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Secuenciación
Estrategia general

Degradación específica y
fraccionamiento de polinucleótidos de
interés a fragmentos pequeños
secuenciables.

Secuenciación de fragmentos
individuales.

Ordenamiento de los fragmentos por
repetición de los pasos anteriores.
Secuenciación Tipo Sanger

El método de secuenciación de Sanger aprovecha
la forma normal de la replicación del DNA
 Para extender la cadena de DNA, usando la DNA
polimerasa, deberá estar presente un grupo
hidroxilo en el carbono 3’ de la deoxiribosa
 Los fragmentos se generan al agregar pequeñas
cantidades de 2’ 3’ dideoxinucleótidos a la
reacción lo que interrumpe la polimerización cada
vez que son incorporados en la cadena de DNA
 La polimerasa usada deberá de carecer de la
actividad de la exonucleasa de corrección 3’ > 5’
para que funcione el método
Dideoxinucleótidos


2’-deoxinucleótido
monofosfato
La secuenciación de DNA usando el
método de Sanger emplea 2’3’OH
Fosfato
dideoxinucleótidos trifosfatados
NH2
HO P
O
ademas de los normales 2’Base
N
deoxinucleótido trifosfatado
N
O
Ya que los 2’3’-dideoxinucleótidos
N
N
5’CH2
trifosfato carecen del grupo 3’
O
hidroxilo, y la polimerización del
4’
1’
DNA ocurre solo en la dirección 5’3’ Azucar
2’
3’, cada vez que un 2’3’dideoxinucleótido trifosfato es
OH
H
H
incorporado la extención se detiene.
2’3’-dideoxinucleótido
monofosfato
OH
P
HO
N
O
N
N
O
OH
O
N
CH2
O
H
O
HO
P
O
O
N
O
CH2
OH
H
H
NH
N
O
OH
P
O
NH2
N
O
CH2
O
H
O
H
H2O
N
O
CH2
N
O
O
O
CH2
O
P
HO
H
O
OH
HO
P
NH2
HO
P
O
H
O
HO
O
Los 2’3’
dideoxinucleótidos
terminan
la síntesis
del DNA
O
CH2
H
NH2
Se utilizan 4 tubos
con distintas mezclas
de reacción, cada uno
con un solo ddNTP.
Se producen una serie
de moléculas de ADN
de diferente longitud
que terminan todas
en el mismo
nucleótido, marcadas
todas
radiactivamente por
el extremo 5' .
Sanger
(Método de terminación de cadena)
Se necesitan:





ssDNA como molde.
DNApol I del fago T4.
Primer (20 nt) por lo general marcado.
dATP, dCTP, dGTP y dTTP
ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP
Dye-Terminator
Single Molecule Real Time Sequencing (SMRT)

Esta técnica utiliza la cámara nanofotónica ZMW
(Zero-mode waveguide).

Una DNApol se fija al fondo de ésta cámara junto con
1 sola molécula de ssDNA como molde.


Cada base posee un marcador fluorescente
(fluoróforo) diferente en su fosfato terminal.
Cuando se incorpora un nucleótido se libera el fosfato
marcado el cual difunde fuera del área de registro de
la cámara.

La cámara permite observar la incorporación de un
solo nucleótido por la DNApol.

Un detector registra la señal fluorescente y un
software determina la base incorporada.
Otros métodos de secuenciación

La secuenciación por hibridación es un
método no enzimático que usa un chip de
DNA. En este método, un único reservorio de
DNA se marca mediante fluorescencia y se
hibrida con un colección de secuencias
conocidas.

La espectrometría de masas también se
puede usar para secuenciar las moléculas de
DNA; las reacciones convencionales de
terminación de la cadena producen moléculas
de DNA de diferentes longitudes y la longitud
de esos fragmentos se determina entonces
por las diferencias de masa entre ellas (en
lugar de utilizar una separación por gel).
Pyrosequencing
Un primer se hibrida con ssDNA y se
incuban con:
DNApol
 ATP sulfurilasa
 Luciferasa
 Apirasa
 Sustratos, APS y luciferina

La adición de nucleótidos es llevado a cabo
de a uno a la vez.
Cada señal es proporcional al número
de nucleótidos incorporados.
En lugar de ATP se utiliza dATPα S
(desoxiadenosina alfa-tio trifosfato)
para que no interfiera con la reacción
catalizada por la luciferasa.
Cuando la degradación se
completa, se agrega un dNTP
diferente.
A medida que el proceso continua, se sintetiza la
cadena complementaria y la secuencia de
nucleótidos es determinada por los picos
registrados en un pirograma.