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Tema 6. De la genética directa a la genética
reversa, TILLING
Con la generalización del uso de técnicas de biología molecular
y la finalización de un buen número de proyectos genoma, el
número de secuencias génicas disponibles excede en ordenes de
magnitud el número de genes con función biológica conocida.
La genética reversa pretende llenar ese vacío mediante técnicas
que permitan caracterizar funcionalmente un gran número de
genes. Para ello se deben producir individuos en los que la
actividad de genes concretos haya sido alterada.
Comparada con la genética clásica, la genética reversa
frecuentemente implica el uso de tecnologías sofisticadas para
manipular la expresión génica (por ejemplo transgénesis), lo
cual hace que sea de difícil aplicación en organismos no-modelo
Tema 6. De la genética directa a la genética
reversa, TILLING
La técnica de Tilling permite el screening eficaz de colecciones
mutagenizadas por EMS (que pueden producirse en cualquier
organismo de forma sencilla), para localizar líneas
Targeting
Induced
Lesions
IN Genomes (TILLING) for Plant
mutagenizadas
enLocal
los genes
de elección
Functional Genomics. Claire M. McCallum, Luca Comai, Elizabeth A.
Greene, and Steven Henikoff. Plant Physiology, 2000, Vol. 123, pp. 439–
442.
High-Throughput Screening for Induced Point Mutations. Trenton
Colbert, Bradley J. Till, Rachel Tompa, Steve Reynolds, Michael N.
Steine, Anthony T. Yeung. Claire M. McCallum, Luca Comai, and
Steven Henikoff. Plant Physiology, 2001, Vol. 126, pp. 480–484.
SINGLE-NUCLEOTIDE MUTATIONS FOR PLANT FUNCTIONAL
GENOMICS. Steven Henikoff and Luca Comai. Annu. Rev. Plant Biol
2003. 54:375–401.
De la genética directa a la genética reversa,
TILLING
De la genética directa a la genética reversa,
TILLING
Se han adaptado tres métodos (tomados
algunos del análisis de SNPs) para la
detección de estos híbridos:
Secuenciación
D-HPLC
Digestión con Cel-I/gel
El factor de pooling debe ser
seleccionado para minimizar el
número de ensayos necesarios
para localizar una mutación
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TILLING
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IR Dye 800
IR Dye 700
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Pools
Individuals, 8x
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Una vez identificadas las líneas candidatas, el análisis
molecular determinará el efecto de la mutación sobre la
proteína.
Comienza a continuación el análisis fenotípico.
Es esencial poder distinguir efectos causados por la
mutación en nuestro gen de efectos fenotípicos causados
por mutaciones en genes no relacionados (mutación de
fondo)
En principio, si la planta M2 era heterocigota, la cosegregación mutación fenotipo hace prácticamente
imposible errar en la asignación del gen causal. El
genotipado de descendientes tampoco es una cuestión
trivial (secuenciación, Cel-I, dCAPS, SNAPs...)
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Alternativamente, el cruzamiento entre distintos alelos
mutantes de nuestro gen convierte a todas las demás
mutaciones de fondo en heterocigotas
De la genética directa a la genética reversa,
TILLING
De la genética directa a la genética reversa,
TILLING
No todas las mutaciones causadas por EMS en nuestro gen
favorito producirán fenotipos útiles.
En principio incluso mutaciones en promotores son
potencialmente interesantes.
Preferiríamos, sin embargo, centrar nuestros esfuerzos de
screening en la localización de individuos portadores de
mutaciones que causen sustituciones de aa, codones de
paro, etc.
La página Coddle facilita la selección de primers y regiones
génicas que explorar.
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http://www.proweb.org/coddle/