.
Posteriormente se aumentó el pulso aplicado a -5 mV y se neutralizó el
transitorio capacitativo de la pipeta. Se esperó el tiempo necesario (15-20
minutos) para que la anfotericina-B provocase la formación de poros en la
membrana, permitiendo así el acceso eléctrico al interior celular. El acceso
eléctrico al interior celular se monitorizó observando el aumento de los
transitorios capacitativos lentos debidos a la capacidad de membrana y la caída
62
Material y métodos
de la resistencia de acceso (disminuye a medida que el antibiótico va formando
poros en la membrana celular). La estabilización de ambos parámetros indicó el
establecimiento de la configuración de célula entera en sello perforado. Todos
los experimentos fueron realizados a temperatura ambiente.
Figura 10: Esquema en el que se representa un sello (GΩ) entre una célula
y una micropipeta.
2.5. Registro de canal individual.
Para los registros de canal individual (“single-channel”) se utilizó la técnica
de “patch-clamp” en la modalidad de “cell-attached”. Las micropipetas
utilizadas en estos experimentos fueron recubiertas con una capa de Sylgard y la
resistencia después del llenado fue de 6 MΩ. La frecuencia de muestreo
utilizada para estos registros fue de 20 KHz, filtrando a 2 KHz. Durante el
registro de canal individual se desactivó el sistema de perfusión ya que así se
reduce el ruido.
63
Material y métodos
La solución utilizada durante estos registros fue la siguiente: Solución de
pipeta y baño (mM): KCl 150, MgCl2 1, EGTA 5, HEPES 10, pH 7.2 con KOH
1M.
La amplitud de los canales individuales se midió utilizando el software
Clampfit10 descartando las aperturas menores de 0.1 ms. El umbral para la
detección de las aperturas se fijó manualmente al 50% de la amplitud máxima
de los canales. Las amplitudes calculadas se representaron frente al voltaje para
el cálculo de la curva I/V. La probabilidad de apertura fue calculada utilizando
el software Clampfit10 y la siguiente ecuación: Po = to/T, donde to es el tiempo
total en el que el canal fue encontrado en estado abierto y T es el tiempo total de
observación.
3. BIOLOGÍA MOLECULAR.
3.1. Extracción de ARN.
En función del tejido elegido para la extracción de ARN se utilizaron dos
métodos: RNeasy kit (Qiagen) y el método de ‘single-step’ de tiocianato de
guanidinio y extracción con fenol-cloroformo.
RNeasy kit Qiagen: Este kit se utilizó para la extracción de ARN de GCS
de ratón. Se sacrificaron 20 ratones y se extrajeron los ganglios siguiendo la
técnica descrita en el apartado 1.1, la extracción del ARN se realizó siguiendo
las indicaciones del fabricante. Los ganglios se depositaron en un eppendorf que
contenía 1 ml de RNAlater, pasadas 24 horas se retiraron los ganglios, se
depositaron en 600 µl de buffer RLT y se realizó la homogenización del tejido
con un homogeneizador (Ultraturrax). El homogenizado fue centrifugado a
16000 g durante 3min, posteriormente el sobrenadante se depositó en un nuevo
eppendorf y se le añadió un volumen de etanol 70%. Se transfirieron 700 µl de
la mezcla anterior a una minicolumna insertada en un tubo recolector de 2 ml, la
64
Material y métodos
columna fue centrifugada a 8000 g durante 15 s. El líquido recolectado fue
desechado, se añadieron 700µl de buffer RW1 a la minicolumna y se centrifugó
a 8000 g durante 15 s. Se desechó el líquido recolectado y se añadieron 500 µl
de buffer RPE, se centrifugó a 8000 g durante 15 s, posteriormente se desechó
el líquido recolectado y se añadieron 500 µl de buffer RPE, centrifugándose a
8000 g durante 2 min. El líquido recolectado en la minicolumna fue desechado
y se colocó la minicolumna en un nuevo tubo recolector, se centrifugó 2 min a
8000 g. Se añadieron 30 µl de RNase-free water a la minicolumna y se colocó
en un nuevo tubo recolector de 1.5 ml, para realizar una centrifugación a 8000 g
durante 1 min. Finalmente el ARN obtenido fue cuantificado según el método
espectrofotométrico descrito en el apartado 3.2.
Extracción de ARN con el método de ‘single-step’ de tiocianato de
guanidinio y extracción con fenol-cloroformo: Para la extracción de ARN de
corteza cerebral se utilizó el método del Trizol (Chomczynski and Sacchi,
1987). Se sacrificó un ratón por cada extracción de tejido, el tejido extraído fue
introducido en un tubo eppendorf añadiendo 1 ml de Trizol (mantiene la
estabilidad del ARN durante la lisis celular) por cada 100 mg de tejido. Las
muestras fueron homogenizadas en un homogeneizador (Ultraturrax).
Posteriormente las muestras homogenizadas se incubaron durante 5 minutos a
30 °C en un termoblock (Stuart Scientific) para permitir la completa disociación
de los complejos nucleoproteicos. Se añadieron 200 µl de cloroformo por cada
ml de Trizol utilizado durante la extracción, seguido de una agitación en vórtex
durante 15 s. A continuación las muestras fueron incubadas a temperatura
ambiente durante 5 min. Posteriormente, se realizó una centrifugación a 12000
g durante 15 min a 4 °C. La fase superior (fase acuosa), que contiene el ARN,
se transfirió a un nuevo tubo y se añadieron 500 µl de isopropanol por cada ml
de trizol utilizado durante la homogenización. Las muestras se guardaron a -20
°C durante 2 horas (precipitación del ARN). Tras la precipitación del ARN se
realizó una centrifugación a 12000 g durante 10 min a 4 °C, se eliminaron los
65
Material y métodos
sobrenadantes y se lavaron los precipitados con 1 ml de etanol al 75% frío. Las
muestras fueron vorteadas y centrifugadas a 7500 g durante 5 minutos a 4 °C.
Posteriormente a la centrifugación se retiró el sobrenadante y se incubó a
temperatura ambiente durante 5 min. El sedimento fue resuspendido en 30 µl de
agua-DEPC, e incubado a 55 °C en termoblock durante 10 min.
3.2. Cuantificación del ARN.
La cuantificación del ARN total se realizó mediante un procedimiento
espectrofotométrico, para lo cual se midió la absorbancia a 260 nm de las
muestras en espectrofotómetro (Beckman). Las muestras fueron diluidas 250
veces en tampón Tris-Cl pH 7.5. La A260 indica la concentración de ARN,
teniendo en cuenta que una unidad de absorbancia a 260 nm equivale a 40
μg/ml de ARN. Para el cálculo de la concentración de ARN de la muestra se
utilizó la siguiente fórmula (Sambrook and Rusell, 2001):
ARN muestra  40g / ml  A260  factor de dilución
Además, se determinó la pureza de ARN, midiendo la absorbancia a 280 nm y
calculando la relación A260/A280, obteniendo unos resultados entre 1.8 y 2.
3.3. Amplificación de ARN mediante RT-PCR.
El método de RT-PCR consta de dos reacciones, en primer lugar se llevó a cabo
una transcripción reversa a partir de ARN catalizada por una transcriptasa
reversa, generándose moléculas de ADN complementario (cDNA), y en
segundo lugar se produjo una amplificación de los cDNAs generados mediante
reacción en cadena de la DNA polimerasa (PCR).
66
Material y métodos
Síntesis de cDNA. Trancripción reversa (RT): La transcripción reversa se
realizó a partir de 2 µg de ARN, para ello se prepararon alícuotas de 10 µl
haciendo las diluciones necesarias del ARN en agua-DEPC. A las alícuotas de
10 µl se le agregaron 20 µl de un mix realizado previamente, obteniendo un
volumen final de 30 µl (ver tabla 3).
Compuesto
Agua-DEPC
Buffer de RT
dNTPs
Random primers
RNase Out
M-MLV
Concentración
inicial
5X
2.5mM
3µg/µl
40U/µl
200U/µl
µl
6.56
6
6
0.19
0.25
1
Tabla 3: Contenido del mix utilizado en la transcripción reversa.
La reacción se llevó a cabo en un termociclador (Mastercycler gradient),
utilizando una temperatura de 37 ºC durante 60 min, 42 ºC durante 15 min y 95
ºC durante 5 min.
Amplifiación de cDNA (Reacción de PCR): Para las mezclas de reacción de
PCR se utilizaron 10 µl de solución con cDNA obtenido en la transcripción
reversa y 40 µl del mix que se describe en la tabla 4.
67
Material y métodos
Compuesto
Agua-DEPC
Buffer 10X
MgCl2
dNTPs
Cebador F
Cebador R
Taq-pol
Concentración
inicial
µl
32.25
5
1.5
4
1
1
0.25
10 X
50 mM
2.5 mM
10 µM
10 µM
5 U/ µl
Tabla 4: Contenido del mix utilizado en la amplificación de cDNA.
La reacción de amplificación utilizada se muestra en la tabla 5:
Fases
Desnaturalización inicial
Desnaturalización
Anillamiento
Elongación
Elongación final
Ta
(ºC)
Tpo
95
95
T a*
72
72
5 min
45 s
1 min
2 min
15 min
Nº
ciclos
1
35
1
Tabla 5: Reacción de amplificación utilizada en el proceso de amplificación.
* Ta: Temperatura de hibridación específica para cada pareja de cebadores
(ver tabla 6).
Para determinar la temperatura óptima de hibridación de cada pareja de
cebadores se realizó una PCR de gradiente de temperatura y se eligió la
temperatura más adecuada para cada una de ellas. Los controles negativos se
hicieron sustituyendo el cDNA obtenido en la transcripción reversa por aguaDEPC. Se utilizó la β-Actina para la evaluación de un gen de carácter
constitutivo. El tamaño del amplicón y la especificidad de los cebadores fueron
analizados utilizando la aplicación BLASTN.
68
Material y métodos
Secuencia
(5’3’)
CTTTGGCTTTCTACTGGCTG
Referencia
2011;Kang and
GACCGTTCAGATAGATGCTC
GGCTAATGTCACTGCTGAGTTCC
TREK-2
55°C
678
55°C
625
55°C
448
53°C
655
Kim, 2006)
(Kang and Kim,
2006)
ACAAGACAACACATAGTCCAATTCC
Producto
PCR
(pb)
(CadaveiraMosquera et al.,
TREK-1
Ta
(Kang et al.,
2004a)
CACCACTGTAGGCTTTGGCGATTATG
TRAAK
(Kang and Kim,
ACTCTGCGTGTCTGAGGACTCGTCG
2006)
TGCCGCATCCTCTTCCTC
(Cadaveira-
β-Actina
Mosquera et al.,
CGCCTTCACCGTTCCAGT
2011)
Tabla 6: Descripción de los cebadores utilizados en la RT-PCR. En la tabla
se muestra la secuencia nucleotídica, la temperatura de hibridación y el
tamaño del producto amplificado.
3.4. Electroforesis en gel de agarosa.
Los productos obtenidos en la reacción de PCR se visualizaron mediante
electroforesis en geles de agarosa al 1% en TBE 1X en cámaras electroforéticas
(Bio-rad) a un voltaje de 90 V. El bromuro de etidio utilizado para la tinción de
los ácidos nucleicos se incorporó al gel fundido a una concentración de 0.25
µg/ml. A cada una de las muestras obtenidas tras la reacción de PCR se le
añadieron 8.3 µl de tampón de carga (0.25% azul de bromofenol, 0.25% xylene
cianol, 30% glicerol), posteriormente en cada uno de los pocillos del gel se
cargaron 15 µl de la mezcla anterior. Para estimar el tamaño de los fragmentos
de ADN visualizados en el gel, en el primer pocillo se cargaron 8.5 µl de una
mezcla que contenía 2 µl de un marcador de peso molecular conocido (100 bp
69
Material y métodos
DNA Ladder), 1.5 µl de tampón de carga y 5 µl de agua-DEPC. Las bandas se
visualizaron bajo luz ultravioleta (320 nm) en un transiluminador (Pharmacia
LKB), y fueron fotografiadas con una cámara digital (Sony DSC-H2).
3.5. Clonación de productos de PCR.
Los productos de la amplificación obtenidos en la RT-PCR fueron
purificados directamente del gel de agarosa para proceder a su clonación y
posterior secuenciación. Para ello, se utilizó el kit comercial pGEM-T Easy
Vector System (Promega). El vector pGEM-T en su forma lineal posee un
nucleótido de timina (T) en su extremo 3’, esto permite la unión del fragmento
amplificado mediante la acción de la enzima T4 ligasa (Promega) (ver figura
12). La presencia de un nucleótido de timina en los extremos 3’ también
aumenta la eficiencia del proceso de ligamiento ya que impide la
recircularización del plásmido. La región donde se inserta el cDNA se encuentra
dentro de la región que contiene el gen que codifica la subunidad α de la enzima
β-galactosidasa, de modo que cuando se produce la inserción del fragmento de
cDNA se inactiva el gen lac Z impidiendo la síntesis de β-galactosidasa. Los
vectores recombinantes se introducen en una célula hospedadora para permitir
su propagación (proceso de transformación). La inactivación del gen lac Z
permite identificar los clones recombinantes por el color de las colonias al
crecer en un medio LB con ampicilina (antibiótico cuya resistencia está
codificada en el vector), 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido (XGal), e isopropil-β-D-tiogalactósido (IPTG). El X-Gal es degradado
enzimáticamente por la enzima β-galactosidasa, originando un compuesto de
color azul. El IPTG es un inductor del promotor del gen lac Z. Las colonias que
contienen el inserto de ADN son de color blanco ya que no son capaces de
degradar el X-Gal debido a que tienen inactivado el gen de la β-galactosidasa,
mientras que las que no contienen el inserto son de color azul (ya que poseen la
70
Material y métodos
enzima β-galactosidasa funcional). En la figura 11 se muestra un esquema de
todo el proceso de clonación.
