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DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
DE LACASAS Y LIGNINA PEROXIDASAS DE
HONGOS DEGRADADORES DE COLORANTES
SELECCIONADOS PARA EL TRATAMIENTO DE
AGUAS RESIDUALES DE LA INDUSTRIA TEXTIL
Directora: M.C. Alma Koch
Codirectora: Dra. Blanca Naranjo
Tesista: Maritza Gardenia Páez Llerena
INTRODUCCIÓN
Tratamientos:
Físicos
Químicos
Biológicos: efectivos
por la remoción de
sustancias tóxicas
Efluente industrial textil San Antonio de Pichincha
Valenzuela, 2012
En el año 2005 la industria textil
consumía 182.000 litros de agua
Diez mil colorantes y pigmentos
INTRODUCCIÓN
Valenzuela, 2012
(ESPE)
Manganeso Peroxidasas (MnP)
Lignina Peroxidasas (LiP)
Lacasas
LACASAS: multicobre oxidasas (pH 3.7-7.5)
LIGNINA PEROXIDASAS: hemo-férrico (pH menor o igual 3)
OBJETIVOS
Objetivo General:
Determinar la actividad enzimática de lacasas y lignina peroxidasas de hongos
degradadores de colorantes seleccionados para el tratamiento de aguas residuales de la
industria textil.
Objetivos Específicos:
 Determinar la actividad ligninolítica y celulolítica de los hongos seleccionados, mediante
una prueba cualitativa con guaiacol y una prueba semi-cuantitativa con agar
carboximetilcelulosa.
 Determinar la presencia de la enzima lacasa de los hongos degradadores de colorantes
mediante una prueba cualitativa utilizando medio con ABTS.
 Evaluar la efectividad de tres diferentes medios naturales para la producción de lacasas
y lignina peroxidasas de los hongos.
 Cuantificar la actividad enzimática de lacasas utilizando dos sustratos, ABTS y Otoluidina.
 Cuantificar la actividad enzimática de lignina peroxidasas utilizando como sustrato ABTS.
DISEÑO
Pruebas cualitativas y semi-cuantitativa (DCA)
HONGOS (VARIABLE
INDEPENDIENTE)
C20AL
C18BL
C7AL
C2BL
C1BA
VARIABLE DEPENDIENTE
 Prueba actividad ligninolítica: Crecimiento del hongo y cambio de
color del medio
 Prueba de presencia de enzima lacasa: cambio coloración del medio
 Prueba actividad celulolítica: diámetro del halo de hidrólisis de
celulosa
Pruebas cuantitativas (Arreglo factorial)
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LACASAS
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LIGNINA
PEROXIDASAS
5x3x2=30 con 3 repeticiones
5x3x1=15 con 3 repeticiones
5 hongos
5 hongos
3 medios naturales para la producción 3 medios naturales para la producción
de enzimas
de enzimas
2 sustratos
1 sustrato
MATERIALES Y MÉTODOS
Identificación macroscópica y
microscópica
Reactivación de las cepas
AEM + 500 mg.L-1 cloranfenicol
incubación una semana 28oC / 80% HR
PDB + clo incubación tres días a 30oC /
100 r.p.m.
frotis + KOH 0,1M
micelio + azul de lactofenol
Usanayo, 2007
Actividad ligninolítica con Guaiacol
AEM con diferentes concentraciones de
guaiacol. Incubación a 28oC / 80% HR
Actividad celulolítica en agar CMC
CMC incubación 72 h / 28oC . Luego 15 min 5 mL
rojo congo 1% / 15 min 5 mL NaCl 2M.
Refrigeración 12 h
En medio sólido: Crecimiento del hongo
y cambio de coloración del medio
Koduri & Ming, 2011
En medio sólido: Generación de Halos
de decoloración
Gaitán y Pérez, 2007; Valencia, 2009
MATERIALES Y MÉTODOS
Presencia de enzimas lacasas con ABTS
siembra por disco en medio con ABTS /
incubación 30oC / 80% HR
Evaluar la efectividad de tres diferentes
medios naturales para la producción de
enzimas
sal y concentración / incubación 30oC / 100
r.p.m / filtración
Cuantificar la enzima lacasa utilizando
dos sustratos ABTS y O-toluidina
En medio sólido: Cambio de
coloración del medio por oxidación del
sustrato
Córdoba, 2009
Kahraman & Gurdal, 2001
Castillo, 2004
Coronel et al., 2001
Castillo, 2004
ABTS: 420 nm y O- toluidina: 627 nm
Cuantificar la enzima lignina peroxidasa
con ABTS
ABTS: 420 nm
Castillo, 2004
Téllez, 2010
RESULTADOS
Características macroscópicas de los hongos seleccionados
MORFOLOGÍA
HONGOS
MACROSCÓPICA DEL
CRECIMIENTO
C1BA
Blanco algodonoso. Reverso
Género:
color rosado
Fusarium
Blanco algodonoso, ciertos
C18BL
Género:
Fusarium
lugares color rosa-salmón. Parte
posterior color rosa-salmón más
tenue.
