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Animales transgénicos y “knock out”
para el
estudio del cáncer
Dr. Javier Santos
Dpto. Biología. Fac. Ciencias. Universidad Autónoma de
Madrid
Bases genéticas del cáncer:
mutaciones y/o modificaciones epigenéticas en
proto-oncogenes y genes supresores de tumores
Los proto-oncogenes promueven el crecimiento y la proliferación celular, o
inhiben la muerte celular (apoptosis). Su activación como oncogenes se
produce por sobre-expresión o por mutaciones de “ganancia de función”, y se
comportan como genes autosómicos dominantes.
Los genes supresores (GSTs) tendrían un efecto contrario, y su participación
en el desarrollo tumoral se debe generalmente a la inactivación de los dos
alelos (carácter recesivo). Las mutaciones o modificaciones epigenéticas que
los implican en la tumorogénesis son de “pérdida de función”. También se
podrían incluir aquí los genes que controlan la reparación del daño genético.
Predisposición genética al cáncer
El ratón: un modelo excelente para el estudio de la genética al cáncer
Cepas de ratón genéticamente uniformes
 Protocolos de inducción de tumores contrastados
 Reproducibilidad en el desarrollo de tumores específicos
 Disponibilidad de cepas de ratón que difieren en su sensibilidad
al desarrollo de tumores específicos
 El desarrollo tumoral en el ratón sigue un proceso multifásico
similar al de los tumores humanos
 Equivalencia entre regiones ortólogas del genoma de ratón y
el humano
 Genoma susceptible de manipulación genética
Manipulación Genética en el Ratón y su
Aplicación al Estudio del Cáncer
Ratones TRANSGENICOS que SOBRE-EXPRESAN
ONCOGENES
Ratones con MUTACIONES INACTIVANTES
(mutaciones knock-out) en GSTs
(ratones KNOCK-OUT)
Construcción de Ratones Transgénicos
Construcción de Ratones Transgénicos
Construcción de Ratones Transgénicos
Efectos no deseados del transgén:
Inactivación del transgén debido al
lugar de integración (efectos de
posición).
Mutagénesis
transgén
por
inserción
del
Los Efectos de Posición del Transgén se Minimizan
Utilizando Cromosomas Artificiales de Levaduras
(YACs) como Vectores de Transgénesis
VENTAJAS
Inclusión de todas las secuencias
reguladoras necesarias para la
expresión correcta del transgén
INCONVENIENTES
No evita totalmente la integración
del transgén en el genoma huésped
con el riesgo asociado de mutación
por inserción
Ratones con Transgenes de Integración controlada
La mutagénesis por inserción
se puede controlar utilizando como vectores de transgénesis
Cromosomas Artificiales de Mamíferos (MACs)
Ratones con transgenes de expresión tisular
CSP
GOI
CSP: Promotor específico de tejido
GOI: Gen de interés
Ratones con transgenes inducibles
Impacto de la expresión oncogénica durante diferentes
etapas del desarrollo
ANÁLISIS
Requerimientos necesarios para una actividad oncogénica
sostenida
Ratones con transgenes inducibles
Psp
tetR
tTA
tetO
VP16
Psp
tetO
tetR
Pmin
tTA
Pmin
X
VP16
X
Psp: promotor específico de tejido
tTA: proteína de fusión compuesta por el represor del operón tetraciclina (t) y la
parte C terminal de la proteína 16 del virus del herpes (activador transcripcional) (TA)
Pmin: promotor del citomegalovirus humano
Ratones con transgenes inducibles
tTA
Psp
tetR
-dox
+dox
tetO
Pmin
dox: doxiciclina (análogo de la tetraciclina)
VP16
X
tetO
Pmin
X
Ratones con transgenes inducibles
tTA
Psp
tetR
-dox
+dox