Figura 11: Representación esquemática del proceso de clonación.
71
Material y métodos
Figura 12: Mapa del vector pGEM-T. (Extraído del manual del
fabricante).
72
Material y métodos
3.5.1. Purificación del producto de la PCR en geles de agarosa.
Para la purificación de las bandas de cDNA obtenidas tras la amplificación
mediante RT-PCR se utilizó el kit comercial Wizard SV Gel and PCR Clean-Up
System siguiendo las instrucciones del fabricante. Una vez separados los
productos de PCR mediante electroforesis en gel de agarosa, la banda de interés
se cortó con un bisturí estéril y se colocó en un tubo eppendorf. Posteriormente
se añadieron 10 µl de Membrane Binding Solution por cada 10 mg de gel de
agarosa y se incubó a 55°C durante 10 minutos hasta la completa disolución del
gel de agarosa. La solución obtenida se cargó en una minicolumna y se incubó
durante 1 min a temperatura ambiente. La columna fue centrifugada a 16.000 g
durante 1 min, se eliminó el líquido recolectado, y se agregaron 700 µl de Wash
solution. Se centrifugó nuevamente la minicolumna a 16000 xg durante 1 min,
descartando la solución de lavado recogida en el tubo. Posteriormente se realizó
una nueva centrifugación a 16000 g durante 1 min para permitir la evaporación
de cualquier residuo de etanol. La minicolumna se colocó en un tubo eppendorf
de 1.5 ml y se añadieron 50 µl de Nuclease-Free Water incubándose durante 1
min a temperatura ambiente. Para la obtención del cDNA purificado del gel se
centrifugó la columna a 16.000 g durante 1 min.
3.5.2. Ligamiento de los productos de PCR.
La Taq polimerasa utilizada en las reacciones de PCR añade una adenina (A)
a los extremos 3’ del amplicón, el vector utilizado posee una timina (T) en sus
extremos 3’, esto permite la unión del fragmento de ADN mediante la enzima
T4 ligasa. Para optimizar la reacción de ligamiento se utilizó una relación molar
3:1 (inserto:vector), para el cálculo se utilizó la siguiente fórmula:
 ng vector  kb inserto 
  relación molar inserto : vector
kb vector


ng inserto  
73
Material y métodos
La reacción de ligamiento del inserto se realizó en tubos de 0.5 ml de baja
capacidad de unión al ADN, se realizó una incubación 1 h a temperatura
ambiente y posteriormente 24 h a 4ºC. El contenido del mix utilizado en la
reacción de ligamiento se muestra en la tabla 7:
Compuesto
2X Rapid
Ligation Buffer
T4 DNA ligasa
pGEM-T easy
(50 ng)
T4 DNA ligasa
Producto PCR
ADN control
Agua HPLC
Inserto(µl)
Control
Control
negativo(µl) positivo(µl)
5
5
5
1
1
1
1
3
1
1
2
2
1
Tabla 7: Contenido del mix utilizado en la reacción de ligamiento.
3.5.3. Transformación de células competentes.
Una vez que ha tenido lugar el ligamiento, el vector recombinante se
introduce en una célula hospedadora, para permitir su propagación. Para ello se
colocaron en el fondo de tubos Falcon 2 µl de la reacción de ligamiento y 50 µl
de células competentes (células competentes de alta eficiencia JM109). Los
tubos se incubaron 20 min en hielo y posteriormente fueron sometidos a un
choque térmico a 42°C durante 50 s e incubación hielo durante 2 min. Tras este
proceso se añadieron 950 µl de medio de cultivo SOC y se incubaron durante
una hora y media a 37°C en un agitador orbital.
Una vez que se produjo la multiplicación de las células competentes en
medio SOC, se sembraron 100 µl de los cultivos en placas con medio
LB/ampicilina/IPTG/X-Gal y se incubaron durante toda la noche a 37°C. Se
eligieron los clones positivos (colonias blancas) y se sembraron en placas
74
Material y métodos
microtitter, con 100 µl de medio líquido LB/ ampicilina en cada pocillo. Las
placas se incubaron a 37ºC durante 12 h.
3.5.4. Amplificación por PCR de las colonias recombinantes.
Para comprobar la inserción del fragmento de ADN de interés en los clones,
se realizó una reacción de PCR con los cultivos realizados a partir de las
colonias blancas (colonias que contenían inserto) utilizando los cebadores del
vector T7 y SP6. Analizando el tamaño de los productos de PCR se
identificaron los clones que contienen el inserto de interés, ya que se conoce el
tamaño del fragmento de interés (ver tabla 8) y el lugar de hibridación de los
cebadores T7 y SP6. En la siguiente tabla se muestran los cebadores utilizados:
Secuencia
5’3’
Nombre
T7
TAATACGACTCACTATAGGGAGA
SP6
ATTTAGGTGACACTATAGAAGNG
Tabla 8: Secuencia nucleotídica de los cebadores T7 y SP6.
El contenido del mix utilizado para la reacción de PCR se describe en la
tabla 9:
Compuesto
Concentración
inicial
µl
Agua HPLC
Buffer 5X
MgCl2
dNTPs
Cebador F
Cebador R
Taq-pol
Cultivo
10 X
25 mM
2.5 mM
10 µM
10 µM
5 U/ µl
17.1
6
1.8
2.4
1
1
0.5
0.5
Tabla 9: Contenido del mix utilizado en la reacción de amplificación de las
colonias recombinantes.
75
Material y métodos
La reacción de amplificación se muestra a continuación:
Fases
Desnaturalización inicial
Desnaturalización
Anillamiento
Elongación
Elongación final
Tª
Tpo
Nº
ciclos
95°C
95°C
50°C
72°C
72°C
5 min
1 min
1 min
1 min
7 min
25
Tabla 10: Reacción de amplificación utilizada en el proceso de amplificación
de las colonias recombinantes.
Los productos se analizaron mediante electroforesis (ver 3.4) en un gel de
agarosa al 2% (3 µl de tampón de carga + 5µl de producto de PCR). Tras
comprobar que los productos de la PCR tenían el tamaño adecuado, se procedió
a la purificación del ADN plasmídico.
3.5.5. Purificación del ADN plasmídico.
Una vez realizada la electroforesis se seleccionaron aquellos clones en los
que se había detectado inserto. Se cogieron 5 µl de cada uno de los cultivos y se
inocularon en 5 ml de medio SOC, posteriormente se realizó una incubación a
37ºC con agitación durante 12 h. Para la purificación del ADN plasmídico se
utilizó el kit comercial Wizard Plus Minipreps DNA Purification System. Se
tomó 1 ml de medio SOC que contenía los clones transformados y se centrifugó
a 10000 g durante 5 min. Se eliminó el sobrenandante y se resuspendió el pellet
en 250 µl de Cell Resuspension Solution. Posteriormente se añadieron 250 µl de
Cell Lysis Solution y se mezclaron suavemente por inversión. Se añadieron 10
µl de Alkaline Protease Solution seguido de una incubación de 5 min.
Finalizada la incubación, se añadieron 350 µl de Neutralization Solution y se
mezcló todo nuevamente por inversión. El lisado fue centrifugado a 14000 g
durante 10 min. Se transfirió el lisado a una columna de purificación insertada
76
Material y métodos
en un tubo recolector. Se centrifugó la columna a velocidad máxima durante 1
min, desechándose el líquido recolectado. Posteriormente, la columna de
purificación se lavó añadiendo 750 µl de Column Wash Solution seguido de una
centrifugación a máxima velocidad durante 1 min. Se añadieron 250 µl de
Column Wash Solution a la columna y se centrifugó a máxima velocidad
durante 2 min. La columna de purificación se insertó en un nuevo tubo
recolector y se eluyó el ADN añadiendo 100 μl Nuclease-Free Water, mediante
centrifugación a máxima velocidad durante 1 min.
3.5.6. Secuenciación.
La secuenciación de los productos de PCR obtenidos con las parejas de
cebadores específicos para TREK-1, TREK-2 y TRAAK, purificados de los
geles de agarosa se realizó en un secuenciador ABI 3130.
3.6. RT-PCR de neuronas individuales de GCS en cultivo.
El ARN total fue extraído de neuronas individuales en cultivo utilizando
micropipetas de registro de patch-clamp. El interior de los capilares de vidrio
fue barnizado con Repel-Silane, y posteriormente fueron secados al aire durante
24 horas. Tras el secado fueron bañados en etanol absoluto y en agua-DEPC,
este tratamiento evita la adhesión de ARN a las paredes de los capilares de
vidrio. El proceso de estiramiento y pulido de las micropipetas fue similar al
descrito en el apartado 2.3.1. La solución interna (similar a la utilizada en 2.3.3)
sin antibiótico fue suplementada con RNAse out (Invitrogen) (10 U/ml). Para la
extracción del citoplasma se realizó un sello (GΩ) y se rompió la membrana
celular mediante una succión brusca, posteriormente se realizó la aspiración
aplicando presión negativa mediante una jeringa. El contenido de las
micropipetas fue depositado en tubos de PCR que contenían 20 µl de agua77
Material y métodos
DEPC, quebrando la punta de la micropipeta contra el fondo del tubo, donde
posteriormente se añadieron los demás componentes de la PCR. Para la reacción
de RT-PCR se utilizó el kit Onestep RT-PCR de Qiagen. El contenido del mix
de reacción de PCR se muestra en la tabla 11:
Compuesto
Concentración
inicial
RNase-free water
5x QIAGEN OneStep RTPCR Buffer
dNTPs
QIAGEN OneStep RTPCR Enzyme Mix
Cebador F
Cebador R
µl
8
10
5X
10mM
2
2
100 µM
100 µM
3
3
Tabla 11: Contenido del mix utilizado en la RT-PCR de neuronas
individuales de GCS en cultivo.
La reacción de amplificación se muestra en la tabla 12:
Fases
Transcripción reversa
Activación PCR
Desnaturalización
Anillamiento
Elongación
Elongación final
Tª
Tpo
50°C
95°C
94°C
54°C
72°C
72°C
30 min
15 min
45 s
1 min
2 min
10 min
Nº
ciclos
1
1
35
1
Tabla 12: Reacción de amplificación utilizada en la RT-PCR de neuronas
individuales de GCS en cultivo.
En la tabla 13 se muestran los cebadores utilizados para la RT-PCR:
78
Material y métodos
Secuencia
(5’3’)
TREK-1
TREK-2
TRAAK
F: TCACTCTGACGACCATTGGA
Referencia
F: GGCTAATGTCACTGCTGAGTTCC
et
al.,
54°C
100
55°C
625
55°C
448
2011)
(Kang and Kim,
2006)
R: ACAAGACAACACATAGTCCAATTCC
Producto
PCR
(pb)
(CadaveiraMosquera
R: ACGAGGATCCAGAACCACAC
Ta
(ºC)
(Kang et al., 2004a)
F: CACCACTGTAGGCTTTGGCGATTATG
(Kang and Kim,
R:ACTCTGCGTGTCTGAGGACTCGTCG
2006)
Tabla 13: Descripción de los cebadores utilizados en la single cell RT-PCR.
En la tabla se muestra la secuencia nucleotídica, la temperatura de
hibridación y el tamaño del producto amplificado.
Los productos obtenidos en la reacción de PCR fueron visualizados
mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%.
3.7. Reactivos utilizados.
RNAlater (Qiagen), RNeasy kit (Qiagen), cloroformo (Sigma), trizol
(Invitrogen), isopropanol (Sigma), etanol (Sigma), depc (Sigma), buffer 5x
(Invitrogen), dNTPs (Invitrogen), random primers (Invitrogen), RNaseOUT
(Invitrogen), M-MLV (Invitrogen), buffer 10x (Invitrogen), MgCl2 (Invitrogen),
Taq pol (Invitrogen), Cebadores (Stabvida), agarosa (Pronadisa), bromuro de
etidio (Sigma), 100 bp DNA ladder (Invitrogen), azul de bromofenol (Sigma),
xylene cianol (Sigma), glicerol (Sigma), Wizard SV Gel and PCR Clean-Up
System (Promega), pGEM-T easy vector system (Promega), células
competentes de alta eficiencia jm109 (Promega), Wizard Plus SV Minipreps
DNA Purification System (Promega), bactotriptona (Panreac), extracto de
bacto-levadura (Panreac), NaCl (Sigma), KCl (Sigma), Mg2+ (Sigma), glucosa
79
Material y métodos
(Panreac), extracto de bacto-levadura (Panreac), ampicilina (USB), IPTG
(Promega), X-Gal (Promega), Repel-Silane (PlusOne Pharmacia Biotech),
Los medios de cultivo utilizados se prepararon siguiendo las instrucciones
del kit pGEM-T Easy Vector System (Promega):
-Medio de cultivo SOC (100 ml): 2 g bactotriptona, 0.5 g extracto de bactolevadura, 1 ml NaCl 1 M, 0.25 ml KCl 1 M, 1 ml Mg2+ 2 M, 1 ml glucosa 2 M.
-Medio LB (1 L): 10 g bactotriptona, 5 g de extracto de bacto-levadura, 5 g
NaCl.
-Placas con medio LB/ampicilina/IPTG/X-Gal: 15 g agar para 1 l de medio LB,
ampicilina 100 µg/ml, IPTG 0.5 mM, X-Gal 80 µg/ml.