FOTOGRAFÍA
Fotos Páez, 2011
RESULTADOS
Blanco no tan algodonoso.
C2BL
Género: Fusarium
Reverso color morado a rojizo.
Blanco y morado no tan
algodonoso. Reverso misma
C7AL
Género: Fusarium
coloración que la parte delantera.
C20AL
Consorcio con dos
Blanco algodonoso. Reverso
hongos ambos del
color morado claro.
Género: Fusarium
RESULTADOS
Características microscópicas de los hongos seleccionados
HONGOS
C1BA
Género: Fusarium
MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA
Conidias pequeñas. Hifas tabicadas. Clamidospora.
C18BL
Población integralmente de microconidias, muy pocas
Género: Fusarium
macroconidias. Hifas tabicadas. Conidióforo simple.
C2BL
Población rica en microconidias. Hifas tabicadas. Ausencia
Género: Fusarium
de conidióforos.
C7AL
Género: Fusarium
Macroconidias grandes y pequeñas unicelulares. Ausencia
clamidospora. Conidióforos unicelulares. Hifas tabicadas.
Ocasionalmente formación de rizomorfos.
C20AL
Consorcio con dos
Consorcio con dos hongos del género Fusarium diferencia
hongos ambos del
en el tamaño de esporas. Microconidas. Hifas tabicadas.
Género: Fusarium
Observación de clamidosporas
con azul de lactofenol
Foto Páez, 2011
RESULTADOS
Actividad ligninolítica en medio con guaiacol
Crecimiento del
hongo y cambio de
coloración del
medio
Fotos Páez, 2011
Visualización
microscópica a 40x de
los hongos
RESULTADOS
Actividad ligninolítica en medio con guaiacol
Inter-grupos
Intra-grupos
Total
Suma de
cuadrados
10,889
11,333
22,222
DUNCAN
gl
5
84
89
Media
cuadrática
2,178
0,135
F
Sig.
16,141
0,000
TRATAMIENTOS
N
3 mL.L-1 sin aserrín
3 mL.L-1 con aserrín
2 mL.L-1 sin aserrín
2 mL.L-1 con aserrín
1 mL.L-1 sin aserrín
1 mL.L-1 con aserrín
Sig.
15
15
15
15
15
15
ANOVA
Subconjunto para alfa = 0.05
2
3
1
0,1333
0,2000
0,4000
0,4000
0,6000
1,0000
1,0000
0,063
0,140
1,000
RESULTADOS
Actividad ligninolítica en medio con guaiacol
RESULTADOS
Actividad celulolítica en agar carboximetilcelulosa
Halo de hidrólisis de
celulosa
Fotos Páez, 2011
RESULTADOS
Actividad celulolítica en agar carboximetilcelulosa
Inter-grupos
Intra-grupos
Total
Suma de
cuadrados
3,536
11,320
14,856
gl
4
55
59
HSD de
Tukey(a)
TUKEY
Y
DUNCAN
Duncan(a)
Media
cuadrática
0,884
0,206
F
Sig.
4,295
0,004
Hongo
N
C1BA
C20AL
C2BL
C7AL
C18BL
Sig.
12
12
12
12
12
C1BA
C20AL
C2BL
C7AL
C18BL
Sig.
ANOVA
Subconjunto para alfa = 0.05
2
3
1
2,6583
2,6750
2,6750
2,8583
2,8583
2,8583
3,1833
3,1833
3,2250
0,816
0,060
0,289
12
2,6583
12
12
12
12
2,6750
2,8583
0,315
2,8583
3,1833
3,2250
0,066
RESULTADOS
Actividad celulolítica en agar carboximetilcelulosa
RESULTADOS
Presencia de la enzima lacasa en medio con ABTS
Cambio de coloración
del medio
Fotos Páez, 2011
RESULTADOS
Presencia de la enzima lacasa en medio con ABTS
Inter-grupos
Intra-grupos
Total
Suma de
cuadrados
0,667
2,667
3,333
TUKEY
Y
DUNCAN
gl
4
10
14
Media
cuadrática
0,167
0,267
HSD de
Tukey(a)
Duncan(a)
F
Sig.
0,625
0,655
ANOVA
Hongo
N
C7AL
C20AL
C18BL
C2BL
C1BA
Sig.