tetO
Pmin
VP16
tetO
X
Pmin
X
Pmin
X
rtTA
Psp
rtetR
-dox
+dox
tetO
Pmin
VP16
X
rtetR: proteína tetR con cuatro cambios aminoacídicos
tetO
Ratones con mutaciones diseñadas “ad hoc”
Su construcción se basa en la RECOMBINACIÓN entre una
MOLÉCULA de ADN portadora de la MUTACIÓN y su
SECUENCIA HOMÓLOGA en el ADN genómico de las CÉLULAS
CULTIVADAS IN VITRO
Células embrionarias primordiales (células ES, del inglés Embryonic Stem)
Las células ES mantienen INDEFINIDAMENTE sus características
de PLURIPOTENCIA y ESTADO INDIFERENCIADO durante su
crecimiento
Fabricación de Ratones “Knock-out”
Ratones K O:
individuos que
tienen inactivado
un gen (mutación K O)
en todas sus células
Fabricación de ratones “Knock-out”
Fabricación de ratones “Knock-out”
Inactivación génica condicional con el sistema Cre-loxP
Cuando la falta de función del gen compromete la viabilidad del animal
en una etapa temprana, resulta imposible estudiar su papel en otros
procesos durante etapas más tardías
Necesidad de inducir la mutación KO en el tejido, organo o momento deseado
Inactivación génica condicional con el sistema Cre-loxP
Ratones “knock-in”
Una modificación “knock-in” consiste en la incorporación de una
SECUENCIA CODIFICANTE al mensaje del gen a modificar
Incorporación mediante
FUSIÓN al MARCO de LECTURA
ENDÓGENO utilizando el ATG
del gen modificado
Incorporación mediante
la INTRODUCCIÓN de un
ELEMENTO IRES (Internal
Ribosomal Entry Site)
Incorporación mediante INSERCIÓN
en las parte 5’ NO TRADUCIDA DEL
MENSAJE utilizando un nuevoATG
introducido
“Knock-in” de Sustitución
endógeno
5’-UTR
3’-UTR
P
Ex 1
Ex 2
Gen endógeno
Ex 3
exógeno
P
1
endógeno
Gen exógeno
Neo-r 1
Ex 2
Ex 3
Neo-r 1
Ex 2
Ex 3
Transcripción
P
1
Gen exógeno
El gen endógeno se inactiva por inserción del exógeno
que es entonces expresado
TK
Vector “knock-in”
“Knock-in” de Adición
endógeno
5’-UTR
3’-UTR
P
Ex 1
Ex 2
Gen endógeno
Ex 3
exógeno
P
Gen exógeno
endógeno
P
Neo-r
Ex 1
Ex 2
Ex 3
Transcripción
Gen exógeno
Neo-r
Ex 1
Ex 2
Ex 3
El gen exógeno se expresa conjuntamente con el endógeno
TK
Vector “knock-in”
Estrategia para la búsqueda de genes modificadores de
tumores
1. Identificar un locus modificador de tumor por análisis de
ligamiento (ratones consómicos)
2. Refinar la región (0.5 -1 cM = 1-2 Mb) para facilitar el
clonaje del gen modificador (ratones congénicos)
3. Identificar genes candidatos en la región donde se localiza
el locus modificador
4. Identificar polimorfismos funcionales en el gen candidato
5. Demostrar in vivo que el gen candidato lo es con ratones
transgénicos “knock-in”
Ratones consómicos
X
Strain B: C57BL/6
(Tumor-Sensitive)
Strain A: Mus spretus
(Tumor-Resistant)
F1 hybrid: (Mus spretus x C57BL/6J) F1
(Tumor-Resistant)
Successive backcrosses and/or subsequent intercrosses
1.75 Gy/dose x 4 weeks
+
19 Chr B
1.75 Gy/dose x 4 weeks
or
Chr 2 A
Sensitive
1.75 Gy/dose x 4 weeks
+
19 Chr B
or
Chr 10 A
Sensitive
+
19 Chr B
or
Chr 19 A
Resistant
Ratones congénicos
Mus spretus
D19Mit41-D19Mit60-D19Mit30-D19Mit39
chromosome interval
+
19 Chr
C57BL/6J
Chr 19
Inducción
del
tumor
Análisis
de la
incidencia de tumores
Consómicos en fondo “knock-out”: una herramienta muy útil
para buscar
modificadores de genes supresores de tumores inactivados
X
Cepa B: sensible
(Fenotipo KO)
Cepa A: resistente
Retrocruzamientos sucesivos e intercruce final
Inducción
del
tumor
+
KO
Cr B
+
18
Cr B
19 Cr B
Cr 19
A