3.8. PCR cuantitativa (qPCR).
La PCR cuantitativa (qPCR), es una técnica que permite la detección y
cuantificación de ARNm. La base de esta técnica reside en la monitorización de
la reacción de PCR utilizando técnicas de fluorescencia que permiten medir
durante la amplificación la cantidad de ADN sintetizado en cada momento, ya
que la emisión de fluorescencia producida por la reacción es proporcional a la
cantidad de ADN formado. Para la qPCR se utilizan termocicladores
convencionales acoplados a un espectrofluorímetro que determina la
fluorescencia que se produce a lo largo de toda la reacción. El software
representa en una gráfica la señal obtenida frente al número de ciclos, y nos da
un parámetro fundamental llamado ciclo umbral o “thresold cycle” (Ct), el ciclo
a partir del cual la fluorescencia es estadísticamente significativa por encima del
ruido de fondo. Este parámetro es inversamente proporcional a la cantidad
inicial de ADN, de forma que en aquellas muestras con mayor expresión del gen
de interés la fluorescencia aparecerá en ciclos anteriores y por tanto su Ct será
más bajo. Los fluoróforos utilizados pueden ser de dos tipos: agentes
intercalantes y sondas específicas marcadas con fluorocromos.
80
Material y métodos
Los agentes intercalantes son fluoróforos que no son específicos, se unen a
todo ADN de doble cadena (incluídos dímeros). El más utilizado es el SYBR
Green que tiene el pico de excitación a 497 nm y el pico de emisión a 520 nm.
Las sondas específicas más utilizadas son las sondas TaqMan. Estas sondas
están formadas por una secuencia de nucleótidos a los que se une un fluoróforo
en el extremo 5’ de la sonda y un inhibidor de fluorescencia (“quencher”) al
extremo 3’. En presencia del quencher el fluoróforo no puede emitir señal. Tras
la unión de los cebadores específicos y de la sonda al ADN, la Taq polimerasa
comienza la amplificación. Durante la amplificación el extremo 5’ de la sonda
es degradado por la actividad 5’ 3’ exonucleasa de la enzima, este proceso
libera el fluoróforo y el quencher y una vez separados el fluoróforo emite
fluorescencia (ver figura 13).
Figura
13:
Sondas
TaqMan. La sonda va
unida a un fluoróforo y a
un quencher que bloquea
la
emisión
de
fluorescencia.
Los
cebadores y la sonda
hibridan en una secuencia
específica, durante la
amplificación la actividad
5’-3’ exonucleasa de la
Taq-polimerasa provoca
la degradación de la
sonda y la liberación del
fluoróforo. El fluoróforo
una vez liberado del
quencher, emite la señal
de fluorescencia.
81
Material y métodos
3.8.1. Análisis de la calidad e integridad del ARN.
El ARN total fue aislado del GCS de ratón utilizando RNeasy kit (Qiagen)
(ver 3.1). Todas las muestras fueron tratadas con DNase I (Amplification Grade,
Invitrogen) a una concentración de 1 U DNase I/µg RNA, siguiendo el
protocolo del proveedor.
La integridad y calidad del ARN fue analizada utilizando el bioanalizador
(Bioanalyzer 2100, Agilent Technologies), RNA 6000 Nano chips, en
combinación con Eucaryotic Total RNA Nano Assay. El software calcula la
concentración del RNA, y dos parámetros numéricos que indican la integridad
del RNA: la relación entre los RNA ribosómicos 28S y 18S (28S/18S), y el
numero RIN (RNA Integrity Number). El algoritmo del RIN permite la
clasificación de las muestras de RNA eucariótico total en base a un sistema
numérico de 1 a 10, siendo 1 el valor para una muestra de RNA totalmente
degradada y 10 el valor obtenido para una muestra intacta. Los valores de RIN
obtenidos en las muestras fueron > 7.
3.8.2. Síntesis de cDNA.
La transcripción reversa se realizó a partir de 1 µg de RNA total, tratado con
DNasa, utilizando kit High Capacity cDNA Reverse Transcription kit (Applied
Biosystems), siguiendo las instrucciones del proveedor. El volumen final de la
reacción de cDNA fue de 20 µl.
3.8.3 Reacción de qPCR.
Se analizó la expresión de 3 genes de la familia Kcnk (TREK-1, TREK-2 y
TRAAK) y de un control endógeno GAPDH. Para el análisis del control
endógeno se utilizó Gene Expression Assays individual (Applied Byosistems) y
para el análisis de los genes Kcnk se utilizaron Custom TaqMan Array 96-Well
82
Material y métodos
Fast Plates (Applied Biosystems): TREK-1 (Mm01323942_m1), TREK-2
(Mm00504118_m1),
TRAAK
(Mm00434626_m1),
GAPDH
(Mm99999915_g1). Las reacciones se llevaron a cabo en el sistema 7900HT
Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems). El volumen de reacción
total fue de 10 µl para los genes Kcnk y 20 µl para el control endógeno. Las
concentraciones finales fueron de 900 nM para los cebadores, y de 250 nM para
la sonda TaqMan. En cada una de las reacciones se utilizaron 25 ng de cDNA y
para la realización de la curva estándar se emplearon diluciones seriadas de
cDNA: 50 ng, 16.67 ng, 5.56 ng y 1.85 ng. Los experimentos se realizaron a
partir de tres muestras independientes y de cada muestra se hicieron tres
réplicas. El protocolo utilizado para la reacción de PCR se muestra en la tabla
14:
Fase 1
Fase 2
Fase 3
Fase 4
Tª
Tpo
Nº ciclos
50°C
95°C
95°C
60°C
40°C
2 min
10 min
15 s
1 min
1
1
40
Tabla 14: Reacción de amplificación utilizada en la qPCR.
3.8.4. Análisis de resultados.
Para el análisis de los datos se utilizó el software SDS 2.4 de Applied
Biosystems.
La cuantificación relativa de los genes Kcnk fue calculada utilizando el
método del ΔΔCt. La expresión de cada gen fue normalizada a un control
endógeno (GAPDH) utilizando esta fórmula ΔCt= Ct
Kcnk
– Ct
GAPDH.
La
expresión relativa se calculó de acuerdo a la siguiente fórmula: 1/(2 -ΔΔCt) donde
ΔΔCt = ΔCt calibrador - ΔCt Kcnk, usando como calibrador el gen Kcnk con mayor
83
Material y métodos
expresión. La eficiencia de cada uno de los genes Kcnk y GAPDH fue analizada
para verificar que eran equiparables. Para ello se determinó la expresión de
todos los genes a lo largo una batería de diluciones seriadas, los Ct obtenidos se
representaron frente al log de las cantidades de cDNA. El cálculo de la
eficiencia de amplificación se calculó según la fórmula:
Eficiencia ( E)  10 1 / pendiente  1
En cada curva estándar se calculó el ΔCt para cada gen kcnk y control
endógeno, y se representó el ΔCt con respecto al log de la cantidad de cDNA.
En todos los casos la pendiente resultó < 0.1.
3.8.5. Análisis estadístico.
Para el análisis estadístico se utilizó el software SPSS Statistics 17.0. Para
determinar si las diferencias entre la expresión relativa de los genes eran
significativas realizó un análisis estadístico mediante un test ANOVA de un
factor. Posteriormente se utilizó un test post-hoc, para determinar diferencias en
la expresión entre los distintos grupos de genes. Se utilizó el test de Levene para
el análisis de la homogenidad de varianzas y posteriormente el test post-hoc
Games-Howell. Se consideraron significativos aquellos con p<0.05.
3.8.6. Reactivos utilizados para qPCR.
RNeasy kit (Qiagen), Eucaryotic Total RNA Nano Assay, DNase I
(Amplification Grade, Invitrogen), High Capacity cDNA Reverse Transcription
kit (Applied Biosystems), Gene Expression Assays individual (Applied
Byosistems), Custom TaqMan Array 96-Well Fast Plates (Applied Biosystems),
84
Material y métodos
3.9. Inmunocitoquímica.
3.9.1. Protocolo de inmunocitoquímica:
Para los experimentos de inmunocitoquímica se utilizaron cultivos de
neuronas de GCS de ratón en cubreobjetos. El método de cultivo utilizado fue
similar al descrito en el apartado 1. Previamente a la realización del cultivo, los
cubreobjetos fueron sometidos a un proceso de limpieza consistente en lavados
alternos de HCl y H2O destilada y a un proceso de esterilización con rayos UV.
Los cubreobjetos se incluyeron dentro de placas de pocillos múltiples para
cultivos (Nunc) y fueron tratados con laminina de manera similar al
procedimiento descrito en apartado 1.3. Transcurridas 24 horas de la siembra y
tras permanecer en incubador a 37°C, 5% de CO2 se realizaron tres lavados con
2 ml de PBS a 37°C. Para realizar el proceso de fijación de las células, se
trataron los cubreobjetos con paraformaldehído al 2% durante 1 hora a
temperatura ambiente. Posteriormente a la etapa de fijación se realizaron 2
lavados de 2 minutos con PBS en agitación. La permeabilización de las células
se realizó con Triton X-100 al 0.2% durante 10 minutos en agitación, tras la
permeabilización se realizaron dos lavados con PBS. Para el bloqueo de las
uniones inespecíficas se incubaron los cubreobjetos con suero normal de burro
al 10% durante 30 minutos a temperatura ambiente. El anticuerpo primario fue
utilizado a una dilución 1:100 en PBS y suero normal de burro (10% del
volumen final), la incubación se realizó durante 12 horas a 4°C. Los anticuerpos
primarios utilizados fueron los siguientes:
Anticuerpo policlonal de cabra anti-TREK-1 (sc-11556)
Anticuerpo policlonal de cabra anti-TREK-2 (sc-11560)
Anticuerpo policlonal de cabra anti-TRAAK (sc-11326)
Los controles negativos fueron incubados con suero normal de burro al 10% en
lugar de anticuerpo primario.
85
Material y métodos
Transcurrida la incubación con el anticuerpo primario se realizaron tres
lavados en PBS y posteriormente una incubación durante 1 hora con el
anticuerpo secundario contra IgG de cabra, procedente de burro y conjugado
con el fluoróforo FITC a una dilución 1:200 en PBS. Una vez finalizada la
incubación con el anticuerpo secundario se realizaron 3 lavados con PBS.
Finalmente la tinción del ADN se realizó mediante la incubación con DAPI
1:10000 durante 2 minutos, posteriormente se realizaron 3 lavados con PBS en
agitación. Como medio de montaje en portaobjetos se utilizó Prolong Gold
antifade. Las células se analizaron mediante microscopía confocal con un
microscopio (Leica), provisto de un objetivo de inmersión en aceite 40X. El
FITC fue monitorizado mediante excitación a la longitud de onda de 494 nm, el
DAPI fue monitorizado mediante excitación a la longitud de onda de 461 nm.
3.9.2. Reactivos utilizados.
PBS (Sigma), Triton X-100 (Sigma), Suero normal de burro (Santa Cruz
Biotechnology), Anticuerpos primarios (Santa Cruz Biotechnology), Anticuerpo
secundario (Santa Cruz Biotechnology), DAPI (Santa Cruz Biotechnology),
Prolong Gold antifade reagent (Invitrogen).
86
RESULTADOS
.
87
88
Resultados
RESULTADOS
Trabajos previos realizados en el laboratorio durante el estudio de la
corriente de Na+ persistente (INap), revelaron que tras la adición de riluzol en
registros de “current-clamp” (fijación de corriente) se producía una
hiperpolarización y en registros de “voltage-clamp” (fijación de voltaje) una
corriente de salida; en ambos casos el efecto del riluzol era transitorio, lo que
nos llevó a investigar la naturaleza de esta corriente. La revisión bibliográfica
sobre el efecto del riluzol en diferentes canales iónicos, expresados de forma
heteróloga, mostró la activación transitoria mediante riluzol de canales fuga de
la subfamilia TREK (Duprat et al., 2000;Fink et al., 1998). La presencia de una
corriente de fuga en neuronas del GCS ya había sido descrita previamente por
nuestro grupo de investigación (Lamas et al., 2002), esta corriente presenta
cuatro componentes: K+, Na+, Cl- y una pequeña contribución de la bomba de
Na+/K+, siendo el K+ el componente mayoritario. Sin embargo la naturaleza
molecular de dicha corriente de fuga era desconocida.
1.
PROPIEDADES
ELECTROFISIOLÓGICAS
DE
LA
CORRIENTE ACTIVADA POR RILUZOL.
En experimentos de voltage-clamp a -30 mV en solución estándar, la
aplicación de riluzol 100 µM provocó la activación transitoria de una corriente
de salida de 89.58 ± 4.76 pA (n=6); (figura 14 A). A -50mV el efecto del riluzol
fue menor, generando una corriente de 25.26 ± 8.12 pA (n=4); (figura 14A).
Como era esperable de los resultados obtenidos en voltaje-clamp, en
experimentos de current-clamp a -30 mV y solución estándar, la aplicación de
riluzol 100 µM provocó una hiperpolarización de -11.23 ± 2.20 mV (n=11);
(figura 14B). Cuando la neurona se encontraba a potencial de reposo, la
hiperpolarización provocada por el riluzol fue de -5.17 ± 1.34 mV (n=3); (figura
14B), y en dos de ellas la aplicación del riluzol en reposo no tuvo ningún efecto.
89
Resultados
1.1. El riluzol activa una corriente de salida.
La corriente registrada a -30 mV podría ser debida a la apertura de canales
de K+ o al cierre de canales de Na+, ya que el riluzol es capaz de activar canales
K2P pero también de bloquear canales de Na+ persistentes (Lamas et al., 2009).
Para estudiar si el efecto del riluzol se debía a la apertura o al cierre de
canales iónicos, durante la realización de los registros de voltage-clamp se
aplicaron pulsos de -15 mV, con una duración de 50 ms y a una frecuencia de
0.4 Hz. El riluzol provocó un incremento de 1.41 ± 0.13 nS (n=5) (de 2.82 ±
0.16 a 4.23 ± 0.22 nS) en la conductancia durante su aplicación a -30 mV
(figura 14 A), demostrando así que su efecto es debido a la activación y no la
inhibición o al bloqueo de canales iónicos.