3
3
3
3
3
C7AL
C20AL
C18BL
C2BL
C1BA
Sig.
Subconjunto para
alfa = 0.05
1
0,3333
0,6667
0,6667
0,6667
1,0000
0,539
3
0,3333
3
3
3
3
0,6667
0,6667
0,6667
1,0000
0,176
RESULTADOS
Presencia de la enzima lacasa en medio con ABTS
RESULTADOS
Cuantificación de la enzima lacasa con dos sustratos ABTS y
O-toluidina
Midió U durante 40 días del
ensayo enzimático con
mediciones cada 4 días
 Una unidad (U) de actividad de
lacasas se define como la cantidad
de enzima capaz de oxidar 1 µmol
de ABTS, por minuto, a pH=5 y a
30oC.
 Una unidad (U) de actividad de
lacasas se define como la cantidad
de enzima capaz de oxidar 1 µmol
de O-toluidina, por minuto, a pH=3,7
y a 30oC.
RESULTADOS
Cuantificación de la enzima lacasa con dos sustratos ABTS y
O-toluidina
ANOVA
DÍA 16
Inter-grupos
Intra-grupos
Total
Suma de
cuadrados
799716,959
454103,872
1253820,831
gl
29
60
89
Media
cuadrática
27576,447
7568,398
F
Sig.
3,644
0,000
RESULTADOS
Cuantificación de la enzima lacasa con dos sustratos ABTS y
O-toluidina
DUNCAN
RESULTADOS
Cuantificación de la enzima lacasa con dos sustratos ABTS y
O-toluidina
RESULTADOS
Cuantificación de la enzima lignina peroxidasa utilizando como
sustrato el ABTS
Midió U durante 40 días del
ensayo enzimático con
mediciones cada 4 días
 Una unidad (U) de actividad
lignino peroxidásica se define como
la cantidad de enzima capaz de
oxidar 1 µmol de ABTS, por minuto,
a pH=3 y a 30oC.
RESULTADOS
Cuantificación de la enzima lignina peroxidasa utilizando como
sustrato el ABTS
Inter-grupos
Intra-grupos
Total
Suma de
cuadrados
34849,073
3652,438
38501,512
gl
14
30
44
Tratamiento
DUNCAN
ABTS.C18BL.M2
ABTS.C20AL.M1
ABTS.C7AL.M2
ABTS.C2BL.M1
ABTS.C20AL.M3
ABTS.C2BL.M2
ABTS.C7AL.M1
ABTS.C18BL.M1
ABTS.C2BL.M3
ABTS.C20AL.M2
ABTS.C18BL.M3
ABTS.C7AL.M3
ABTS.C1BA.M2
ABTS.C1BA.M1
ABTS.C1BA.M3
Sig.
Media
cuadrática
2489,220
121,748
N
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
3
2
102,513
102,513
105,820
119,047
121,252
F
Sig.
20,446
0,000
ANOVA
DÍA 16
Subconjunto para alfa = 0.05
3
4
5
6
105,820
119,047
121,252
123,456
124,559
119,047
121,252
123,456
124,559
132,275
134,479
136,684
139,991
1
121,252
123,456
124,559
132,275
134,479
136,684
139,991
141,093
167,548
168,650
0,071
0,071
0,052
0,066
0,903
210,537
1,000
RESULTADOS
Cuantificación de la enzima lignina peroxidasa utilizando como
sustrato el ABTS
RESULTADOS
Efectividad de tres diferentes medios naturales para la
producción de enzimas
Actividad enzimática
en dependencia del
medio
LACASAS
LIGNINA
PEROXIDASAS
Fotos Páez, 2011
RESULTADOS
Efectividad de tres diferentes medios naturales para la
producción de lacasas
MEDIO
M1
M2
M3
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LACASAS (U.L-1enz)
DÍA
4
8
12
16
20
24
28
32
36
40
119,45 156,80 114,85 111,76 83,97 60,22 69,79 54,15 52,47 8,95
Suma de
cuadrados
Inter-grupos 304643,938
Intra-grupos 348679,955
Total
653323,893
gl
2
87
89
Media
cuadrática
152321,969
4007,816
F
Sig.
38,006
0,000
ANOVA
RESULTADOS
Efectividad de tres diferentes medios naturales para la
producción de lacasas
MEDIO DE
PRODUCCIÓN
DE ENZIMAS
TUKEY
Y
DUNCAN
N
Subconjunto para alfa = 0.05
1
2
40,4321
HSD de
Tukey(a)
M2
30
30
30
Duncan(a)
M1
M3
Sig.
M2
M1
M3
Sig.
