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Inducción de proteína recombinante
b-Lactamasa
Tecnología de DNA recombinante: Herramientas
1 Aislamiento del gen
2. Clonación y
expresión
Producción de la
proteína
Transcriptasa reversa
Enzimas de restricción
Célula huésped
DNA polimerasa
Ligasa
Clones
Sonda de DNA
Véctor
Medio de cultivo
Inducción de proteínas recombinantes
Las proteínas recombinantes son aquellas que obtenemos a partir
de una especie o una línea celular distinta a la célula original.
La proteína se obtiene por la expresión de un gen clonado en esa
línea celular que nos interesa.
Ventajas de expresar proteínas recombinantes en bacterias:
fácil de cultivar
fácil de modificar genéticamente
trabajo rápido
alto rendimiento 80%
Expresar un gen de eucariontes en bacteria.....
conformación
modificaciones postraduccionales
.... depende de la complejidad de la proteína
Sistemas biológicos de producción de PR
• Bacterias
– E. coli
– B. subtilis
• Células eucariontes
– Hongos
• Levaduras
– Saccharomyces cerevisiae
– Pichia pastoris y otros metilotróficos
• Hongos filamentosos
– Células animales en cultivo
– Células de insecto en cultivo
– Plantas
Maximizar la expresión
de proteínas
codificadas por genes
clonados
Clonación del
DNA
•DNA foráneo (secuencia
que se desea clonar)
•Vector de clonación
(vehículo)
Vector
híbrido o
recombinante
•Organismo huésped
(E. coli)
•Selección de vectores
5
Vector de clonación pET-24a(+)
7200 bp
• Un gene siempre
tiene que ir
flanqueado por una
zona promotora y
otra terminadora de
la transcripción
El sistema de expresión también debe tener las
siguientes características:
Cromosoma de Escherichia coli
• El inductor del operón lac que utilizaremos
será el isopropiltiogalactósido (IPTG).
Análogos de la lactosa
COMPOSICIÓN.
a) Genes estructurales (en tándem).
• gen lac z codifica para la β-galactosidasa
• el gen lac y que codifica para la permeasa de galactosido.
• el gen lac a, codifica para la acetiltransferasa de tiogalactósido.
b)Promotor
Sitio donde la polimerasa de RNA se une al DNA
antes del inicio de la transcripción.
C) Operador
• Se localiza en traslape con el promotor , sirve
como el sitio de unión para una proteína, que
se conoce como represor.
d) Gen Regulador.
• El gen regulador puede estar cerca o lejos de los genes que están
siendo regulados. El gen regulador codifica para una proteína
específica, un producto denominado REPRESOR.
Procedimiento de proteína
recombinante
• Tomar 2.5 mL de precultivo de E. coli transformado con
vector, añadir a 15 mL de LB
• Incubar con agitación a 37 ͦC hasta OD600 0.6-0.8
• Tomar T0 (1 mL) e inducir con IPTG 1 mM (final)
• Seguir incubando y tomar alícuotas (1 mL) cada 30 min
por 2 h.
• Tomar 15 µL y mezclar con 10 µL de BC, desnaturalizar
y correr en SDS-PAGE.
Peculiaridades de la cosntrucción:
• En el vector pET-TEM se insertaron los genes
que codifican para dos proteínas:
• 1) β-lactamasa
• 2) OmpA Proteína de tránsito que se inserta
en la membrana externa de las bacterias. (Pag
43 del manual)
• Por lo tanto: no se requiere la extracción de la
β-lactamasa, esta será secretada al medio
Purificación de la proteína recombinante
RESULTADOS DEL SEMESTRE PASADO
30
60 90 120
30
60
90 120 min