Figura 14: Corriente activada por riluzol (IRIL) en experimentos de voltageclamp y current-clamp. A) En experimentos de voltage-clamp a -30 mV, el
riluzol provoca la activación transitoria de una corriente de salida. La
aplicación de pulsos negativos (-15 mV, 50 ms, 0,4 Hz) permite observar
como se incrementa la conductancia durante la aplicación de riluzol. A -50
mV el efecto del riluzol es menor. B) Hiperpolarización causada por la
aplicación de riluzol en experimentos de current-clamp a -30 mV. La
hiperpolarización causada por el riluzol es menor cuando la célula se
encuentra en reposo.
90
Resultados
La activación transitoria de una corriente de salida tras la aplicación de
riluzol es coincidente con lo descrito en la bibliografía sobre el efecto del riluzol
en los canales de potasio de la subfamilia TREK. El riluzol provoca la
activación de todos los miembros de la subfamilia TREK (Duprat et al.,
2000;Lesage et al., 2000b), y además la activación de TREK-1 y TREK-2
mediante el riluzol presenta una fase de activación seguido de una fase de
inhibición. Como esto era coincidente con los resultados iniciales de nuestros
experimentos, el siguiente paso fue comprobar si la corriente de salida activada
por riluzol era una corriente de K+.
1.2. La corriente activada por riluzol (IRIL) es selectiva para K+.
Para comprobar la naturaleza iónica de la corriente activada por riluzol, se
realizaron experimentos de saltos de voltaje en concentraciones fisiológicas de
K+ (3 mM extracelular, EK+ = -91 mV, figura 15 A) y en altas concentraciones
extracelulares de K+ (20 mM, EK+ = -43 mV, figura 15 B). Los potenciales de
equilibrio fueron calculados utilizando la ecuación de Nernst. Para la
realización de estos experimentos se fijó la membrana a valores de voltaje cada
vez más negativos desde -20 a -80 mV en saltos de 10 mV. En cada valor de
voltaje se aplicó riluzol 100 µM obteniéndose respuestas como las mostradas en
la figura 15. Se puede observar cómo cambia el voltaje al que invierte la
corriente en función de la concentración de K+.
Con las corrientes obtenidas en el experimento anterior, se construyeron las
curvas de intensidad–voltaje (I-V) para cada solución de baño (figura 16 A). En
las curvas se puede apreciar cómo cambia el potencial de inversión de la
corriente (el potencial de inversión de una corriente selectiva para un ión
debería coincidir aproximadamente con el potencial de equilibrio de dicho ión)
de acuerdo al EK+ de cada solución, demostrando así que IRIL es selectiva para
K+. En la curva I-V se observa una clara rectificación de salida en los
experimentos realizados en solución con 3 mM de K+ extracelular; esta
91
Resultados
rectificación se reduce considerablemente en los experimentos realizados en 20
mM extracelular de K+.
Figura 15: Inversión de la corriente activada por riluzol en función del
EK+. A) Corriente activada por riluzol 100 µM a diferentes voltajes, en
solución estándar (3 mM de K+ extracelular). B) Corriente activada por
riluzol 100 µM a diferentes voltajes en solución con alta concentración de K+
(20 mM extracelular de K+). Se produce la inversión de la corriente cuando
se alcanza el respectivo EK+.
También se realizaron experimentos utilizando un protocolo de rampas de
voltaje, en este caso se cambió el voltaje de forma progresiva y continuada
desde 0 mV a -100 mV en soluciones 3 mM de K+ extracelular y de 30 mV a 100 mV en concentraciones de K+ simétricas (110 mM de K+, 10 mV/s cada 10
s). Se añadió TTX, Cd2+ y Cs+ a la solución de baño. En la figura 16 B se
observa la corriente activada por riluzol (IRIL) en soluciones con 3 mM de K+
extracelular y con concentraciones de K+ simétricas. IRIL fue obtenida restando
la corriente control de la corriente obtenida en presencia de riluzol. Se puede
92
Resultados
observar cómo desaparece la rectificación de IRIL cuando las concentraciones de
K+ son simétricas y como el potencial de inversión pasa de un valor cercano a 90 mV a un valor cercano a cero. Estos experimentos demuestran la selectividad
de la corriente activada por riluzol (IRIL) para K+.
Figura 16: Curvas I/V para IRIL. A) La gráfica muestra la relación de la
corriente activada por riluzol frente al voltaje, en solución estándar de K+ 3
mM extracelular (círculos) y en altas concentraciones extracelulares de K+
20 mM (cuadrados). La curva I-V fue obtenida con un protocolo de voltageclamp en el que el voltaje se fue modificando desde -20 a -80 mV en
incrementos de -10 mV. B) Curvas I/V para IRIL obtenidas mediante la
realización de rampas de voltaje (10mV/s), en soluciones de baño 3 mM de
K+ extracelular y concentraciones de K+ simétricas (110 mM de K+), en
presencia de TTX, Cd2+ y Cs+.
2. FARMACOLOGÍA DE LA CORRIENTE ACTIVADA POR
RILUZOL (IRIL).
Aunque los experimentos iniciales sugerían que la corriente activada por
riluzol era transportada por canales de K+ de la subfamilia TREK, el riluzol es
una sustancia que tiene efectos sobre un gran variedad de canales iónicos entre
93
Resultados
los que se encuentran canales de: Na+, K+ y Ca2+ (Bellingham, 2011). Está
descrita la activación de canales de K+ (SK); (Grunnet et al., 2001), la
inhibición de los canales de K+ tipo KDR (Ahn et al., 2005) y de los canales de
Ca
2+
tipo HVA (Huang et al., 1997) y el bloqueo de las corrientes INaP e INat
(Lamas et al., 2009;Urbani and Belluzzi, 2000). Por todo ello se decidió hacer
una caracterización farmacológica de la corriente activada por riluzol.
Se realizaron registros de voltage-clamp a -30 mV en presencia de diversos
bloqueantes y moduladores, para comprobar el efecto de éstos sobre IRIL. El
protocolo utilizado fue el siguiente: registro de la corriente control durante 1
minuto, adición del bloqueante a la solución estándar de baño durante 4 min, y
posteriormente una aplicación de riluzol 100 µM durante 5 min en presencia de
dicho bloqueante. En el grupo control (sin ningún bloqueante) la corriente
activada por riluzol en solución estándar fue de 89.58 ± 4.76 pA (n=6), este
valor fue utilizado para comparar con las demás.
2.1. Bloqueantes clásicos de canales de Na+, Ca2+ y catiónicos.
Se acepta en general que los canales K2P no son afectados por los
bloqueantes clásicos de canales.
La tetrodotoxina (TTX) es una neurotoxina bloqueante de los canales de
sodio voltaje dependientes (Nav) y de la corriente INaP (Lamas et al., 2009). El
ácido valproico (valproato) en función de su concentración puede inhibir la
corriente INaT (EC50 150 µM) e INaP (EC50 3,8 µM) (Lamas et al., 2009). La
corriente activada por riluzol en presencia de TTX 0.5 µM y de valproato
100µM fue de 97.84 ± 18.11 pA (n=7, p=0.69) y de 76.64 ± 14.53 pA (n=4,
p=0.35); no se obtuvo diferencia significativa al comparar estas corrientes
respecto a la corriente control (figura 17 A y 17 B).
En presencia del bloqueante de canales de Ca2+, Cd2+ 100 µM IRIL fue de
94.79 ± 8.68 pA (n=9, p=0.66); no resultando significativamente diferente
respecto al grupo control (figura 17 C).
94
Resultados
En neuronas del GCS está presente una corriente catiónica activada por la
hiperpolarización llamada corriente H, esta corriente se puede inhibir con la
adición de Cs+ (Lamas, 1998). IRIL en presencia de Cs+ 1 mM fue de 78.88 ±
15.67 pA (n=4, p=0.46), una diferencia estadísticamente insignificante respecto
a la corriente control (figura 17 D).
Con los resultados de estos experimentos la participación de canales de Ca2+,
Na+ y catiónicos en IRIL puede ser descartada, demostrando una vez más que IRIL
es conducida a través de iones K+.
Figura
17:
bloqueantes
canales
de
catiónicos
Efecto
de
clásicos
+
Na ,
Ca
sobre
de
2+
y
IRIL.
Experimentos de voltage-clamp
a
-30
mV
en
soluciones
estándar. Corriente activada
por riluzol (IRIL) en presencia
de TTX (A), valproato (B), Cd2+
(C) y Cs+(D).
95
Resultados
2.2. Bloqueantes clásicos de canales de K+.
A continuación, se estudió la sensibilidad de IRIL a diferentes bloqueantes de
canales de K+. Generalmente los canales K2P son insensibles a los bloqueante
clásicos de canales de K+ como el TEA y 4-AP; sin embargo, el efecto del Ba2+
es contradictorio, a altas concentraciones (mM) inhibe TREK-1 (Fink et al.,
1996), TREK-2 (Bang et al., 2000) y TRAAK (Fink et al., 1998) aunque
también está descrito la falta de efecto sobre TREK-1 y TREK-2 (Lesage et al.,
2000b;Meadows et al., 2000;Patel et al., 1998).
La corriente activada por riluzol 100 µM en presencia de tetraetilamonio
(TEA 15 mM), bloqueante de canales rectificadores, y de 4-aminopiridina (4AP 2 mM), bloqueante de canales de K+ tipo A, fue de 78,85 ± 11.33 pA (n=8,
p=0.45) y 79.00 ± 13.24 pA (n=4, p=0.41); valores que no son
significativamente diferentes del valor control (figura 18 A y 18 B).
Sin embargo, la adición de Ba2+ provocó una reducción significativa de IRIL.
En presencia de Ba2+ 5 mM la corriente activada por riluzol fue de 36.97 ± 6.28
pA (n=4, p=0.0001; figura 18 C).
La apamina bloqueante de canales de potasio sensibles a Ca2+ de baja
conductancia (SK) y la paxilina bloqueante de canales de potasio sensibles a
Ca2+ de alta conductancia (BK), se aplicaron conjuntamente y no tuvieron efecto
sobre IRIL. La corriente activada por riluzol 100 µM en presencia de apamina
200 nM y paxilina 1 µM fue de 106.54 ± 15.74 pA (n=6, p=0.33; figura 18 D).
En resumen los experimentos anteriores descartan la contribución de los
canales de K+: Kir, KA, KDR, BK y SK a IRIL. La inhibición por Ba2+ y la
insensibilidad al resto de bloqueantes sugiere que IRIL debe ser transportada a
través de canales K2P de la subfamilia TREK.
96
Resultados
Figura 18: Efecto de bloqueantes clásicos de canales de K+ sobre IRIL.
Experimentos de voltage-clamp a -30 mV en soluciones estándar, IRIL en
presencia de bloqueantes clásicos de canales de K+: TEA (A), 4-AP (B), Ba2+
(C) y apamina + paxilina (D).
2.3. Curva dosis- respuesta para riluzol.
Una vez comprobado el efecto de los bloqueantes clásicos de manera
individual sobre la corriente activada por riluzol (IRIL), y viendo que excepto el
Ba2+, los demás no afectaban a dicha corriente, se realizó una curva dosisrespuesta para el riluzol en presencia de un cóctel de bloqueantes. Para la
97
Resultados
elaboración de la misma, se realizaron experimentos de voltage-clamp fijando el
potencial de membrana a -30 mV aplicando riluzol durante 1 minuto en
presencia de: TTX 0.5 µM, Cd2+ 100 µM, Cs+ 1mM, TEA 15 mM, 4-AP 2 mM.
Se aplicaron diferentes concentraciones de riluzol (1 µM, 3 µM, 10 µM, 30 µM,
100 µM, 300 µM, 500 µM, 1000 µM; figura 19) y se midió la amplitud de la
corriente generada, midiendo la diferencia entre la corriente activada por riluzol
y la corriente control.
La dosis eficaz 50 (EC50) que se obtuvo con ajuste a la ecuación de Hill fue
de 139.40 ± 35.26 µM, la mínima corriente activada (A) fue de 7.46 ± 0.77 pA,
la corriente activada máxima (B) fue de 231.43 ± 22.65 pA y el valor del
coeficiente de Hill (h) fue de 1.25 ± 0.14.
Figura 19: Curva dosis-respuesta para el riluzol. Cada punto representa los
valores medios junto con su correspondiente error estándar, de la corriente
generada tras la aplicación de riluzol; el número de células se indica entre
paréntesis. La EC50 obtenida fue de 139.4 ± 35.3 µM. Todos los registros se
realizaron en presencia de un cóctel de bloqueantes (TTX 0.5 µM, Cd2+ 100
µM, Cs+ 1 mM, TEA 15 mM, 4-AP 2 mM).
98
Resultados
2.4. Moduladores de canales K2P.
Una vez demostrado farmacológicamente que la corriente de riluzol fluye a
través de canales K2P, el siguiente paso fue el análisis de diferentes
moduladores de dichos canales sobre IRIL. Para ello se realizaron experimentos
de voltage-clamp a -30 mV aplicando riluzol 100 µM en solución estándar con
un cóctel de bloqueantes (TTX 0.5 µM, Cd2+ 100 µM, Cs+ 1 mM, TEA 15 mM,
4-AP 2 mM) con el fin de evitar la interferencia de otras corrientes. Fruto de los
experimentos previos sabíamos que ninguno de los bloqueantes anteriores
afectan a la corriente activada por riluzol. En el grupo control la corriente
activada por riluzol 100 µM en solución estándar con bloqueantes fue de 84.42
± 14.24 pA, (n=5); muy similar a la que se había obtenido anteriormente sin la
utilización de ningún bloqueante (ver apartado 1).
