Download BioRad Huella Genetica

Alianza para el Aprendizaje de Ciencias y Matemáticas (AlACiMa)
Huella Genética o “Fingerprinting”
Original de Essy Levy, M.S. y Julie Mathern
Huella genética
o
“Fingerprinting”
de ADN
Temas
Cubiertos
• Digestión de las muestras de ADN con
enzimas de restricción
• Introducción a la base teórica de Huella
Genética o “Fingerprinting” de ADN
• Electroforesis de geles de agarosa
• Análisis e interpretaciones de los
resultados
Aplicaciones al
mundo real de
Huella genética
o
“Fingerprinting”
de ADN
• Escena del crimen
• Relación entre humanos
• Paternidad
• Relación entre animales
• Estudios antropológicos
• Estudios de organismos que causan
enfermedades
• Identificación de alimentos
• Restos Humanos
• Monitoreo de transplantes
El kit de Huella
genética o
“Fingerprinting”
de ADN Forense
Puede ayudar a
enseñar:
• La estructura de ADN
• Análisis de patrones de restricción de ADN
• Electroforesis en gel de agarosa
• Determinación de tamaño
• Simulación de “Fingerprinting” de ADN
forense real
Huella
Genética
Resumen de los
Procedimientos
Huella
Genética
Procedimiento
Primera Parte
Huella
Genética
Procedimiento
Segunda Parte
Huella
Genética
Procedimiento
Tercera Parte
Equipo de
Electroforesis de
Agarosa
Bio-Rad
PowerPac™ Junior
PowerPac™ Basic
• Cubetas de
Electroforesis
• Fuentes de Electricidad
• Geles de agarosa
preparados
PowerPac™ HC
PowerPac™ Universal
Mini-Sub® Cell GT
PowerPac™ 3000
Wide Mini-Sub Cell GT
Los
Cromosomas
están
Compuestos
de ADN y
Proteínas
llamadas
Histonas.
El Estudio de
Cariotipo
Ayuda a
Identificar
Anormalidades
Genéticas
El ADN existe
enrollado
apretadamente
alrededor de
proteínas
llamadas
Histonas,
formando
estructuras
denominadas
cromosomas
que se
encuentran en
el núcleo.
Modelo del
ADN
El ADN está
compuesto de:
fosfatos,
azúcares de
cinco carbonos
llamadas
deoxirribosas,
y cuatro tipos de
bases
nitrogenadas
(adenina, timina,
citosina, guanina).
Ácido
Desoxirribonucleico
(ADN)
ADN
Representación
Esquemática
5’ fosfato
O
O P O
Base
O
CH2
O
Azúcar
Sólo se
muestra una
cadena de
ADN.
O
O P O
Base
O
CH2
O
Azúcar
OH
3’ hidróxido
Los Genes
consisten de
exones y de
intrones.
Los exones son
secuencias de
ADN que se
expresan en la
célula.
Los intrones
son secuencias
de ADN que no
se expresan en
la célula.
Los Intrones
son removidos
del ARN
durante el
proceso de
Transcripción
Enzimas de
Restricción Enzimas que
cortan ADN
• Evolucionadas por
bacterias para
protegerse contra
infecciones virales.
• Son endonucleasas,
cortan en el interior
de las hebras del
ADN.
• Se conocen más de
3,000 enzimas de
restricción.
virus
bacteria
Sitio de
Reconocimiento
de la Enzima de
Restricción
Sitio de restricción
Secuencia Palindrómica
• Cada enzima digiere
(corta) ADN en una
secuencia específica,
o sitio de restricción.
• Las enzimas
reconocen de 4 a 6
pares de bases
organizadas en
secuencias
palindrómicas
(Ej. GAATTC).
Fragmento 1
Fragmento 2
Extremos
Sobresalientes
5’ o 3’
• Algunas enzimas de
restricción generan
extremos
sobresalientes 5’
(cinco primo), como
la mostrada aquí.
• Otras enzimas de
restricción generan
extremos
sobresalientes 3’
(tres primo).
La enzima corta aquí
Enzimas de
Restricción
Comunes
• EcoRI – Enzima de
restricción que
genera extremos
sobresalientes 5’.
• PstI – Enzima de
restricción que
genera extremos
sobresalientes 3’.
EcoRI
– Eschericha coli
– Extremos
Sobresalientes 5’
Pstl
– Providencia stuartii
– Extremos
Sobresalientes 3’
Extremos
Parejos
AluI
• Existen otras
enzimas de
restricción que
generan extremos
parejos;
es decir, extremos
que no tienen
porciones
sobresalientes.
• Ejemplos:
AluI y HaeIII
– Arthrobacter luteus
– Extremos Parejos
HaeIII
– Haemophilus
aegyptius
– Extremos Parejos
Otros
Componentes
en la
Reacción de
la Digestión
del ADN
• Búfer Restricción permite las condiciones
óptimas para la reacción
• NaCI proporciona la concentración correcta de
iónes
• Tris-HCI proporciona el pH correcto
• Mg2+ es un co-factor enzimático
Temperatura
de la
Digestión
del ADN
¿Por qué incubamos a 37°C?
• La temperatura del cuerpo es la temperatura
óptima para éstas y otras enzimas.
¿Qué pasa si la temperatura de la reacción
es demasiado fría o demasiado caliente?
• Muy caliente: la enzima puede ser desnaturalizada.
• Muy fría: la actividad de la enzima puede ser más
lenta, requiriendo más tiempo para digerir el ADN.
Las muestras de ADN digeridas se guardarán en la
nevera para ser analizadas el día siguiente.
Asegúrese de que los pozos
están en el lado del polo (-).
Electroforesis
en Agarosa:
aplicando las
muestras
• Corriente Eléctrica
La corriente mueve el
ADN, que tiene una
carga negativa, hacia
el electrodo positivo
(+, rojo).
Búfer
Tinta
Gel de agarosa
Fuente de Poder
Electroforesis
en Agarosa:
corriendo las
muestras
• La gel de agarosa
separa los
fragmentos de ADN
por tamaño.
Los fragmentos más
pequeños se
mueven más rápido y
progresan más lejos
que los fragmentos
más grandes.
Corriendo la Gel
Fuente de Electricidad
Electroforesis
en Agarosa:
resultados
típicos
• La gel de agarosa
separa los
fragmentos de ADN
por tamaño.
Los fragmentos más
pequeños se
mueven más rápido y
progresan más lejos
que los fragmentos
más grandes.
Análisis de la
Gel Teñida
Determine los tamaños
de los fragmentos de
restricción.
• Cree una curva estándar
utilizando un marcador de
ADN.
• Mida la distancia (en mm)
recorrida por los
fragmentos de restricción.
• Determine los tamaños de
lo fragmentos de ADN.
Identifique la relación
entre las muestras.
Determinación
del Tamaño
Molecular
Distancia (mm)
23,000
11.0
9,400
13.0
6,500
15.0
4,400
18.0
100,000
Tamaño (pares de baes)
Tamaño (pb)
Curva Estándar de “Fingerprinting”: Semilogritmico
10,000
B
1,000
2,300
23.0
2,000
24.0
pb = pares de bases
mm = milímetros
100
0
5
10
15
20
Distancia (mm)
A
25
30
“Fingerprinting
” de ADN
Extensiones a
la práctica de
laboratorio
• Estudios Independientes
• Aislamiento del plásmido de (mini-preps)
• La cartografía de un plásmido utilizando las
enzimas de restricción
• Análisis por “Southern blot”
• Prácticas de introducción a la
electroforesis:
Kool-Aid/FastBlast
Indicador de pH en un búfer