30
30
30
3
1
104,5988
1,000
40,4321
1,000
182,7160
1,000
104,5988
1,000
1,000
182,7160
1,000
RESULTADOS
Efectividad de tres diferentes medios naturales para la
producción de lacasas
RESULTADOS
Efectividad de tres diferentes medios naturales para la
producción de lignina peroxidasas
MEDIO
M1
M2
M3
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA LIGNINO PEROXIDASICA (U.L-1enz)
DÍA
4
8
12
16
20
24
28
32
36
40
150,57
76,71 92,37
Suma de
cuadrados
Inter-grupos 13249,082
Intra-grupos 382086,587
Total
395335,669
149,47 137,78 135,58 125,88 121,25 114,85 22,04
gl
2
87
89
Media
cuadrática
6624,541
4391,800
F
Sig.
1,508
0,227
ANOVA
RESULTADOS
Efectividad de tres diferentes medios naturales para la
producción de lignina peroxidasas
TUKEY
Y
DUNCAN
HSD de Tukey(a)
Duncan(a)
MEDIO DE
PRODUC CIÓN
DE ENZIMAS
M2
M1
M3
Sig.
M2
M1
M3
Sig.
N
30
30
30
30
30
30
Subconjunto para
alfa = 0.05
1
102,9541
121,3624
132,3649
0,204
102,9541
121,3624
132,3649
0,108
RESULTADOS
Efectividad de tres diferentes medios naturales para la
producción de lignina peroxidasas
CONCLUSIONES
 Los hongos estudiados pertenecen al género Fusarium.
 Los cinco hongos seleccionados presentaron actividad ligninolítica,
identificados por el crecimiento y cambio de coloración del medio por oxidación
del guaiacol.
 Los hongos estudiados presentaron actividad celulolítica (diámetro de halos de
aclaramiento). C18BL presentó la mejor actividad, mientras que C1BA mostró la
más baja.
 Los hongos expusieron presencia de lacasas en ABTS. C1BA expuso el mejor
resultado y C7AL , el menor.
 El mejor tratamiento de actividad enzimática de lacasas fue ABTS.C1BA.M3,
con 308,64 U.L-1enz al día 16.
El mejor tratamiento de cuantificación enzimática de lignina peroxidasas fue el
ABTS.C1BA.M3, con 210,53 U.L-1enz al día 16.
CONCLUSIONES
 La expresión enzimática de lacasas y de lignina peroxidasas alcanzó su valor
óptimo al día 16 de 40 días de ensayo.
Los hongos que presentaron menor actividad celulolítica son aquellos que más
actividad enzimática de lacasas y lignina peroxidasas expusieron.
 El medio natural de producción de enzimas M3 fue el más favorable para la
producción de lacasas y lignina peroxidasas.
RECOMENDACIONES
 Caracterizar los hongos por género y especie para optimizar condiciones de pH
y temperatura.
 Optimizar pH y temperatura de los dos sustratos utilizados, para incrementar la
producción de enzimas.
 Optimizar el medio de producción de enzimas con sales y producto
ligninocelulósicos de afinidad para los hongos.
 Determinar la actividad enzimática de manganeso peroxidasas y aplicar el
complejo enzimático ligninolítico para procesos de biorremediación.
Aplicar a nivel de laboratorio el uso de enzimas ligninolíticas en la degradación
de colorantes provenientes de la industria textil.
Diseñar un biorreactor, a escala semi-industrial o industrial, para aplicar las
propiedades fúngicas encontradas para la degradación de colorantes de la
industria textil.
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a las autoridades de la ESPE que permitieron el desarrollo de esta tesis
con el financiamiento
Proyecto de Investigación 2010 ESPE-CEINCI 014
¨SELECCIÓN DE HONGOS EFICIENTES EN LA BIODEGRADACIÓN DE MATERIA
ORGÁNICA Y COLORANTES REACTIVOS, TOLERANTES A METALES, PARA SU USO
EN BIORREMEDIACIÓN DE AGUAS RESIDUALES DE LA INDUSTRIA TEXTIL¨.
e instalaciones prestadas.
AGRADECIMIENTOS
A mi directora y codirectora de tesis M.C. Alma Koch y a la Dra. Blanca Naranjo por
su constante apoyo, al Ing. Abraham Oleas por impartirme un poco de su extenso
conocimiento. A la Ing. Erica Castillo y al Ing. Mauricio Moreno. A mis compañeros del
laboratorio y amigos. A todos muchas GRACIAS!!!
Y María Auxiliadora por todas las bendiciones recibidas y a mi familia por
acompañarme durante toda mi carrera.
GRACIAS!!!