2.4.1. Zn2+.
Existen evidencias de que el Zn2+ provoca la activación de TREK-1 y TREK2 en ratón (Czirjak and Enyedi, 2006;Kim et al., 2005) y la inhibición de
TRAAK (Czirjak and Enyedi, 2006). La aplicación de Zn2+ 100 µM incrementó
de manera significativa IRIL, la corriente activada por riluzol en presencia de
Zn2+ fue de 127.49 ± 10.93 pA, (n= 6, p=0.01; figura 20 A). Además el Zn2+
provoca por sí mismo (en ausencia de riluzol) una corriente de salida de 46.30 ±
12.33 pA (n =5).
2.4.2. Fluoxetina.
El antidepresivo fluoxetina provoca la inhibición de los canales TREK-1 y
TREK-2 (Kang et al., 2008;Thümmler et al., 2007), mientras que los canales
TRAAK no se ven afectados (Kennard et al., 2005;Thümmler et al., 2007). La
corriente activada por riluzol en presencia de fluoxetina 100 µM y bloqueantes
99
Resultados
fue de 30.59 ± 5.22 pA, (n= 9, p=0.001); la aplicación de fluoxetina 100 µM
provocó una inhibición significativa de la corriente activada por riluzol respecto
al grupo control (figura 20 B). Además la aplicación de fluoxetina provocó una
clara corriente de entrada 85.7 ± 11.4 pA (n=9), probablemente mediante el
bloqueo de los canales rectificadores tardíos (Hahn et al., 1999;Yeung et al.,
1999).
2.4.3. Quinina.
El efecto de la quinina sobre los canales de la subfamilia TREK es
contradictorio; por una parte está descrita la insensibilidad de TREK-1 (Fink et
al., 1996) y TRAAK (Ozaita and Vega-Saenz de Miera, 2002), sin embargo,
otros autores refieren el bloqueo de TREK-1 (Meadows et al., 2000) y TREK-2
(Kucheryavykh et al., 2009).
La corriente activada por riluzol en presencia de quinina 300 µM fue de
60.03 ± 13.19 pA, (n= 8, p=0.25); no inhibiendo de manera significativa la
corriente activada por riluzol 100 µM en presencia de bloqueantes con respecto
al grupo control (figura 20 C).
La aplicación de quinina indujo una corriente de entrada de 77.51 ± 10.65
pA (n= 8), debido probablemente al bloqueo de la corriente M residual que no
había sido bloqueada con el cóctel de bloqueantes.
En resumen (ver figura 21) la facilitación por Zn2+, inhibición por fluoxetina
y la falta de efecto de la quinina, sugieren que la corriente activada por riluzol
en neuronas de GCS es transportada por TREK-1 y TREK-2. En la figura 21 se
muestra un gráfico de barras en los que se representa la amplitud de IRIL en
presencia de los diferentes bloqueantes clásicos de canales iónicos (rojo) y
moduladores de canales K2P (verde).
100
Resultados
Figura 20: Efecto de diferentes
moduladores de canales K2P sobre
IRIL. Experimentos de voltage-clamp a
-30 mV, IRIL en presencia de
moduladores de canales K2P: Zn2+
(A), fluoxetina (B) y quinina (C). Los
registros fueron realizados en
presencia de un cóctel de bloqueantes
(TTX 0.5 µM, Cd2+ 100 µM, Cs+ 1
mM, TEA 15 mM, 4-AP 2 mM.
Figura 21: Resumen de IRIL en presencia de diferentes bloqueantes de
canales iónicos y moduladores de canales K2P. Las barras representan la
media y el error estándar.
101
Resultados
3. MODULACIÓN POR PH INTRACELULAR.
Como se mencionó en el apartado 3 de la introducción, una característica de
la subfamilia TREK es la sensibilidad al pH intracelular. La acidificación
intracelular provoca la activación de TREK-1 (Maingret et al., 1999b) y TREK2 (Lesage et al., 2000b) mientras que TRAAK es insensible a la misma (Fink et
al., 1998). Para provocar la acidificación intracelular se utilizó una solución
extracelular con NaHCO3- 90 mM, la combinación del HCO3- con H+ conlleva
la formación de ácido carbónico, el cual es convertido mediante la anhidrasa
carbónica en H2O y CO2, el CO2 difunde al interior celular y se combina con
H2O para formar ácido carbónico que provoca la acidificación citoplasmática
(Ritter et al., 1990). Los experimentos de voltage-clamp a -30 mV se realizaron
en presencia de un cóctel de bloqueantes (TTX 0.5 µM, Cd2+ 100 µM, Cs+ 1
mM, TEA 15 mM), dado que las soluciones presentan una importante diferencia
en la concentración de Cl-, se utilizó un electrodo de referencia de Ag/AgCl
conectado a un puente de agar con KCl 2 M para evitar cambios significativos
en el “junction potential”. La acidificación intracelular provocó la activación de
una corriente de salida de 213.78 ± 22.56 pA (n=6; figura 22), además esta
corriente se inhibió completamente tras la aplicación de fluoxetina 100 µM.
La activación de una corriente de salida tras la acidificación intracelular, a la
que solo son sensibles TREK-1 y TREK-2, y la inhibición de ésta tras la
aplicación de fluoxetina bloqueante de TREK-1 y TREK-2 concuerdan con los
datos obtenidos en los experimentos anteriores y sugiere la presencia de TREK1 y TREK-2 pero no de TRAAK en las neuronas de GCS de ratón.
102
Resultados
Figura 22: Activación de una corriente de salida tras la acidificación
intracelular. En registros de voltaje-clamp a -30 mV la acidificación
intracelular mediante NaHCO3- provoca la activación de una corriente de
salida, la adición de fluoxetina provoca la inhibición de esta corriente.
4. ACTIVACIÓN MECÁNICA.
La mecanosensibilidad es otra de las características destacable de todos los
miembros de la subfamilia TREK. El cambio de la osmolaridad de la solución
extracelular de 290 a 145 mOsm provoca la entrada de agua en la célula con la
consecuente deformación de la membrana por hinchazón de la célula. Como se
muestra en la figura 23 A, la aplicación de la solución hipotónica en presencia
de: TTX 0.5 µM, Cd2+ 100 µM, Cs+ 1 mM, TEA 15 mM provoca la activación
lenta de una corriente de salida de 122.73 pA ± 22.24 (n=4); esta corriente
también fue inhibida con la aplicación de fluoxetina 100µM.
103
Resultados
5. ACTIVACIÓN POR ÁCIDOS GRASOS INSATURADOS.
Todos los miembros de la subfamilia TREK son activados por ácidos grasos
insaturados (apartado 3 de la introducción). En registros de voltage-clamp a -30
mV, en presencia de TTX 0.5 µM, Cd2+ 100 µM, Cs+ 1 mM y TEA 15 mM, la
aplicación de ácido linoleico 10µM provocó la activación lenta de una corriente
de 171.48 ± 14.31 pA (n=4). La figura 23B muestra la inhibición de esta
corriente por fluoxetina.
Figura 23: Activación de corrientes mediante estímulos mecánicos y ácido
graso insaturado. A) La aplicación de una solución de baño de 145 mOsm,
provoca la activación de una corriente que es inhibida por fluoxetina. B) La
aplicación de ácido linoleico provoca la activación de una corriente que se
inhibe con fluoxetina. Ambos experimentos se realizaron en presencia de:
TTX 0.5 µM, Cd2+ 100 µM, Cs+ 1 mM y TEA 15 mM.
104
Resultados
6. EXPRESIÓN DE CANALES TREK EN GCS.
Los datos obtenidos de la combinación de técnicas electrofisiológicas y
farmacológicas indican que la corriente activada por riluzol es transportada por
canales de la subfamilia TREK. Estos datos también sugieren que uno de los
tres miembros de esta subfamilia (TRAAK) no participa de forma importante en
dicha corriente. Para corroborar esta idea se determinó la presencia
y se
cuantificó el mRNA para cada uno de los canales de la subfamilia TREK.
6.1. Obtención de muestras de ARN total para RT-PCR.
Se obtuvieron y analizaron muestras de ARN total de corteza cerebral y GCS
de ratón. Las ratios obtenidas (Abs 260/Abs 280) fueron de 1.89 para el GCS y
de 1.87 para corteza cerebral.
La calidad de las muestras de ARN total se comprobó mediante la
amplificación del gen constitutivo β-actina por RT-PCR. Como se muestra en la
figura 24, se obtuvo una banda de 655 pb que se corresponde con el tamaño de
amplicón esperado para esa pareja de cebadores (ver tabla 6).
Figura 24: Amplificación del gen constitutivo de la βactina. RT-PCR a partir de ARN total obtenido de GCS y
corteza cerebral de ratón. La banda muestra el tamaño
esperado de 655 pb.
105
Resultados
6.2. Expresión de canales K2P en ganglio cervical superior.
Los experimentos electrofisiológicos realizados sugerían la presencia de
canales TREK-1 y TREK-2, el siguiente paso fue el estudio de la expresión los
canales de la subfamilia TREK en GCS entero de ratón mediante RT-PCR. Se
utilizó como tejido control positivo corteza cerebral ya que en este tejido estaba
descrita la presencia de los tres canales de la subfamilia TREK (Talley et al.,
2001). Como muestra la figura 25 se detectó la presencia de ARNm de TREK-1,
TREK-2 y TRAAK en GCS entero y en corteza cerebral, las bandas observadas
en todas las muestras se corresponden con el tamaño esperado del fragmento
amplificado.
100 pb
Figura 25: Productos de amplificación mediante RT-PCR. Electroforesis en
gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio de los productos
obtenidos mediante RT-PCR de ARN total de GCS y corteza cerebral de
ratón. Las bandas tienen el tamaño esperado 678 pb para TREK-1 (calles 2,
3, 4, 5), 625 pb para TREK-2 (calles 7, 8, 9, 10), 448 pb para TRAAK (calles
12, 13, 14, 15) y 655 pb para la β-Actina (calles 17, 18). En la primera calle
se muestra el marcador de peso molecular conocido (100 bp DNA ladder),
los controles negativos se muestran en las calles 6, 11, 16 y 19.
106
Resultados
6.3. Clonación y secuenciación de cDNAs.
Los productos obtenidos en la PCR fueron clonados y posteriormente
secuenciados. Las secuencias clonadas fueron analizadas con el programa
BLAST, y resultaron idénticas a las publicadas en el NCBI para TREK-1
(NM_010607.1), TREK-2 (NM_029911.3) y TRAAK (NM_008431.2). En las
figuras 26, 27 y 28 se muestran los alineamientos de las secuencias clonadas
con las publicadas en el NCBI mediante el programa ClustalW.
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C02_C2+T7FwdpGEM_012.ab1
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C02_C2+T7FwdpGEM_012.ab1
AATATTCTGCATCATCTATGCCTTGCTGGGAATTCCCCTCTTTGGCTTTC
--------------------------------------TCTTTGGCTTTC
************
TACTGGCTGGGGTTGGTGATCAGCTAGGAACTATATTTGGAAAAGGAATT
TACTGGCTGGGGTTGGTGATCAGCTAGGAACTATATTTGGAAAAGGAATT
**************************************************
GCCAAAGTGGAAGACACATTTATTAAGTGGAATGTTAGTCAGACGAAGAT
GCCAAAGTGGAAGACACATTTATTAAGTGGAATGTTAGTCAGACGAAGAT
**************************************************
TCGTATCATCTCCACCATCATCTTCATCCTGTTTGGCTGTGTCCTCTTTG
TCGTATCATCTCCACCATCATCTTCATCCTGTTTGGCTGTGTCCTCTTTG
**************************************************
TGGCTCTCCCTGCGGTCATATTCAAGCACATAGAAGGCTGGAGCGCCCTG
TGGCTCTCCCTGCGGTCATATTCAAGCACATAGAAGGCTGGAGCGCCCTG
**************************************************
GACGCTATCTATTTTGTGGTTATCACTCTGACGACCATTGGATTTGGAGA
GACGCTATCTATTTTGTGGTTATCACTCTGACGACCATTGGATTTGGAGA
**************************************************
CTACGTGGCAGGTGGATCAGACATTGAATATCTGGACTTCTACAAGCCTG
CTACGTGGCAGGTGGATCAGACATTGAATATCTGGACTTCTACAAGCCTG
**************************************************
TGGTGTGGTTCTGGATCCTCGTTGGGCTGGCCTACTTTGCAGCTGTTCTG
TGGTGTGGTTCTGGATCCTCGTTGGGCTGGCCTACTTTGCAGCTGTTCTG
**************************************************
AGCATGATTGGGGACTGGCTACGGGTGATCTCTAAGAAGACGAAGGAAGA
AGCATGATTGGGGACTGGCTACGGGTGATCTCTAAGAAGACGAAGGAAGA
**************************************************
GGTGGGAGAGTTCAGAGCGCATGCCGCTGAGTGGACAGCCAATGTCACGG
GGTGGGAGAGTTCAGAGCGCATGCCGCTGAGTGGACAGCCAATGTCACGG
**************************************************
CCGAGTTCAAGGAAACGAGGAGGCGGCTGAGCGTGGAGATCTACGACAAG
CCGAGTTCAAGGAAACGAGGAGGCGGCTGAGCGTGGAGATCTACGACAAG
**************************************************
TTCCAGCGTGCCACATCCGTGAAGCGGAAGCTCTCCGCAGAGCTGGCGGG
TTCCAGCGTGCCACATCCGTGAAGCGGAAGCTCTCCGCAGAGCTGGCGGG
**************************************************
CAACCACAACCAGGAACTGACTCCGTGTAGGAGGACCCTGTCTGTGAACC
CAACCACAACCAGGAACTGACTCCGTGTAGGAGGACCCTGTCTGTGAACC
**************************************************
ACCTGACCAGCGAGAGGGAAGTCCTGCCTCCCTTGCTGAAGGCTGAGAGC
ACCTGACCAGCGAGAGGGAAGTCCTGCCTCCCTTGCTGAAGGCTGAGAGC
**************************************************
ATCTATCTGAACGGTCTGACACCACACTGTGCTGGTGAGGACATAGCTGT
ATCTATCTGAACGGTC---------------------------------****************
1000
12
1050
62
1100
112
1150
162
1200
212
1250
262
1300
312
1350
362
1400
412
1450
462
1500
512
1550
562
1600
612
1650
662
1700
678
Figura 26: Alineamiento de la secuencia obtenida tras la secuenciación del
fragmento de cDNA obtenido mediante RT-PCR para TREK-1, con la
secuencia publicada en el NCBI (NM_010607.1).
107
Resultados
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A2+T7FwdpGEM
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A2+T7FwdpGEM
TTGGTGAGATCAAAGCCCACGCAGCTGAGTGGAAGGCTAATGTCACTGCT
----------------------------------GGCTAATGTCACTGCT
****************
GAGTTCCGGGAGACGAGAAGGCGGCTCAGCGTTGAGATCCATGACAAGCT
GAGTTCCGGGAGACGAGAAGGCGGCTCAGCGTTGAGATCCATGACAAGCT
**************************************************
GCAACGGGCAGCCACTATCCGAAGTATGGAGCGCCGGAGGCTGGGCTTGG
GCAACGGGCAGCCACTATCCGAAGTATGGAGCGCCGGAGGCTGGGCTTGG
**************************************************
ACCAGAGGGCCCACTCACTGGACATGCTATCCCCTGAGAAGCGTTCTGTC
ACCAGAGGGCCCACTCACTGGACATGCTATCCCCTGAGAAGCGTTCTGTC
**************************************************
TTTGCAGCCCTGGACACAGGCCGTTTCAAGGCCTCATCGCAGGAGAGTAT
TTTGCAGCCCTGGACACAGGCCGTTTCAAGGCCTCATCGCAGGAGAGTAT
**************************************************
CAACAACAGACCCAACAACCTACGCCTTAAGGGGCCAGAACAGCTTACCA
CAACAACAGACCCAACAACCTACGCCTTAAGGGGCCAGAACAGCTTACCA
**************************************************
AACATGGGCAGGGCGCTTCTGAGGACAACATCATCAACAAGTTTGGGTCC
AACATGGGCAGGGCGCTTCTGAGGACAACATCATCAACAAGTTTGGGTCC
**************************************************
ACCTCCAAACTCACAAAGAGGAAAAACAAAGATCTCAAAAAGACCTTACC
ACCTCCAAACTCACAAAGAGGAAAAACAAAGATCTCAAAAAGACCTTACC
**************************************************
CGAGGATGTTCAGAAAATCTACAAAACCTTCCGGAATTACTCTCTGGATG
CGAGGATGTTCAGAAAATCTACAAAACCTTCCGGAATTACTCTCTGGATG
**************************************************
AAGAGAAGAAAGAGGACGAGACAGAAAAGATGTGTAACTCCGACAACTCC
AAGAGAAGAAAGAGGACGAGACAGAAAAGATGTGTAACTCCGACAACTCC
**************************************************
AGCACAGCCATGCTGACAGAGTGTATACAGCAGCAAGCTGAGATGGAGAA
AGCACAGCCATGCTGACAGAGTGTATACAGCAGCAAGCTGAGATGGAGAA
**************************************************
CGGAATGGTACCCACGGACACCAAAGACCAGGGGCTGGAGAACAATTCTT
CGGAATGGTACCCACGGACACCAAAGACCAGGGGCTGGAGAACAATTCTT
**************************************************
TACTTGAAGACAGAAACTAAATGTTAAAGACATTGGAATTGGACTATGTG
TACTTGAAGACAGAAACTAAATGTTAAAGACATTGGAATTGGACTATGTG
**************************************************
TTGTCTTGTTTTTGTTGTTTTGTTTTTGTCTTGTTTTTGTTTTAATATTC
TTGTCTTGT----------------------------------------*********
Figura 27: Alineamiento de la secuencia obtenida tras la secuenciación del
fragmento de cDNA obtenido mediante RT-PCR para TREK-2, con la
secuencia publicada en el NCBI (NM_029911.3).
108
1150
16
1200
66
1250
116
1300
166
1350
216
1400
266
1450
316
1500
366
1550
416
1600
466
1650
516
1700
566
1750
616
1800
625
Resultados
gi|141803210|ref|NM_008431.2|
A8
gi|141803210|ref|NM_008431.2|
A8
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A8
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A8
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A8
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A8
gi|141803210|ref|NM_008431.2|
A8
gi|141803210|ref|NM_008431.2|
A8
gi|141803210|ref|NM_008431.2|
A8
gi|141803210|ref|NM_008431.2|
A8
AGCCATCTACTTTGTTATAGTGACTCTCACCACTGTAGGCTTTGGCGATT
---------------------------TACCACTGTAGGCTTTGGCGATT
**********************
ATGTACCCGGCGATGGCACCGGGCAGAACTCTCCAGCCTACCAGCCGCTG
ATGTACCCGGCGATGGCACCGGGCAGAACTCTCCAGCCTACCAGCCGCTG
**************************************************
GTGTGGTTCTGGATCTTGTTTGGCCTAGCCTACTTCGCCTCAGTGCTCAC
GTGTGGTTCTGGATCTTGTTTGGCCTAGCCTACTTCGCCTCAGTGCTCAC
**************************************************
CACCATCGGCAACTGGTTGCGAGCAGTGTCCCGCCGAACTCGGGCAGAGA
CACCATCGGCAACTGGTTGCGAGCAGTGTCCCGCCGAACTCGGGCAGAGA
**************************************************
TGGGTGGCCTAACGGCACAGGCTGCTAGCTGGACCGGCACAGTGACAGCG
TGGGTGGCCTAACGGCACAGGCTGCTAGCTGGACCGGCACAGTGACAGCG
**************************************************
CGAGTGACCCAGCGAACTGGGCCCAGCGCCCCGCCGCCAGAGAAGGAGCA
CGAGTGACCCAGCGAACTGGGCCCAGCGCCCCGCCGCCAGAGAAGGAGCA
**************************************************
ACCACTCCTGCCCTCCTCTTTGCCGGCACCGCCTGCTGTTGTTGAGCCAG
ACCACTCCTGCCCTCCTCTTTGCCGGCACCGCCTGCTGTTGTTGAGCCAG
**************************************************
CCGGCAGGCCCGGCTCCCCTGCACCCGCAGAGAAGGTTGAGACTCCGTCC
CCGGCAGGCCCGGCTCCCCTGCACCCGCAGAGAAGGTTGAGACTCCGTCC
**************************************************
CCGCCCACGGCCTCAGCTCTGGATTACCCCAGTGAGAATCTGGCCTTCAT
CCGCCCACGGCCTCAGCTCTGGATTACCCCAGTGAGAATCTGGCCTTCAT
**************************************************
CGACGAGTCCTCAGACACGCAGAGTGAGCGTGGCTGTGCCCTGCCTCGGG
CGACGAGTCCTCAGACACGCAGAGT------------------------*************************
Figura 28: Alineamiento de la secuencia obtenida tras la secuenciación del
fragmento de cDNA obtenido mediante RT-PCR para TRAAK, con la
secuencia publicada en el NCBI (NM_008431.2).
109
900
23
950
73
1000
123
1050
173
1100
223
1150
273
1200
323
1250
373
1300
423
1350
448
Resultados
6.4. RT-PCR de célula individual.
Una vez detectada la expresión de TREK-1, TREK-2 y TRAAK en GCS
entero y dado que en GCS existen varios tipos celulares, principalmente
neuronas y células satélite (de Almeida-Leite and Arantes, 2010;Hanani, 2005),
se estudió la expresión de los estos canales en neuronas individuales de GCS.
Para ello, se realizaron experimentos de RT-PCR con ARN extraído de
neuronas individuales de GCS en cultivo. Como se muestra en la figura 29 se
detectó expresión de los tres canales de la subfamilia TREK en neuronas
individuales, además en la figura también se observa que la banda obtenida para
TRAAK es más tenue que las obtenidas para TREK-1 y TREK-2.
Figura 29: Productos de amplificación mediante RT-PCR de célula
individual. Electroforesis en gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de
etidio de los productos obtenidos mediante RT-PCR de célula individual de
ARN total de neuronas de GCS de ratón en cultivo. Las bandas tienen el
tamaño esperado 100 pb para TREK-1, 625 pb para TREK-2, 448 pb para
TRAAK. En la primera calle se muestra el marcador de peso molecular (100
bp DNA ladder), se muestran los controles negativos para cada una de las
reacciones.
110
Resultados
6.5. PCR cuantitativa (qPCR).
En los experimentos anteriores se detectó ARNm para los tres canales de la
subfamilia, el siguiente paso fue el análisis de la expresión de los genes de la
subfamilia TREK utilizando la técnica de qPCR con el objetivo de cuantificar la
expresión de cada uno de los genes en GCS.
6.5.1. Comparación de eficiencias.
Para analizar la eficiencia de cada una de las reacciones, se realizaron curvas
estándar para TREK-1, TREK-2, TRAAK y GAPDH. Las eficiencias para todos
los genes resultaron entre 95-100% ver tabla 15. Tras la obtención de las
eficiencias de cada una de las reacciones y para determinar si éstas eran
comparables, en cada muestra estándar se calculó el ΔCt para cada gen y
GAPDH, y se representó respecto al logaritmo de la cantidad de cDNA total. En
todos los casos las pendientes resultaron < 0.1 (figura 30).
Nombre
R2
Eficiencia (%)
TREK-1
TREK-2
TRAAK
GAPDH
0.999
0.997
0.992
0.997
100
101
98
95
Tabla 15: La tabla muestra la eficiencia de la reacción de qPCR para cada
gen así como el coeficiente de determinación (R2).
111
Resultados
Figura 30: ΔCt. vs log [cDNA]. En la figura se muestra las pendientes
resultantes de representar el logaritmo de la cantidad de cDNA vs ΔCt, para
TREK-1, TREK-2 y TRAAK. En todos los casos las pendientes fueron < 0.1.
6.5.2. Cuantificación expresión subfamilia TREK.
La expresión relativa de cada gen fue calculada utilizando el método del
ΔΔCt, utilizando la siguiente fórmula: expresión relativa = 1/(2-ΔΔ Ct), como
calibrador se utilizó TRESK ya que es el canal que más se expresa en GCS
(Cadaveira-Mosquera et al., 2012). A continuación en la tabla 16 se muestra la
expresión relativa de cada uno de los genes:
Gen
Expresión relativa
E= 1/(2- ΔΔCt).
Kcnk2 (TREK-1)
0.07±0.07
Kcnk10 (TREK-2)
0.67±0.01
Kcnk4 (TRAAK)
0.02±0.00
Tabla 16: Expresión relativa de los genes de la subfamilia TREK.
112
Resultados
Dentro de la subfamilia TREK, TREK-2 es el canal con mayor nivel de
expresión seguido de TREK-1 y TRAAK. En la figura 31 se muestra el gráfico
de barras con la expresión relativa de cada uno de los canales respecto al
calibrador. El análisis estadístico mediante ANOVA de un factor mostró
diferencias significativas en la expresión relativa de cada uno de los genes y el
test de Games-Howell señaló diferencia significativa en la expresión relativa de
TREK-2 respecto a TREK-1 (p = 0.001) y TRAAK (p = 0.001) y de TREK-1
respecto a TRAAK (p=0.01).
Figura 31: Perfil de expresión de los canales de la subfamilia TREK en
GCS. En la figura se muestra la expresión relativa de los canales TREK-1,
TREK-2 y TRAAK en GCS.
Los resultados obtenidos respecto a la expresión relativa de cada uno de los
canales
concuerdan
con
los
datos
obtenidos
en
los
experimentos
electrofisiológicos que sugerían que los principales transportadores de la
corriente activada por riluzol eran TREK-1 y TREK-2. Además apuntan a
TREK-2 como el principal componente de dicha corriente.
113
Resultados
6.6. Expresión de proteínas K2P en GCS.
La presencia de ARNm de canales K2P en GCS completo y en neuronas
individuales del GCS de ratón no implica necesariamente la traducción del
ARNm en proteína por tanto, se realizó un análisis de la expresión de los
canales de la subfamilia TREK en GCS de ratón en cultivo, mediante la
utilización de anticuerpos específicos para cada uno de los canales. En la figura
32 se muestra el resultado de los experimentos de inmunocitoquímica
realizados. Se detectó expresión de TREK-1, TREK-2 y TRAAK en las
membranas de las neuronas, mientras que las células satélites de GCS no
presentaron inmunorreactividad para ninguno de los canales mencionados.
También se observa la tinción del ADN nuclear en neuronas y células satélites
con DAPI.
Figura 32:
Inmunorreactividad de los
canales de la subfamilia
TREK, en neuronas de
GCS de ratón en cultivo.
La figura muestra la
expresión de TREK-1(A),
TREK-2(B) y TRAAK(C) en
cuerpos
neuronales
(flecha) del GCS, las
células satélites (cabeza de
flecha)
no
muestran
inmunorreactividad
a
ninguno de los canales.
La columna de la izquierda
muestra
imágenes
obtenidas
con
fluorescencia confocal, en
la columna de la derecha
se
muestra
la
superposición
de
las
técnicas de Nomarski y
fluorescencia confocal.
En azul se observa ADN
nuclear teñido con DAPI.
114
Resultados
7. REGISTROS DE CANAL INDIVIDUAL.
Para corroborar los datos obtenidos en la qPCR, el siguiente objetivo fue el
registro de canales de la subfamilia TREK en neuronas, para ello se realizaron
registros de canal individual utilizando un protocolo de saltos de voltaje de 100
a -100 mV en incrementos de 20 mV. En 12 de 32 sellos (cell-attached) se
detectó la presencia de un canal con una conductancia de 128.23 ± 6.93 pS a -60
mV y 53.83 ± 2.26 pS a +60 mV y una I/V con rectificación de entrada (figura
33). Los valores de conductancia de este canal son similares a los descritos para
TREK-2 en varias publicaciones anteriores (Han et al., 2003;Kang and Kim,
2006).
Figura 33: Registros de canal individual de TREK-2. A) Registro de
corriente unitaria de TREK-2 a -60, 0 y +60 mV en concentraciones de K+
simétricas (C cerrado, O abierto). B) Curva I/V para TREK-2 en donde se
aprecia rectificación de entrada; la conductancia del canal fue de
128.23±6.93 pS a -60 mV y 53.83 ±2.26 pS a -60 mV.
115
Resultados
En 3 de los 32 sellos se detectó un canal con una conductancia de: 70.09 ± 2.30
a -60 mV, 57.05 ± 4.05 pS a +60 mV y una I/V con una leve rectificación de
entrada (figura 34), las propiedades de este canal coinciden con las descritas
para una canal “TREK-like” en neuronas del núcleo supraóptico (Han et al.,
2003).
Figura 34: Registros de canal individual de “TREK-like”. A) Registro de
corriente unitaria de un canal tipo TREK a -60, 0 y +60 mV. En
concentraciones de K+ simétricas (C cerrado, O abierto). B) Curva I/V para
el canal tipo TREK en donde se aprecia rectificación de entrada mucho
menor que la que posee TREK-2; la conductancia del canal fue de 70.1 ± 2.3
a -60 mV, 57.1 ± 4.1 pS a +60 mV.
En los 32 registros de canal individual no se detectó actividad de canales
TREK-1 ni TRAAK.
116
Resultados
En otra serie de experimentos se probó el efecto del riluzol y la fluoxetina
sobre el canal identificado como TREK-2. Se realizaron registros de canal
individual a -60 mV incluyendo riluzol (300µM) en el electrodo de registro o
una mezcla de riluzol y fluoxetina (100µM). Los electrodos fueron llenados por
su parte posterior dejando la punta libre de drogas, posteriormente se midió la
probabilidad de apertura de los canales a los siguientes tiempos: 5,10,15,20 y 25
minutos, tomando como tiempo 0 el momento en que se estableció el sello. Se
realizaron 31 sellos de los cuales 12 presentaron actividad de canales tipo
TREK-2. En presencia de riluzol se produjo un incremento progresivo de la
probabilidad de apertura de TREK-2 (figura 35 A). Cuando los experimentos se
realizaron en presencia de riluzol y fluoxetina no se produjo incremento en la
probabilidad de apertura (figura 35 B); a partir de los 15 minutos de registro la
diferencia entre las probabilidades de apertura de los dos tratamientos resultó
significativa como se observa en la figura 35 C.
Tiempo
(min)
Probabilidad
de apertura
(riluzol)
Probabilidad de
apertura
(riluzol+fluoxetina)
5
0.02±0.01
0.06±0.05
10
0.11±0.04
0.02±0.01
15
0.28±0.06
0.08±0.04
20
0.61±0.08
0.10±0.06
25
0.63±0.05
0.12±0.09
Tabla 17: Probabilidad de apertura de TREK-2 a diferentes tiempos en
presencia de riluzol 300 µM y en presencia de riluzol 300 µM + fluoxetina
100 µM.
117
Resultados
Figura 35: El riluzol provoca incremento en la probabilidad de apertura de
TREK-2 y la fluoxetina inhibe la actividad del canal. A) Registro de TREK2 a -60 mV a los 5 y 25 minutos en presencia de riluzol. B) Registro de
TREK-2 a -60 mV a los 5 y 25 minutos en presencia de riluzol y fluoxetina.
C) Representación de la probabilidad de apertura a diferentes tiempos de
TREK-2 en presencia de riluzol y de riluzol + fluoxetina. Cada punto
representa la media ± error estándar (n=6).
Los resultados de los experimentos de canal individual son congruentes con
los obtenidos en la qPCR, indicando que el canal TREK-2 está mucho más
expresado que TREK-1 y TRAAK en el GCS. También corroboran la hipótesis
de que en estas neuronas la corriente activada por riluzol se produce
principalmente a través de los canales TREK-2.
118
Resultados
8. PAPEL FISIOLÓGICO DE LOS CANALES K2P.
Una vez demostrada la expresión de los canales TREK en la membrana de
neuronas principalmente TREK-2, se decidió investigar el papel fisiológico que
podrían tener estos canales en las neuronas de GCS.
8.1 Papel de los canales TREK en el potencial de reposo.
Se analizó el efecto del bloqueo de los canales TREK sobre el potencial de
membrana en reposo, para ello se utilizaron diferentes concentraciones de
fluoxetina (1, 3, 10, 30 y 100 µM). A 100 µm la fluoxetina provocó una
despolarización significativa de la membrana de 12 mV, el potencial de reposo
cambió de -61.1 ± 3.9 a -48.7 ± 5.3 mV (n=3). En las demás concentraciones la
fluoxetina no provocó efectos significativos sobre el potencial de membrana. En
la siguiente tabla se muestra un resumen del efecto de la fluoxetina sobre el
potencial de membrana.
Fluoxetina
Potencial de
Potencial de
(µM)
membrana
membrana tras
(mV)
fluoxetina (mV)
1
-64.68±6.31
3
p
n
-63.81±6.69
0.50
3
-64.68±6.31
-56.97±5.22
0.24
3
10
-63.99±4.13
-59.05±4.34
0.10
6
30
-65.57±5.26
-56.39±2.57
0.06
4
100
-61.11±3.93
-48.73±5.33
0.02
3
Tabla 18: En la tabla se muestra el potencial de membrana inicial y el efecto
de las diferentes concentraciones de fluoxetina sobre el mismo.
119
Resultados
8.2. Efecto de la fluoxetina sobre el patrón de descarga y la
excitabilidad.
Para estudiar el efecto del bloqueo de los canales TREK sobre el potencial
de acción de las neuronas se utilizó un protocolo de current-clamp consistente
en la inyección de pulsos de corriente despolarizantes de 1 s de duración, con
intensidad desde 50 a 350 pA en incrementos de 50 pA. Se añadieron diversas
concentraciones de fluoxetina: 1, 3, 10 y 30 µM, para ver el efecto sobre el
potencial de acción. A concentraciones superiores a 10 µM la fluoxetina
provoca una reducción de la amplitud e incrementa la duración de los
potenciales de acción probablemente debido a la inhibición de canales de sodio
voltaje-dependientes (Hahn et al., 1999). Con concentraciones de fluoxetina de
30 µM la amplitud de los potenciales de acción decae de 84.89 ± 3.84 a 17.23 ±
1.80 ms y la duración medida a la mitad de la amplitud aumenta de 1.22 ± 0.07
a 5.62 ± 1.13 ms. Debido a esto solo se analizaron los resultados a
concentraciones de fluoxetina de 1 y 10 µM.
Como se muestra en la figura 36, la aplicación de fluoxetina no afecta al
número de potenciales de acción de las neuronas y éstas mantienen su
capacidad de adaptación en presencia de fluoxetina.
120
Resultados
Figura 36: Efecto de la fluoxetina sobre el número de potenciales de
acción. A) Potenciales de acción evocados tras la aplicación de un pulso de
150 pA en condiciones control y en presencia de 1 y 10 µM de fluoxetina B)
Número de potenciales de acción en respuesta a diferentes pulsos de
inyección de corriente, cada punto representa la media ± el error estándar
(n=7). La fluoxetina 1y 10 µM no afecta significativamente al número de
potenciales de acción.
121
Resultados
La fluoxetina 10 µM provoca sin embargo, una reducción significativa de la
latencia del primer potencial (150 pA) de 21.65 ± 4.79 ms a 18.80 ± 4.59 ms
(n=7, p=0.04), este efecto no fue significativo con concentraciones de 1 µM
(21.37 ± 4.80 ms; n=7; p=0.44) (figura 37).
Figura 37: Efecto de la fluoxetina en la latencia del primer potencial de
acción. La aplicación de fluoxetina 10µM provoca la reducción de la
latencia del primer potencial de acción evocado por la aplicación de un
pulso de 150pA.
En resumen el bloqueo de los canales TREK mediante fluoxetina provoca
una despolarización del potencial de membrana y una reducción de la latencia
del primer potencial de acción. El bloqueo de los canales TREK no afecta al
número de potenciales de acción de las neuronas del GCS y éstas mantienen su
capacidad de adaptación.
122
DISCUSIÓN
123
124
Discusión
DISCUSIÓN
Las neuronas presentan una diferencia de potencial (potencial de membrana)
a través de sus membranas plasmáticas, su valor puede ser modificado por
estímulos externos permitiendo a la célula responder a cambios en su entorno. A
la diferencia de potencial de membrana cuando las células no están recibiendo
ningún tipo de estímulo, se le conoce como potencial de reposo. Clásicamente
se asumió que la conductancia de la membrana en reposo se debía
principalmente a la existencia de una corriente de fuga de K+ que estaría
siempre activa y no se vería afectada por el voltaje. El descubrimiento en el año
1996 de los canales K2P (Lesage et al., 1996a) supuso la identificación
molecular de canales con propiedades similares a la corriente de fuga clásica.
El GCS ha sido clásicamente un modelo para el estudio del potencial de
reposo, en estas neuronas simpáticas el potencial de reposo está controlado por
varias corrientes voltaje-dependientes (IM, IH , INaP), el componente electrogénico
de la bomba Na+/K+, y las corrientes de fuga de Na+, Cl-, K+. El principal
componente de fuga es de K+, y su sustrato molecular era desconocido hasta la
realización de los primeros experimentos de esta tesis (Cadaveira-Mosquera et
al., 2011). El descubrimiento de la expresión de los canales K2P en el GCS los
convierte en los candidatos ideales para el transporte de esta corriente de fuga.
En este trabajo se ha identificado de manera electrofisiológica,
inmunocitoquímica y molecular la presencia de canales de fuga de K+ de la
subfamilia TREK en neuronas simpáticas, además se muestra la implicación de
estos canales en la generación de una corriente de salida tras la aplicación de
riluzol. La expresión de los canales es bastante ubicua, estando presentes tanto
en el sistema nervioso central como en los órganos periféricos, aunque hasta el
momento de este trabajo no se había detectado la presencia de canales de fuga
en el sistema nervioso autónomo.
125
Discusión
El análisis farmacológico junto con los datos obtenidos tras el análisis de los
registros de canal individual y qPCR revelaron que los principales
transportadores de la corriente activada por riluzol son los canales TREK-2.
La presencia de los canales de la subfamilia TREK en neuronas de GCS
explicaría la existencia de la corriente de fuga en dichas células y añade un
componente más a los canales responsables del mantenimiento del potencial de
reposo en estas células.
1. Propiedades electrofisiológicas de la corriente activada por riluzol
El riluzol es un fármaco anticonvulsionante, sedativo y con propiedades
antiisquémicas, utilizado en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica
(Bellingham, 2011;Bryson et al., 1996;Malgouris et al., 1989) . En neuronas del
GCS la aplicación de riluzol generó la activación de una corriente de salida de
K+ (IRIL) con el consecuente incremento de conductancia. El potencial de
inversión de IRIL coincidió con el potencial de equilibro para el K+ de cada una
de las soluciones utilizadas, demostrando la naturaleza potásica de la corriente
activada por riluzol.
Otra particularidad de IRIL fue la presencia de una rectificación de salida en
experimentos realizados en
concentraciones fisiológicas de K+, esta
rectificación desapareció cuando las concentraciones de K eran simétricas
volviendo la I/V de IRIL prácticamente lineal. Una de las características de los
canales K2P es su comportamiento como “open rectifiers” (Goldstein et al.,
2001) en condiciones fisiológicas (altas concentraciones de K + intracelulares y
bajas concentraciones de K+ extracelulares), conduciendo mejor corrientes de
salida que de entrada.
La activación de todos los canales de la subfamilia TREK por riluzol ha sido
descrita en sistemas heterólogos (Duprat et al., 2000;Lesage et al., 2000b).
Dentro de los canales de esta subfamilia, TREK-1 y TREK-2 son activados de
manera bifásica por el riluzol, presentando una primera fase de activación
126
Discusión
seguida de una fase de inhibición (Duprat et al., 2000). La activación de los
canales TREK mediante riluzol se produce de manera directa sobre el canal,
además el riluzol provoca la elevación de los niveles de AMPc intracelular
(Duprat et al., 2000). Las diferencias en la cinética del riluzol sobre TREK-1 y
TREK-2 respecto a TRAAK se deben a que este último presenta una vía de
regulación mediante segundos mensajeros diferente a TREK-1 y TREK-2.
TREK-1 y TREK-2 al contrario de TRAAK son inhibidos por la vía de la PKA
(Fink et al., 1996;Fink et al., 1998;Lesage et al., 2000b).
Todos estos resultados sugieren que IRIL es una corriente transportada por
canales K2P de la subfamilia TREK.
2. Farmacología de la corriente activada por riluzol
IRIL resultó insensible a los bloqueantes clásicos de canales de K+, Na+, Ca2+
y catiónicos como: TEA, TTX Cd2+, Cs+, valproato, 4AP, apamina y paxilina,
permitiéndonos descartar la participación de estos canales en IRIL.
Únicamente el Ba2+ afectó a la corriente provocando su inhibición de manera
significativa. Una de las características generales de los canales K2P es
precisamente su insensibilidad a bloqueantes clásicos de canales de K+, a
excepción del Ba2+. Se ha descrito el bloqueo por Ba2+ de todos los canales de la
subfamilia TREK (Bang et al., 2000;Fink et al., 1996;Fink et al., 1998), aunque
también está descrita la falta de efecto sobre TREK-1 y TREK-2 (Lesage et al.,
2000b;Meadows et al., 2000;Patel et al., 1998); esta controversia podría ser
debida a las diferentes concentraciones utilizadas por los distintos autores.
El cribado farmacológico de los moduladores específicos de canales K2P
sobre IRIL resultó difícil debido a la ausencia de activadores /bloqueantes
específicos, sin olvidar el reciente descubrimiento de estos canales.
El hecho de que la aplicación de Zn2+ provoque una activación de la
corriente activada por riluzol nos permite desechar la participación de TRAAK
en la corriente activada por riluzol ya que TREK-1 y TREK-2 son activados por
127
Discusión
Zn2+ (Czirjak and Enyedi, 2006;Kim et al., 2005) mientras que TRAAK es
inhibido (Czirjak and Enyedi, 2006). Además el resto de canales K2P o no se
ven afectadas por el Zn2+ o son inhibidas por el mismo (Clarke et al.,
2004;Czirjak and Enyedi, 2006;Reyes et al., 1998).
IRIL no se vio afectada por la quinina, esto podría sugerir una mayor
participación de TREK-1 en la corriente activada por riluzol, ya que está
descrita la falta de efecto sobre TREK-1 y TRAAK (Fink et al., 1996;Ozaita
and Vega-Saenz de Miera, 2002); sin embargo el efecto de la quinina sobre los
canales TREK es contradictorio ya que también existen datos refiriendo el
bloqueo de TREK-1 y TREK-2 (Kucheryavykh et al., 2009;Meadows et al.,
2000).
La fuerte inhibición de IRIL por fluoxetina corrobora la hipótesis de la
principal participación de TREK-1 y TREK-2 ya que TRAAK no se ve afectado
por dicho fármaco (Thümmler et al., 2007; Kang et al., 2008; Kennard et al.,
2005), mientras que TREK-1 y TREK-2 son fuertemente inhibidos (Kang et al.,
2008;Thümmler et al., 2007).
3. Modulación por pH intracelular
La acidificación intracelular provocó la activación de una corriente de salida,
corriente que es fuertemente inhibida mediante la aplicación de fluoxetina, este
resultado coincide con lo descrito para los canales TREK-1 (Maingret et al.,
1999b) y TREK-2 (Bang et al., 2000;Lesage et al., 2000b), mientras que
TRAAK es sensible a la alcalinización intracelular (Kim et al., 2001a) e
insensible a la acidificación intracelular (Fink et al., 1998). Este resultado apoya
una vez más la hipótesis de una expresión importante de TREK-1 y/o TREK-2
en las neuronas del GCS.
128
Discusión
4. Activación mecánica
Una de las características más representativas de todos los canales de la
subfamilia TREK es la mecanosensibilidad (Enyedi and Czirják, 2010;Lotshaw,
2007). La aplicación de una solución extracelular hipoosmótica provoca la
entrada de agua en la célula con el consecuente aumento de volumen celular
(Gomis et al., 2008;Patel et al., 1998); los registros realizados en presencia de
una solución extracelular hipoosmótica provocaron la activación de una
corriente que fue bloqueada por fluoxetina.
5. Ácido linoleico
Todos los miembros de la subfamilia TREK son activados por ácidos grasos
insaturados, la aplicación de ácido linoleico provocó la activación de una
corriente que fue bloqueada por fluoxetina, confirmando una vez más la
presencia de canales TREK en la membrana de las neuronas de GCS.
En resumen los resultados electrofisiológicos (activación bifásica mediante
riluzol, la facilitación por Zn2+, inhibición por fluoxetina y la falta de efecto de
la quinina sobre IRIL, la activación de una corriente de salida mediante
acidificación intracelular y la activación de una corriente de salida mediante el
incremento del volumen celular) indicaron la participación de TREK-1 y/o
TREK-2 en la corriente activada por riluzol. Sin embargo la caracterización
electrofisiológica/farmacológica no nos permitió distinguir completamente los
canales de la subfamilia TREK implicados ya que el perfil farmacológico y las
propiedades eléctricas de TREK-1 y TREK-2 son muy similares. Es importante
destacar que la caracterización farmacológica realizada en este trabajo nos
permitió observar el efecto de las diferentes drogas sobre los canales K2P en
una célula “real”, este hecho es importante ya que la mayoría de los estudios
realizados son llevados a cabo con canales expresados en sistemas heterólogos.
129
Discusión
6. Expresión de canales K2P en ganglio cervical superior
Los experimentos realizados mediante RT-PCR de GCS completo detectaron
la presencia de ARNm de los tres canales de la subfamilia TREK. Los resultados
de RT-PCR de célula individual también confirmaron la presencia de ARNm de
TREK-1, TREK-2 y TRAAK en las neuronas del GCS. Además el marcaje
mediante anticuerpos específicos confirmó la presencia de estos canales
específicamente en las neuronas ya que en las células satélites no se expresó
ninguno de ellos. Los datos electrofisiológicos sugerían la presencia
principalmente de TREK-1 y TREK-2, los datos obtenidos mediante qPCR
confirmaron la hipótesis anterior, siendo TREK-2 el canal principalmente
expresado en GCS seguido de TREK-1 y una baja expresión de TRAAK.
7. Registros de canal individual
Una de las maneras más efectivas para identificar la presencia de canales
iónicos funcionales en la membrana son los registros de canal individual. Tal
como era de esperar a la vista de los resultados de qRT-PCR, los registros de
canal individual demostraron la presencia principalmente (75%) de canales
TREK-2 en la membrana de las neuronas. La conductancia de este canal junto
con las características de su curva I/V con una marcada rectificación de entrada
fue acorde con lo publicado en otros trabajos para TREK-2 (Han et al.,
2003;Kang and Kim, 2006). Además la utilización de un activador como el
riluzol provocó un incremento en la probabilidad de apertura de dicho canal, sin
embargo el uso de un activador junto con un bloqueante de TREK-2 como la
fluoxetina inhibió el incremento en la probabilidad de apertura causado por el
activador.
En un 18.7% de los sellos se detectó la presencia de un canal con una
conductancia de 70.1±2.3 y 57.1±4.1 pS a - 60 y + 60 mV respectivamente, y
una débil rectificación en su curva I/V, estos valores son coincidentes con un
130
Discusión
canal denominado TREK-like en neuronas del núcleo supraóptico de rata (Han
et al., 2003).
Mediante el registro de canal individual no se detectó la presencia de canales
TRAAK, corroborando la hipótesis de que tal vez la expresión de este canal sea
muy débil y prácticamente no existan canales funcionales. Tampoco se pudieron
identificar mediante el registro en canal individual canales tipo TREK-1.
8. Papel fisiológico de los canales K2P
Una de las principales funciones que se le han atribuido a los canales K2P es
la estabilización del potencial de reposo en numerosos tipos neuronales (Fink et
al., 1996;Fink et al., 1998;Gruss et al., 2004b;Kim et al., 2005).
En las neuronas del GCS el bloqueo de los canales de la subfamilia TREK
generó una despolarización de la membrana, poniendo de manifiesto la
participación de los canales TREK en el mantenimiento del potencial de reposo.
Además el bloqueo de estos canales también generó una disminución de la
latencia del primer potencial de acción, por lo que estos canales no solo podrían
estar actuando a nivel del potencial de reposo sino también en la excitabilidad
atenuando/retrasando la respuesta a estímulos externos.
Una de las características de las neuronas del GCS es la adaptación, en
respuesta a un estímulo despolarizante prolongado responden generando solo
unos cuantos potenciales de acción, este fenómeno se debe a la existencia de la
corriente M en estas neuronas (Brown, 1988;Lamas et al., 2002;Romero et al.,
2004). Los canales TREK no parecen participar de un modo importante en el
mecanismo de adaptación ya que su bloqueo, no incrementó el número de
potenciales de acción de las neuronas.
Es importante señalar que como se comentó anteriormente en el
mantenimiento del potencial de reposo del GCS participan varias corrientes
tanto voltaje-dependientes como voltaje-independientes (corriente M , corriente
H, corriente sodio persistente, bomba Na+/K+ y una corriente de fuga de Cl- y
131
Discusión
Na+) (Lamas, 1998;Lamas et al., 2002;Lamas, 2005;Lamas et al., 2009;Romero
et al., 2004), los canales TREK serían un componente más del mecanismo de
regulación del potencial de reposo en estas neuronas, para conocer el papel
exacto de los canales TREK sobre el potencial de reposo y la excitabilidad sería
necesario el uso de un bloqueante específico.
La modulación de los canales TREK a través de una gran variedad de
neurotransmisores convierte a estos canales en reguladores de la excitabilidad.
Los canales TREK son inhibidos a través de receptores acoplados a proteínas
Gαq (Chemin et al., 2003;Kang et al., 2006;Lopes et al., 2005). El GCS es un
ganglio simpático que recibe una fuerte entrada colinérgica que activa
receptores muscarínicos acoplados a la proteína Gαq.(principalmente M1
(Marrion et al., 1989;Shapiro et al., 2001).
El incremento en la excitabilidad provocado por los agonistas muscarínicos
en el GCS se considera debido al bloqueo de la corriente M, aunque la presencia
de los canales TREK en el GCS y su posible regulación a través de receptores
muscarínicos (Kang et al., 2006) indican que también ellos podrían estar
implicados. Este aspecto está siendo investigado en nuestro laboratorio.
132
CONCLUSIONES
133
134
Conclusiones
CONCLUSIONES
1.- Las neuronas del ganglio cervical superior expresan una corriente de potasio
activada por riluzol.
2.-Las neuronas del ganglio cervical superior expresan mRNA y proteína para
los tres canales de la subfamilia TREK (TREK-1, TREK-2 y TRAAK). Aunque
cuantitativamente el mRNA para TREK-2 está mucho más expresado que los
otros dos.
3.- La expresión de los canales TREK en el GCS es exclusivamente neuronal y
no se expresan ni en fibroblastos ni en células satélite.
4.- Los experimentos de canal individual también demuestran que el canal
funcionalmente más expresado es TREK-2. Esto permite concluir que la
corriente activada por riluzol (IRIL) fluye principalmente a través de TREK-2.
5.- En el GCS los canales TREK-2 contribuyen al mantenimiento del potencial
de reposo e influye en el patrón de disparo evocado por estímulos eléctricos,
son por lo tanto un regulador importante de la excitabilidad de estas neuronas.
6.- En este trabajo se demuestra por primera vez la expresión de los canales
K2P (TREK-1, TREK-2 y TRAAK) en neuronas del SNA.
135
136
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155
156
ANEXO
157
158
Anexo
IUPHAR
HGNC
Kv1.1
Kcna1
Kv1.2
Kcna2
Kv1.3
Kcna3
Kv1.4
Kcna4
Kv1.5
Kcna5
Kv1.6
Kcna6
Kv1.7
Kcna7
Kv1.8
Kcna10
Kv2.1
Kcnb1
Kv2.2
Kcnb2
Kv3.1
Kcnc1
Kv3.2
Kcnc2
Kv3.3
Kcnc3
Kv3.4
Kcnc4
Kv4.1
Kcnd1
Kv4.2
Kcnd2
Kv4.3
Kcnd3
Kv5.1
Kcnf1
Kv6.1
Kcng1
Kv6.2
Kcng2
Kv6.3
Kcng3
Kv6.4
Kcng4
Kv7.1
Kcnq1
Kv7.2
Kcnq2
Kv7.3
Kcnq3
Kv7.4
Kcnq4
Kv7.5
Kcnq5
Kv8.1
Kcnv1
Kv8.2
Kcnv2
Kv9.1
Kcns1
Kv9.2
Kcns2
Kv9.3
Kcns3
Kv10.1
Kcnh1
Kv10.2
Kcnh5
Kv11.1
Kcnh2
Kv11.2
Kcnh6
Kv11.3
Kcnh7
Kv12.1
Kcnh8
Kv12.2
Kcnh3
Kv12.3
Kcnh4
Segmentos transmembrana
6TM. Voltaje-dependientes (Kv)
159
Anexo
IUPHAR
HGNC
Kir1.1
Kcnj1
Kir2.1
Kcnj2
Kir2.2
Kcnj12
Kir2.3
Kcnj4
Kir2.4
Kcnj14
Kir3.1
Kcnj3
Kir3.2
Kcnj6
Kir3.3
Kcnj9
Kir3.4
Kcnj5
Kir4.1
Kcnj10
Kir4.2
Kcnj15
Kir5.1
Kcnj16
Kir6.1
Kcnj8
Kir6.2
Kcnj11
Kir7.1
Kcnj13
KCa1.1
Kcnma1
KCa2.1
Kcnn1
KCa2.2
Kcnn2
KCa2.3
Kcnn3
KCa3.1
Kcnn4
KCa4.1
Kcnt1
KCa4.2
Kcnt2
KCa5.1
Kcnu1
K2P1.1
Kcnk1
K2P2.1
Kcnk2
K2P3.1
Kcnk3
K2P4.1
Kcnk4
K2P5.1
Kcnk5
K2P6.1
Kcnk6
K2P7.1
Kcnk7
K2P9.1
Kcnk9
K2P10.1
Kcnk10
K2P12.1
Kcnk12
K2P13.1
Kcnk13
K2P15.1
Kcnk15
K2P16.1
Kcnk16
Segmentos transmembrana
2TM. Rectificadores de entrada
(Kir)
6-7TM. Calcio-dependientes (KCa)
4TM. Doble dominio poro (K2P)
K2P17.1
K2P18.1
Kcnk18
Tabla 19: Clasificación de las diferentes familias de canales de K+ en
función de su estructura.
160